JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Özet

Sentrozomlar genomik bütünlüğünü korumak veya hücrelerde duyusal işlevleri kolaylaştırmak için birincil kirpikler araya mitotik iğ direkleri olarak hizmet küçük ama önemli organellerdir. Bir protein seviyesi, diğer .cellular konumlarda daha sentrozom daha farklı düzenlenmiş olabilir, ve hücre döngüsünün farklı noktalarda çeşitli proteinlerin centrosomal seviyesindeki değişimin sentriol düzeneğinin doğru düzenlenmesi için önemli olduğu görülmektedir. Bu tür hücre döngüsünün farklı aşamalarında veya farklı reaktifler ile muamele edildikten sonra çeşitli örneklerden sabit hücrelerde sentrozom bir protein seviyesinde nispi değişiklik ölçen bir sayısal floresan mikroskobu bir deney geliştirildi. Bu deneyde ilkesi küçük bir bölgede bir proteine ​​karşılık gelen arka düzeltilmiş floresan yoğunluğunun ölçülmesi yer alır ve seçilen deney c değişiklik olmayan başka bir protein için aynı karşı ölçüm normalizeondition. BrdU nabız ve soğukkanlı hücre döngüleri incelemek için takip stratejisi ile birlikte bu testte kullanarak, kantitatif özellikle sentrozomlarla de proteazom aracılı bozulması ile muhtemel VDAC3 ve centrosomal havuz, hücre döngüsü sırasında sentrozomlarla de düzenlenir bizim son gözlem, valide var.

Giriş

Sentrozom pericentriolar malzeme (PCM) 'çevrili Sentriyoller bir çift oluşur. Memeli hücrelerinde büyük mikrotübül organize merkezleri (MTOCs) olmak, sentrozomlar bölünen hücrelerde mitotik iğ iki kutup olarak hizmet, ve böylece genomik bütünlüğünü 1 korumamıza yardımcı olur. (G0 aşamasında örneğin) hareketsiz hücrelerde, sentrozom, yani ana sentriolden iki Sentriyoller biri, primer kirpik, hücre yüzeyi 2 dışarı doğru çıkıntı yapan bir duyusal organel birleştirmek için bir taban gövdesi içine transforme edilir. Hücreler bir kez hücre döngüsü yeniden girmek primer kirpikler parçalarına ve her centriole yavaş yavaş olgun centriole 3 oluşturmak üzere uzar proksimal ucunda bir procentriole montajını yönlendirmektedir. S-fazı başlangıcında, sentriolden 9-katlı bir simetriye sağlayan bir çember benzeri bir yapı olan her sentriolden yüzeyi üzerinde oluşturulmuş olan ve her procentriole baz olacaktır. Sas6 tcentriole montaj cartwheel 4-6 hub oluşturmak için işe edilir için şapka vazgeçilmezdir. Diğer centriolar proteinler daha sonra uzak bir şekilde 7 derece düzenlenir, proksimal tekerin üzerine monte edilir. Tam centriole tekrarını tamamladıktan sonra, hücreler G2 fazı 8 yılı sonunda iki fonksiyonel sentrozomlar inşa ek pericentriolar malzemeleri bir araya getirin. Çekirdek centriolar bileşenler 9-11, kinaz, fosfataz, şaperonlar, iskele elemanları, zara bağlı proteinler ve bozunma makineler dahil olmak üzere birçok başka protein ek olarak hücre döngüsü 12-16 farklı zamanlarda Sentriyoller bazal gövde ve PCM ile ilişkilidir. Genellikle, bir çok proteinin centrosomal seviyeleri geçici olarak centrosomal hedefleme mekanizmalarının ve / veya sentrozom de proteozomal bozulması düzenlenir belirtilmelidir. Önemli bir şekilde, Plk4, Mps1, Sas6 ve CP110 a gibi çeşitli proteinlerin centrosomal düzeyinde dalgalanmalarhücre döngüsünün t farklı noktaları centriole düzeneğinin 5,17-22 düzenleyen önemli olduğu görülmektedir, ve bu centrosomal bozulması önlenir Mps1 durumunda fazla Sentriyoller 19 oluşumuna yol açar. Öte yandan, çeşitli proteinlerin centrosomal fraksiyonlar sitosolik havuzları ile karşılaştırıldığında daha az dayanıksız. Örneğin aşağı doğru düzenlenmesi fotoseli 2 (Cetn2) siRNA aracılı olan bütün hücre seviyeleri 23 büyük azalmaya rağmen Sentriyoller protein düzeyinde yalnızca orta derecede bir azalma sağladı. Oldukça onların centrosome özel fonksiyonları değerlendirilirken tüm hücre protein seviyelerini ölçmek daha centrosome de centrosomal proteinlerin düzeyindeki değişiklikleri ölçmek için bu nedenle çok önemlidir.

Bu çalışmada, sentrozom bir proteinin nispi seviyesini ölçmek için dolaylı immünoflüoresans (IIF) kullanan bir analiz geliştirdik. Bu deney, çeşitli örneklerden olan hücreleri analiz etmek için özellikle geliştirilmiştirve bu nedenle, aynı zamanda görüntülü edilemez. Numuneler farklı zaman noktalarında toplandı farklı reaktifler (örneğin, ilaç kontrole karşı) ile muamele edilmiş olan hücreler olabilir (yani, Chase karşı darbe), ya da hücre döngüsünün farklı aşamalarında bulunmaktadır. Bu deneyde ilkesi arka düzeltilmiş floresan yoğunluğu küçük bir bölgede bir proteine ​​karşılık gelen ve, seviyeleri seçilen deney koşulları altında değişmeyen bir başka protein aynı karşı değer normalleştirmek için ölçüm yatmaktadır. Centrosome biyoloji çeşitli çalışmalar son zamanlarda aday proteinlerin 24-27 arasında centrosome özgü fonksiyonunu belirlemek için, hem canlı ya da sabit hücrelerde çeşitli kantitatif mikroskopi teknikleri, kullanılan var. Bu deneylere benzer şekilde, bu teknik, aynı zamanda test proteinin arka plan düzeltilmiş bir flöresan yoğunluk ölçer. Bununla birlikte, bu tahlilde, bir dahili standart olarak normalleştirme dahil büyük ihtimalle daha teklifdoğruluk ve iki farklı lamelleri üzerinde iki farