Einem Mausmodell für Pathogen-induzierten chronischen Entzündung an lokalen und systemischen Seiten

Zusammenfassung

Tiermodellen erwiesen haben wertvolle Werkzeuge bei der Definition von Wirt und Pathogen-spezifische Mechanismen, die zur Entstehung der chronischen Entzündung beitragen. Hier beschreiben wir ein Mausmodell der oralen Infektion mit dem menschlichen Erreger Porphyromonas gingivalis und Detail Methoden, um das Fortschreiten der Entzündung an lokalen und systemischen Websites zu beurteilen.

Zusammenfassung

Die chronische Entzündung ist ein wichtiger Motor der pathologischen Gewebeschäden und einigendes Merkmal vieler chronischer Erkrankungen bei Menschen mit Tumor, Autoimmun und chronisch-entzündlichen Erkrankungen. Schwellen Beweise bringen pathogen-induzierte chronische Entzündung in der Entwicklung und Progression von chronischen Erkrankungen, die mit einer Vielzahl von klinischen Manifestationen. Aufgrund der komplexen und multifaktoriellen Ätiologie der chronischen Erkrankung, Gestaltung Experimente zum Nachweis der Kausalität und der Gründung der mechanistischen Links ist beim Menschen fast unmöglich. Ein Vorteil der Verwendung von Tiermodellen ist, dass sowohl genetische und Umweltfaktoren, die den Verlauf einer Erkrankung beeinflussen kann gesteuert werden kann. So Gestaltung relevanten Tiermodellen der Infektion stellt einen wichtigen Schritt bei der Identifizierung von Wirt und Pathogen spezifischen Mechanismen, die zu einer chronischen Entzündung beitragen.

Hier haben wir ein Mausmodell der pathogen-induzierten chronischen Inflation beschreibenmmation bei lokalen und systemischen Websites nach der Infektion mit dem Erreger oral Porphyromonas gingivalis, ein Bakterium eng mit menschlichen parodontalen Erkrankung. Orale Infektion von spezifischen Pathogen-freien Mäuse induziert eine lokale Entzündungsreaktion, was zu Zerstörung des Zahnhalte Alveolarknochen, ein Markenzeichen der Parodontitis. In einem etablierten Mausmodell der Atherosklerose, eine Infektion mit P. gingivalis beschleunigt entzündlichen Plaqueablagerung im Aortensinus und Truncus, begleitet von der Aktivierung des vaskulären Endothels, eine erhöhte Immunzelle Infiltrat und erhöhte Expression von inflammatorischen Mediatoren innerhalb Läsionen. Wir Detail Methoden für die Beurteilung der Entzündung an lokalen und systemischen Seiten. Die Verwendung von transgenen Mäusen und definiert bakteriellen Mutanten macht dieses Modell besonders geeignet für die Identifizierung sowohl Host-und mikrobielle Faktoren in der Initiation, Progression, und das Ergebnis der Krankheit beteiligt. Additionally, kann das Modell verwendet werden, um neue therapeutische Strategien, einschließlich Impfung und pharmakologische Intervention zu screenen.

Einleitung

Die chronische Entzündung ist ein wichtiger Motor der pathologischen Gewebeschäden und einigendes Merkmal vieler chronischer Erkrankungen beim Menschen. Zu diesen Krankheiten zählen Tumor, Autoimmun und chronisch-entzündlichen Erkrankungen ^1. Die Ätiologie von vielen chronischen Erkrankungen, bleibt unklar, aber versteht komplex und multifaktoriell, die sowohl genetische Veranlagung und die Einführung von Umweltfaktoren. Während die perpetuators der Entzündung bleiben schwer zu fassen, die zellulären und molekularen Profile der Immunaktivierung überschneiden sich mit denen in Host-Reaktionen auf Krankheitserreger ² beobachteten Muster.

Anzeichen dafür, impliziert Infektion mit mikrobiellen Krankheitserregern in der Entwicklung und Progression der chronischen Entzündung und seine vielfältigen klinischen Manifestationen ^2,3. Erreger können zu induzieren und aufrechtzuerhalten chronische Entzündung direkt untergraben das Immunsystem des Wirts und zur Errichtung persistierende Infektionen ^{4. In Abwesenheit von mikrobiellen Beständigkeit kann die Infektion eine chronische Entzündung von Autoimmunreaktionen durch molekulare Mimikry Selbstantigene ausgelöst wird, Änderungen in Selbst-Antigene, die sie immunogen zu machen, oder eine Beschädigung, die vorher maskiert Wirtsantigene frei auszufällen. Selten jedoch haben spezifische Krankheitserreger als die universelle Ursache für eine bestimmte chronische Krankheit identifiziert worden. Vielmehr ist die Mehrheit der verfügbaren Daten deuten darauf hin, dass Krankheitserreger nutzen verschiedene Mechanismen zu einer chronischen Entzündung mit einem breiten Spektrum der klinischen Manifestationen und Krankheitsverläufe in der genetisch anfälligen Wirts 3 zu entlocken. Somit ist ein detailliertes Verständnis der Mechanismen, durch die bestimmte Krankheitserreger induzieren chronische Entzündung kann erhebliche Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit, sowie die Behandlung und Prävention von vielen chronischen Krankheiten.}

Obwohl die Wirt und Pathogen spezifischen Mechanismen, die zur Induktion und Aufrechterhaltung der chronischen Entzündungschlecht verstanden, Fortschritte in der Modellierung der Pathogen-induzierte chronische Entzündung begonnen haben unser Verständnis dieser Prozesse weiter. Die P. gingivalis orale Infektionsmodell ist ein einzigartiges, gut charakterisierten Mausmodell der Erreger-induzierte chronische Entzündung, die die Analyse von Wirt und Pathogen spezifische Mechanismen für chronische Entzündung an lokale (orale Knochenschwund) und systemischer Websites (Arteriosklerose) ^5,6 ermöglicht.

P. gingivalis ist ein Gram-negative anaerobe Erreger im menschlichen Mund Parodontitis, einer Infektion getriebenen chronische entzündliche Erkrankung, die durch die Zerstörung des Zahnhalteapparates ⁷ gebracht. Neben der Pathologie an der ersten Stelle der Infektion, sammeln Beweise bringen P. gingivalis-induzierte chronische Entzündung in der Entwicklung und Progression von systemischen Erkrankungen, einschließlich Atherosklerose ^5, eine Krankheit, die durch chronische inflammation der arteriellen Gefäßwand. Orale Infektion von spezifischen Pathogen-freien Mäuse mit P. gingivalis induziert eine lokale Entzündungsreaktion, die zur Zerstörung der Zahn führt Unterstützung Alveolarknochen ^8. P. gingivalis kann aus dem Mund von infizierten Mäusen bis zu 42 Tage nach der Infektion ⁸ und Mäuse entwickeln ein hohes Maß an Pathogen-spezifische Serum-Antikörper-Titer ⁹ gewonnen werden. In einem etablierten Mausmodell der Atherosklerose mit Apolipoprotein-E ^{- / -} Mäusen (ApoE ^{- / -),} orale Infektion mit P. gingivalis induziert eine chronische Entzündung, die entzündliche Plaqueablagerung innerhalb des Aortensinus ¹⁰ und der Truncus ¹¹ antreibt. Progressive Entzündung im Truncus von P. gingivalis infizierten Mäuse können in lebenden Tieren unter Verwendung von in-vivo-MRT überwacht werden. Histologisch, arterielle Läsionen von P. gingivalis infizierten Mäusen eine erhöhte Akkumulation von Lipiden beglauNied durch Aktivierung der vaskulären Endothel, eine erhöhte Immunzelle Infiltrat und erhöhte Expression von inflammatorischen Mediatoren ^12. Verwendung dieses Modells in Knockout-Mäusen hat die Rolle des Host-Signalisierung Komponenten und Entzündungsmediatoren, sowie die zellspezifische Interaktionen, die P. fahren aufgeklärt gingivalis induzierte Immunpathologie ^12-14. Zusätzlich wurden Experimente unter Verwendung von definierten bakteriellen Mutanten identifiziert kritische P. gingivalis Virulenz Faktoren, die zu einer chronischen Entzündung an lokalen und systemischen Websites ^15.

Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Bewertung von P. gingivalis induzierte chronische Entzündung an lokalen und systemischen Seiten. Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Analyse der alveolären Knochenverlust durch microCT mit Amira Software. Zusätzlich definieren wir die Nützlichkeit Serien in vivo lebenden Tier MRI für die Beurteilung der progressivEntzündung im Truncus. Wir sind Methoden für die Visualisierung und Quantifizierung von entzündlichen Plaque in Arterien-Läsionen und beschreiben ihre histologische Charakterisierung. Die Verwendung von transgenen Mäusen und definiert bakteriellen Mutanten macht dieses Modell besonders geeignet für die Identifizierung sowohl Host-und mikrobielle Faktoren in der Initiation, Progression, und das Ergebnis der Krankheit beteiligt. Zusätzlich kann das Modell verwendet werden, um neue therapeutische Strategien, einschließlich der Impfung und pharmakologische Intervention zu screenen.

Protokoll

1. Wachstum und Kultivierung von Bakterien

1. Streak froren Bestände von P. gingivalis 381 auf anaeroben Blut-Agar-Platten und Inkubation für 3 - 5 Tage in einer anaeroben Kammer (10% H _2/10% CO _2/80% N ₂₎ bei 37 ° C aufweist.
2. Mithilfe der Platte gewachsenen Organismen zu 5 ml Flüssigkulturen anzuimpfen Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI) mit Hefeextrakt (0,5%), Hemin (10 ug / ml) und Menadion (1 ug / ml) ergänzt. Nach O / N Wachstum, übertragen Sie die 5-ml-Kulturen in 45 ml BHI.
3. Flüssigkulturen anaerob bebrüten die 50 ml für eine additional18 - 24 h und bei der Ernte Mitte bis Ende der log-Phase. HINWEIS Reinheit der Kultur sollte immer durch Gram-Färbung vor der Einführung Bakterien in Tieren nachgewiesen werden.
4. Ernte der Bakterien durch Zentrifugation bei 7.000 × g für 10 min. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren gründlich die bakterielle Zellpellet in 5 ml PBS mit einer serologischen Pipette. Fügen Sie eine zusätzliche45 ml PBS und Zentrifugation bei 7.000 × g für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal für insgesamt drei Wäschen.
5. Nach der letzten Waschung Zellpellet in PBS, so dass eine 1:10 Verdünnung der Kultur eine optische Dichte von 1,0 bei 660 nm (OD ₆₆₀ von 1 Äquivalent bis 10 ⁹ CFU / ml). Abwiegen genug Carboxymethylcellulose (mittel viscocity), um eine 2% w / v-Lösung zu erreichen (zB 0,1 g pro 5 ml Kultur). Langsam die Carboxymethylcellulose zu der Bakteriensuspension unter Vortexen, um Klumpenbildung zu vermeiden.

2. Mündliche Infektion

HINWEIS: Wie in Abbildung 1 dargestellt ist, mit dem entsprechenden Maus-Modell und orale Infektion Regime, P. gingivalis induziert chronische Entzündung und Immunpathologie auf lokaler (Mundhöhle) und systemischer Websites (Arterien).

1. Verwalten Sulfamethoxazol (0,87 mg / ml) und Trimethoprim (0,17 mg / ml) (Sulfatrim), bis zu 8-wk-o sechs-ld männlichen Mäusen ad libitum im Trinkwasser für 2 Wochen auf die normale Flora zu reduzieren. Halten Sie die Antibiotika-Lösung in Braunglasflaschen und schützen Sie es vor Licht, um den Abbau zu verhindern.
2. Um die Sedimentation des Antibiotika-Lösung zu vermeiden, schütteln Sie die Flaschen einmal oder zweimal täglich (dh am Morgen und am späten Nachmittag). Ersetzen mit einem frisch zubereiteten Lösung alle 3 - 5 Tage.
3. Nach zwei Wochen, ersetzen Sie den Antibiotika-Lösung mit herkömmlichen Trinkwasser. Ermöglichen eine 2-Tages-Antibiotikum Ruhezeit vor der oralen Infektion.
4. Laden Sie die P. gingivalis / Fahrzeug Suspension in eine 1 ml Tuberkulinspritze mit einer angehängten Futter Nadel. Manuell zurückhalten mit der Maus durch Greifen das Genick auf der Rückseite den Hals. Sicherstellen, dass der Griff ist fest genug, um die Mobilität der Kopf der Maus die zu beschränken.
5. Infizieren Mäuse durch topische Applikation von P. gingivalis an der bukkalen Fläche des Oberkiefers. Positionieren Sie die Fütterung Nadel wie that wird mit der bukkalen Oberfläche der rechten Oberkieferbackenzähnen ausgerichtet und stoßen 50 ul der Bakteriensuspension. Dispergieren der Lösung vorsichtig entlang dem Zahnfleisch für 1 min mit der Kugel des Zuführungsnadel.
6. Damit der Maus für einen Zeitraum von 30 s bis 1 min vor der Wiederholung des Verfahrens auf der linken Oberkiefers liegen. Kontrollmäuse erhalten die antibiotische Vorbehandlung und orale Gabe mit Vehikel alleine (2% Carboxymethylcellulose in PBS).
7. Um pathogen-induzierten chronischen Entzündung an lokalen Standorten induzierten alveolären Knochenverlust durch Infektion von Mäusen 3 mal in 2-tägigen Abständen zu prüfen. Opfern Mäusen nach 6 Wochen für die Bewertung der Knochenverlust durch microCT.
8. Um pathogen-induzierten chronischen Entzündung an lokalen und systemischen Websites zu untersuchen, zu infizieren Atherosklerose anfällig ApoE ^{- / -} Mäuse 5 mal pro Woche für 3 Wochen.
   HINWEIS: Progression der Erkrankung in der Truncus durch Serien in vivo MRT überwacht. Bild Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten und zu opfern 6-16 wks spätr. Zu der Zeit des Opfers, beurteilen globalen Belastung durch die atherosklerotischen en face Analyse und bestimmen Alveolarknochenverlust von microCT. Charakterisieren atherosklerotischen Läsionen durch Histologie und Immunhistochemie.

3. Mikro-Computertomographie (microCT)

1. Probenvorbereitung
   1. Opfern Mäuse auf dem gewünschten Zeitpunkt nach der Infektion. Einschläfern Mäuse durch CO ₂ asphyxation oder von einem anderen Tieranlage des Organs genehmigte Methode.
      HINWEIS: Blut durch Herzpunktion, das Serum, und bei -80 ° C für die Analyse von Anti-IgG P.gingivalis wie anderswo ⁹ beschrieben.
   2. Verwenden Sie ein großes Paar Enthauptung Schere zu schweren Kopf der Maus an der Basis des Schädels. Entfernen Sie das Fleisch mit einer Pinzette und legen den Schädel in einem 50 ml konischen Röhrchen mit 30 ml 4% gepuffertem Para. Fixierung der Probe für 24 - 48 h bei 4 ° C ist.
   3. Nach der Fixierung, rinsE die Probe gründlich mit PBS.
   4. Erstellen Kieferblock Biopsien.
   5. Bewahren Sie die Hemi-Oberkiefer in histologischen Grad 70% EtOH bei 4 ° C bis Bewertung durch microCT.
2. Image Acquisition
   1. Führen Bildaufnahmen mit einem Desktop-microCT Scanner. Stellen Sie die Röntgenquelle mit einem Strom von 114 uA und einer Spannung von 70 kV. Legen einzelnen Hemi-Oberkiefer in die Abbildungsgefäß und scannen mit einer Auflösung von 12 um in allen drei Raumdimensionen.
      HINWEIS: Legen Sie mehrere Hemi-Oberkiefer gleichzeitig innerhalb der bildgebenden Schiffes.
   2. Führen Sie einen vorläufigen Scan mit geringer Auflösung, die der Benutzer, die Grenzen für die Bildaufnahme abzugrenzen und schränken Sie das Scannen in die Region of Interest (ROI) mit dem System ermöglicht.
      HINWEIS: Die Intensität der Schmelz macht die Krone der Oberkieferbackenzähne leicht zu unterscheiden. Mit den Molaren als Leitfaden lose Satz der Abbildungsgrenzen, um die drei Backenzähne und die umliegende alveolären bon umfassene. Diese Funktion wird auch verwendet, um zwischen den einzelnen Hemi-Oberkiefer diskriminieren beim Scannen mehrerer Proben im gleichen Gefäß.
   3. Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, wandeln die RAW-Bilddateien (.ISQ) in hochwertige dicoms (.dcm).
3. Bildanalyse
   In diesem Protokoll wird die Bildanalyse unter Verwendung einer Visualisierung von Daten, die Verarbeitung und Analyse-Software. Verwenden Sie zuerst morphologischen Sehenswürdigkeiten, ein Flugzeug der besten Passform für die Schmelz-Zement-Grenze (SZG) erstellen. Dann nutzen Sie die, die Hemi-Oberkiefer in eine Standard-Ausrichtung für die anschließende Messung der alveolären Knochenvolumen verwandeln.
   1. Öffnen Sie die Software und klicken Sie auf das Symbol "Open Data" in der oberen linken Ecke des Pools. Alternativ können Sie Datei> Open Data.
   2. Wählen Sie die DICOM-Bildstapel und klicken Sie auf Laden. Das Fenster DICOM Loader wird angezeigt. Klicken Sie auf OK.
   3. Beachten Sie die Daten als ein grünes Symbol in der Pool. Beachten Sie, dass Sie auf dem Datenobjekt verursacht zusätzliche, abert auf im Tastenbereich auf der Oberseite der Pool angezeigt. Auswahl des Symbols verursacht auch einige Informationen über die Datensatz im Bereich Eigenschaften angezeigt werden.
   4. Jedes Symbol in der Pool bietet ein Popup-Menü, aus dem verschiedene Module gewählt werden. Aktivieren Sie das Popup-Menü, indem Sie auf den weißen Pfeil in der rechten Ecke des Daten Symbol. Unter dem Display-Modul, wählen Isofläche (Anzeige> Isosurface). Die Isofläche Symbol wird in der Pool-Bereich angezeigt. Wenn ausgewählt, werden in der Eigenschaftenbereich zusätzliche Einstellungen.
   5. Stellen Sie den Draw Stil transparente und die Schwelle auf 2.000. Stellen Sie sicher, das compactify und Downsampling-Tasten unter Optionen ausgewählt. Unter Durchschnitt, sicherzustellen, x, y und z alle 2. Klicken Sie auf Anwenden, um die Iso-Oberfläche zu erzeugen.
      Hinweis: Beachten Sie eine transparente 3D-Rekonstruktion des Hemi-Oberkiefer im 3D-Viewer. Der Vorteil der Verwendung eines transparenten Streckarten für die Bildrekonstruktion ist, dass die Wurzeln der Backenzähneleicht identifiziert werden. Dies wird wichtig sein, wenn wir die Probe in die Standardorientierung.
   6. Wählen Sie das grüne Symbol und Daten im Bereich Eigenschaften wählen Sie das Symbol zum Ausschneiden. Beobachten ein Fenster der Abmessungen und Koordinaten der Daten. Setzen Sie diese beiseite. Beachten Sie, dass ein Begrenzungsrahmen im 3D-Viewer mit grünen Laschen an jeder Ecke erscheint.
   7. Wählen Sie das Interact-Taste in der Viewer-Symbolleiste. Ändern Sie die Größe des Begrenzungsrahmens durch Klicken und Ziehen auf den grünen Ecken. Stellen Sie sicher, die Box umfasst die Region of Interest (ROI) und eliminiert so viel toten Raum und Schmutz wie möglich. Dadurch wird die Rechen Nachfrage auf dem Computer reduzieren.
   8. Mit dem Trackball-Taste in der Symbolleiste des Viewers, um das Objekt in der 3D-Viewer die Gewährleistung der ROI wird vollständig von der Begrenzungsrahmen umgeben drehen. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie in das Schnittfenster beiseite in Schritt 8 OK.
   9. Wählen Sie das Symbol Daten und unter dem Display-Modul wählen Oblique Scheibe (OBS). (Anzeige> OBS)
   10. Wählen Sie das OBS. Im Eigenschaftenbereich, stellen Sie den Mapping-Typ auf linear, das Datenfenster Bereich von -200 bis 10.000, und der Probenahme bis Feinsten. Wählen Sie nun unter Optionen zu drehen. Beobachten eine Knie drehen in der Mitte der OBS.
   11. Wählen Sie das Interact-Taste in der Viewer-Symbolleiste und verwenden Sie die Griffe des Knie, um die Schnittebene der Scheibe anpassen. Erstellung einer sagittalen Ebene, die parallel zu den Wurzeln der Zähne und senkrecht zur Kaufläche der Zähne verläuft. Die Ebene sollten die drei Backenzähnen (M1-M3) halbieren, wie in Abbildung 2 dargestellt.
   12. Schalten Sie drehen und duplizieren Sie die OBS (Objekt> Duplizieren Objekt). Eine neue OBS erscheint namens OBS 2. Schalten Sie drehen auf für OBS 2.
   13. Verwenden Sie den Drehpunkt zu OBS 2 neu zu orientieren, so dass es senkrecht mit OBS 1 ist (siehe Abbildung 2).
   14. Wiederum drehen sich für OBS 2 und 3 zu erstellen doppelte Scheiben schneiden. Diese werden zu benennen OBS 3, 4 und 5.
4. Kommissionierung Punkte für die Ebene des Best Fit
   Hinweis: Die Schritte 3.4.1-3.4.5 beschreiben die Lage von 8 Punkten entlang der CEJ schafft eine Ebene der besten Passform. Wählen Sie vier der Punkte aus sagittal und die anderen vier von koronalen Scheiben (siehe Abbildung 3). Bei der Kommissionierung Punkte auf sagittal liegt in 3.4.6, kann es notwendig sein OBS 1 anzupassen.
   1. Richten OBS 1 mit der Mitte des am mesialen Wurzel von M1 in der Sagittalebene. Richten OBS 2 mit der Mitte des am mesialen Wurzel von M1 in der koronalen Ebene.
   2. Richten OBS 3 mit dem Zentrum des bucco-distalen Wurzel von M1 in der koronalen Ebene. Falls erforderlich, OBS 1, so dass es in etwa mit dem Bucco-distalen Wurzel des M1 zentriert in der Sagittalebene bei der Auswahl in Schritt 20 Punkte.
   3. Richten OBS 4 mit der Furkation der bukkalen Wurzeln der M2. OBS 4 sollte zwischen den Bucco-mesialen und distalen Bucco-Wurzeln der M2 zentriert werden. Falls erforderlich, OBS 1, so dass es etwa zentriert ist with die bucco-distalen Wurzel M2 in der Sagittalebene, wenn die Auswahl in Schritt 20 Punkte
   4. Passen OBS 5, so dass es läuft in der Mitte der M3 in der Frontalebene. Falls erforderlich, OBS 1, so dass es etwa mit den meisten distalen Wurzel des M3 zentriert in der Sagittalebene bei der Auswahl in Schritt 20 Punkte.
   5. Duplizieren Sie eine der OBS (OBS 6), und wählen Sie, um Punkte im Eigenschaften-Fenster Passform. Die Passform, um Punkte zu wechseln ermöglicht dem Forscher, 3 oder mehr Punkte auf 2D-oder 3D-Objekte innerhalb der Pick-Viewer und berechnet dann eine Ebene der besten Passform. In diesem Fall werden die in den vorhergehenden Schritten beschrieben 2D OBS wird verwendet, um 8 Punkte entlang der SZG auszuwählen.
   6. Verstecken OBS 6 aus dem 3D-Viewer, indem Sie auf die Box in der rechten Ecke des Daten Symbol. Ausblenden der Isofläche aus der 3D-Viewer die CEJ auf allen 2D-Schichten sichtbar zu machen. Gedrückter Umschalttaste auf und wählen Sie die 8 Punkte entlang der CEJ wie oben beschrieben.
      HINWEIS: Wenn die Shift-Taste nicht nach unten bei der Auswahl stattPunkte eine Ebene automatisch nach den ersten drei Punkten berechnet werden.
   7. Nachdem alle 8 Punkte, machen OBS 6 sichtbar. Beachten Sie, dass dies ein Axialschnitt, der etwa parallel zu der okklusalen Ebene verläuft.
5. Transformation und Neuausrichtung HINWEIS: Die Ebene der besten Anpassung wird verwendet, um die Daten in einer Standardausrichtung für nachfolgende Volumenmessungen umzuwandeln.
   1. Klicken Sie auf Daten Icon> Compute> ApplyTransform. Die ApplyTransform Symbol erscheint in der Pool-Bereich. Klicken Sie auf das weiße Quadrat in der Ecke des ApplyTransform Symbol, wählen Sie Referenz, und klicken Sie auf OBS 6.
   2. Im Eigenschaftenbereich, wählen Sie Standard für die Interpolationsmethode und verlängert für den Modus. Wenden Sie die Transformation.
   3. Erstellen Sie eine Iso-Oberfläche und einen koronalen OBS für die neue Datendatei. Drehen der OBS in axialer Richtung, so daß es etwa senkrecht mit M1 (in 2 gezeigt). Verwenden Sie die Höcker der Molaren und die okklusale curvatures als Leitfaden.
   4. Verwenden Sie diese Ebene, um die Daten wie in den Schritten 3.5.1 und 3.5.2 zu verwandeln. Speichern Sie die transformierten Daten-Datei.
6. Segmentierung und Knochenvolumenmessung
   HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben die Segmentierung und Messung der Kieferknochen. Die Scheibe, die der Ebene der besten Anpassung für die SZG wird identifiziert und eine Bezugsebene gewählt ist. Alveolarknochen zwischen dem CEJ und der Referenzebene an der Wangenseite der Backenzähne ist segmentiert und vermessen. Die mesialen Wurzel von M1 und die distale Wurzel des M3 dienen als Endpunkt Sehenswürdigkeiten. Einstellen der Referenzebene 15-20 Scheiben unter dem CEJ liefert optimale Ergebnisse. Einbeziehung weiterer Scheiben führt Variabilität, die Masken Unterschiede in der Knochenvolumen zwischen den Behandlungsgruppen.
   1. Öffnen Sie die Segmentierung Editor und erstellen Sie eine neue Bezeichnung für die transformierten Daten.
   2. Erstellen Sie ein neues Material und nennen Sie es Alveolarknochen.
   3. Unter Zoom und Datenfenster, stellen Sie den Datenbereich herm -200 bis 10.000.
   4. Unter Display und wählen Sie das 2D-Masking Fadenkreuz, 3D-MPR und 3D-Volumen-Rendering-Symbole. Legen Sie den Datenbereich von 2.500 bis 8.000. Aktivieren Sie die Datenmaskierung.
   5. Wählen Sie die vier Zuschauer Display-Einstellung aus dem Viewer-Symbolleiste. Die Anzeige ist in vier Quadranten erlaubt die gleichzeitige Prüfung von saggitalen, koronalen und axialen Bildstapel, sowie die 3D-gerenderten Volumen geteilt.
   6. Verwenden Sie alle vier Quadranten, um die letzte Scheibe, wo Schmelz an der Wangenflächen von M1 und M3 sichtbar zu identifizieren. Diese Lage entspricht der Ebene der besten Anpassung für die SZG. Notieren Sie sich die axialen Schichtnummer.
   7. In der axialen Ebene, weiterhin 15-20 Scheiben in Richtung der Alveolarkamm. Dies stellt die Bezugsebene.
   8. Verwenden Sie eine beliebige Kombination von Tools zur Segmentierung Alveolarknochen an der Wangenseite der Backenzähne zwischen dem CEJ und der Referenzebene zu wählen. Verwenden Sie die meisten mesialen Wurzel von M1 und die meisten distalen Wurzel von M3 als Endpunkt Sehenswürdigkeiten.
   9. Wenn Sie zufrieden sind, fügen Sie die Auswahl auf Alveolarknochens unter der Materialliste.
   10. Zurück zur Objektpool. Ein neues Symbol mit der Erweiterung ".Labels" sollte auf die Bilddaten-Symbol angehängt werden. Wählen Sie das Symbol und Labels in der Dropdown-Menü wählen Materialien> MaterialStatistics.
   11. Im Eigenschaftenbereich, Material auswählen und traf gelten. Eine Tabelle angezeigt, mehrere Parameter für jedes Material auf der Materialliste. Nehmen Sie die Lautstärke des Alveolarknochens.

4. Bewertung der Atherosklerose

1. Aortendissektion
   1. Opfer der Maus durch CO ₂ Ersticken an der gewünschten Zeitpunkt nach der Infektion.
   2. Platzieren Sie die Maus auf der Rückenseite, Klebeband unten und wischen Maus mit 70% EtOH. Schneiden Sie die Haut auf der ventralen Seite von der Mitte des Bauches, gerade über die Schwertfortsatz.
   3. Schneiden Sie die Bauchhaut bis der Schwertfortsatz sichtbar ist. Heben Sie die Schwertfortsatz mit einer kleinen pair von Zangen, stellen Schnitte auf jeder Seite des Brustkorbs, und schneiden Sie die Membran. Dann machen Sie zwei Schnitte nach unten jeder Seite des Brustkorbs, um das Herz freizulegen.
   4. Exsanguinate der Maus unter Verwendung einer 27 G-Insulinspritze in den Apex des rechten Ventrikels angeordnet ist. Während der Blutabnahme, regelmäßig drehen Sie die Nadel, um die Blockierung der Öffnung durch die Kammerwand zu verhindern. Typischerweise 0.8 - kann 1 ml Blut mit dieser Methode erzielt werden.
   5. sup> HINWEIS: Trennen Sie Serum und bei -80 ° C für die Analyse von Anti-IgG P.gingivalis, wie anderswo beschrieben ⁹
   6. Mit einer Schere, um den rechten Vorhof zu entfernen.
   7. Finde den linken Ventrikel auf der hinteren Seite des Herzens. Einführung einer 21 G-Nadel in die Spitze des linken Ventrikels mit der Abschrägung der Nadel gegenüber der Mitte der Kammer zu spülen und langsam das Kreislaufsystem mit 3 - 5 Werk ml Gewebefixiermittel.
   8. Trim Fett und Thymus rund um das Herz.
   9. Entfernen Sie die lungs.
   10. Suchen Sie den Aortenbogen mit den drei Niederlassungen und wegzuräumen umgebenden Fettschichten für eine bessere Belichtung.
   11. Weiterhin Aortendissektion vom Bogen auf der Basis der Membrane.
   12. Entfernen Sie die Leber und Darmgewebe verdrängen, um die absteigende Aorta freizulegen. Sezieren die distale Aorta bis zu den Nierenarterien Filialen.
   13. Schneiden Sie die Nierenarterien und die Dissektion weiter bis zum Ileum-Bifurkation.
   14. Sobald die Aorta ist frei von den meisten Bindegewebe, zurück an die Spitze der Aorta und schneiden Sie die Spitze Teil der drei Zweige aus der Aorta über dem Herzen.
   15. Peel Herz nach oben, schnippeln zugrunde liegenden Fettgewebe, um das Herz aus dem Körper zu trennen.
   16. Halten Sie das Herz mit einer Pinzette und ziehen nach oben, Schneiden Bindegewebe, das noch angebracht werden können, und weiter bis zu den Nieren und folgen bis zu den Beinen und schnippeln an tiefsten Punkt.
   17. Fix Aorta in 10% Formalin für 1 Stunde mit einem subsefolgenden PBS waschen für 1 Stunde. Alternativ store Aorta in 10% Formalin O / N, spülen in PBS am folgenden Tag und fahren Sie mit Dissektion.
   18. Ort Aorta in eine 10 cm Petrischale mit PBS.
   19. Mit Hilfe eines Binokular, entfernen Sie vorsichtig adventitialen Gewebe aus der Aorta.
   20. Wenn Aorta ist frei von überschüssigem Fett und Gewebe, abgeschnitten unteren zwei Drittel des Herzens. Starten Schälherzmuskel entfernt am Ende des Herzens gegenüber den Aortenbogen. Der Kolben der Aorta zu langsam erscheinen, das eine weiße Färbung wird.
   21. Weiterhin sorgfältig seziert und mit zwei Pinzetten bis Aorten-Lampen sind frei von Herzmuskelgewebe.
   22. Ort und Stelle gereinigt Aorta in einem schwarzen Tablett Sezieren und decken mit PBS.
2. Pinning der Aorta
   1. Halten Aorta in PBS ganzen Pinning bedeckt.
   2. Legen Aorta in anatomische Position mit Zwiebeln von Aorta auf links.
   3. Zeigen temporäre Minutien Stifte an 5 Standorten, beginnend mit 1) oben Aorta, 2) unterhalb drittenZweig der Bogen, 3) in der Mitte der absteigende Aorta 4) in der Nähe von unteren Ende der absteigende Aorta 5) oben Zweig der Arteria femoralis.
   4. Mit extra feiner Feder Schere, schnitt sich linken Seite der Aorta, beginnend bei linken Ast der Arteria femoralis den ganzen Weg bis zu den untersten Ast von unten aufsteigenden Aorta Aorta.
   5. Schneiden Sie aus nach links Seite des niedrigsten Aortenbulbus an der Felsspalte und weiter geschnitten, um Schnittpunkt der Schnitt entlang der vertikalen Schnitt der Aorta zu erreichen.
   6. Über Aorta geschnitten horizontal zum Punkt der untersten Ast der aufsteigenden Aorta zu erreichen
   7. Schneiden Sie oben auf der rechten Seite, um über höchster Zweig der Aorta.
   8. Schneiden Sie die einzelnen Zweig ihrer Innenfläche freizulegen.
   9. Einige temporäre Stifte entfernen und ersetzen mit Permanentstifte mit dem Ziel der Fesselung alle Aorta in anatomische Lage, ohne Falten, Dehnung der Aorta. Ziel ist es, innere Oberfläche der Aorta aus.
   10. Weiter Pinning, bis alle inneren Oberfläche der Aorta freigelegt und von oben deutlich sichtbar und frei von visuellen interference von Pins.
3. Lipid-Färbung und Quantifizierung Läsion
   1. Vorbereitung Sudan IV Färbelösung (5 mg / ml in 70% Isopropanol). Gut mischen und filtern, um sicherzustellen, dass keine Kristalle vorhanden sind.
   2. Abdeckung Aorta im Sudan IV-Lösung für 50 min.
   3. 5 min - mit 70% Isopropanol für 1 waschen. Aorta sanft spülen Sie mit ddH20, bis das Wasser kommt aus der Aorta ist nicht mehr rot.
   4. Decken Aorta mit PBS. Machen Sie Bilder von der Aorta mit einer hochauflösenden Kamera an einem Binokular angebracht und speichern als digitale Bilddateien (TIFF). Legen Sie ein Lineal neben jedem Bild, um die Kalibrierung zu unterstützen.
   5. Verwenden ImageJ Software, um die Fläche der Intima und Fläche der Läsionen bestimmen. Manuell verfolgen die Intimaoberfläche zu Gebiet zu bestimmen. Läsion Bereich kann mit automatischen Farbschwellen berechnet werden. Dies erfordert ein Schwellenwert, um eine Farbintensität, die Läsionen von normalen Bereichen diskriminiert zu definieren.
   6. Der prozentuale Anteil derIntimaoberfläche von atherosklerotischen Läsionen bedeckt.

5. Die histologische Beurteilung der atherosklerotischen Läsionen

1. Ernten Aortenbogen mit Herzgewebe und tauchen in OCT in einem Einweg-Basisform.
2. Sammle 5 um Seriengefrierschnitte alle 50 um in der Aortensinus und Truncus mit einem Kryostat bei -17 ° C eingestellt und montieren Sie die Gewebeschnitte auf Objektträgern. Objektträger bei 20 ° C bis zur weiteren Verwendung.
3. Für die histologische Beurteilung, Fleck mit Hämatoxylin & Eosin und geeignete Verfahren.

6. Immunhistochemische Charakterisierung von atherosklerotischen Läsionen.

Die folgenden Schritte beschreiben ein allgemeines Antikörper-basierte Protokoll routinemäßig eingesetzt, um atherosklerotische Läsionen in P. bewerten gingivalis infizierten Mäusen. Dieses Protokoll erfordert Optimierung für jeden Antikörper oder Reagenz.

1. Objektträger aus der Tiefkühltruhe und behebenfür 2 Minuten in eiskaltem Fixierungsmittel (Aceton oder andere Fixiermittel).
2. Die Objektträger auf RT kommen und beschriften mit einem lösungsmittelbeständigen Stift.
3. Spülen gleitet 3x in PBS, um das Gewebe zu entfernen Gefrier Matrix
4. Block endogene Peroxidase-Aktivität durch Inkubation der Objektträger in 0,3% H ₂ O _2-Lösung in PBS für 10 min.
5. Spülen gleitet 3x in PBS für 2 min jeder Zeit.
6. Blockieren nicht-spezifischer Bindung durch Inkubation in Blockierungspuffer (10% Kaninchenserum in PBS) für 30 min bei RT.
7. Verdünnen Sie die primären Antikörper 1:50 10% Kaninchenserum.
8. Gelten die verdünnte Antikörpers an die Gewebeschnitte auf der Folie.
9. Inkubation für 1 h bei RT.
10. Spülen gleitet 3x in PBS für je 2 min.
11. Verdünnte Anti-Ratten-biotinylierte sekundäre Antikörper 1: 100 in 10% Kaninchenserum.
12. Beziehen sich auf die Gewebeschnitten auf den Objektträger, Inkubation 30 min bei RT.
13. Spülen gleitet 3x in PBS für je 2 min.
14. Bereiten DAB Substrat-Lösung durch Zugabe1 Tropfen DAB Chromogen jedem 1 ml DAB-Puffer.
15. Abtropfen PBS von den Objektträgern und wenden Sie die DAB-Substratlösung. Die Objektträger für 5 min oder bis die gewünschte Farbintensität erreicht ist inkubiert.
16. Wasch 3x in Wasser für je 2 min.
17. Gegenfärbung mit Hämatoxylin.
18. Dehydratisieren bis 4 Änderungen von Alkohol (95% 1 min, 95% 1 min, 100 min und 1% 100% 5 min).
19. Klar in 3 Änderungen Xylol.
20. Deckglas mit Befestigungslösung und qualitativ analysieren, indem Mikroskopie. Für die quantitative Analyse zu erwerben Bilder und berechnen Färbung Bereich mit ImageJ mit Hilfe eines automatisierten Schwelle.

7. MRT

1. Vorbereitung der Tiere für die MRT
   1. Betäuben die Mäuse vor MRI-Experimente. Führen Sie die erste Einleitung der Narkose unter Verwendung von 4% verdampfte Isofluoran für 2-3 min in einem Induktionskammer. Aufrechterhaltung einer Narkose bei der Abbildung Zeitraum mit einem kontinuierlichen Fluss von 0,5-2% verdampft Isofluoran delivered durch eine Nasenkegel Setup oder Maske.
   2. Nach Erreichen der chirurgischen Ebene der Anästhesie (dh keine Zehe Prise Antwort), die Maus in eine Tierhalter mit der Nase in ein Nasenkegel eingelegt. Es gibt mehrere Typen von kommerziell erhältlichen Tierhalter, die verwendet werden können, um mögliche Bewegung während der Bilderzeugung zu minimieren. Wir verwenden eine kundenspezifische Halter mit einem Biss bar.
   3. Überwachen die Atmung und Herzkreislauf und mit der Bildaufnahme mit einem Kissen Atmung (auf der Maus die Bauch gelegt) mit einem kleinen Tierüberwachung und-Gating-System ausgestattet synchronisieren.
   4. Sichern Sie die Maus und Überwachungssystem auf den Tierhalter mit Labor Film.
2. MRT Datenerfassung
   1. Legen Sie das Tier Halter mit dem Kopf des ersten Maus in Rückenlage in eine 30 mm Vertikalsonde (Micro 2.5) gehalten wird, bei 23 ° C und in der vertikalen Bohrung 11,7-T-MRT.
   2. Richten Sie die Halterung mit dem Zentrum von ter HF-Spule.
   3. Führen Sie eine Shim-Verfahren mit einer einzigen Impulsfolge.
   4. Mit einer seltenen Sequenz erwerben Scout Bilder entlang drei orthogonalen Richtungen, um die axiale, koronale und sagittale Bilder zu erstellen.
   5. Führen Sie eine niedrige Auflösung Magnetresonanz-Angiographie (MRA) mit einem unbeschrankten 3D Gradientenecho-Sequenz mit folgenden Parametern: Deckenstärke = 1,5 cm; Flipwinkel = 45 °; Wiederholungszeit = 20 ms; Echozeit = 2,2 ms; Sichtfeld = 1,5 × 1,5 × 1,5 cm; Matrix = 64 × 64 × 64; Anzahl der mittel = 1. Gesamtscanzeit: 2~3 min. Der Zweck dieser Überprüfung ist, um sicherzustellen, dass die Bilder auf dem Zielbereich (dem Truncus) erworben.
   6. Führen Sie eine hohe Auflösung der MRA Truncus mit einem unbeschrankten 3D-Gradienten-Echo-Sequenz mit folgenden Parametern: Deckenstärke = 1,5 cm; Flipwinkel = 45 °; Wiederholungszeit = 20 ms; Echozeit = 2,2 ms; Sichtfeld = 1,5 × 1,5 × 1,5 cm; Matrix = 128 &# 215; 128 × 128; Anzahl der mittel = 4. Gesamtscanzeit war ~ 25 min.
   7. Erhalten gehende axiale Bilder des Truncus 0,5 mm unterhalb des Schlüsselbein Bifurkation.
3. MRT-Daten-Analyse
   1. Führen Sie die Bildrekonstruktion und-Analyse mit Imaging-Software mit dem Scanner verbunden. Erreichen Sie die 3D-Rekonstruktion der MRA-Bilder von Maximum Intensity Projection.
   2. Verwenden Sie die Schlüsselbein Bifurkation als anatomische Marker aus verschiedenen Mäusen oder der gleichen Maus zu verschiedenen Zeitpunkten erfassten Daten auszurichten. Wählen Sie die Zielquerschnitt des Truncus bei 0,3 bis 0,5-mm-Abstand unter dem subclavianbifurcation.
   3. Definieren und berechnen Lumenbereich des gewählten Querschnitt mit ImageJ. Die Messungen sollten im Blind von zwei unabhängigen Beobachtern durchgeführt werden. Überprüfen Sie, ob die Wiederholbarkeit der Messungen durch die Berechnung interclass Korrelationskoeffizienten.
   4. Für Längsschnittstudien mit Serien imagtion, normalisieren Lumenfläche im Bereich des an der Grundlinie (der ersten Dose in die Studie) für jede Maus erhalten Lumen. Die Ergebnisse sind als Änderung in der Lumenbereich über die Zeit.
   5. Führen Sie die geeignete statistische Analysen (dh, Student t-Test), um signifikante Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen zu bestimmen.

Ergebnisse

Mit dem entsprechenden Maus-Modell und orale Infektion Regime, P. gingivalis induziert chronische Entzündung und Immunpathologie auf lokaler (Mundhöhle) und systemischer Websites (Arterien) (Abbildung 1).

Bei Mäusen, die orale Infektion mit P. gingivalis induziert eine lokale Entzündungsreaktion, die die Zerstörung des Zahnhalte Alveolarknochen ⁸ antreibt. P. gingivalis-infizierten Mäusen Serumantikörperantworten auf diesem Organi...

Diskussion

Die P. gingivalis orale Infektionsmodell bietet ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der Erreger-induzierten chronischen Entzündung an lokalen und systemischen Seiten. Dieses einzigartige Modell erlaubt die Charakterisierung der beiden Wirt und Pathogen spezifischen Mechanismen einen Beitrag zu chronischen Entzündungen und Immunpathologie. Ferner kann das Modell verwendet werden, um neue therapeutische Strategien, einschließlich der Immunisierung und pharmakologische Intervention zu screenen. Die in...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira analysis software	Visualization Sciences Group
Anaerobic chamber DW Scientific Model MG500	Microbiology International
BHI	Becton-Dickinson	211059
Hemin	Sigma-Aldrich	51280-5G
Menadione (Vitamin K)	Sigma-Aldrich	M5625-25G
Yeast Extract	Becton-Dickinson	212750
Carboxymethyl cellulose (medium viscocity)	Sigma-Aldrich	C-4888
Sulfamethoxazole and trimethoprim oral suspension 200 mg/40 mg per 5 ml	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
μCT 40	Scanco
HistoChoice Tissue Fixative	Sigma-Aldrich	H2904
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261-25G
Vertical-bore 11.7T Avance spectrometer	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
Rat anti-mouse F4/80	Serotec	MCA497R
Rat anti-mouse TLR2	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 dissecting scope	Leica
Microm HM 550 cryostat	Microm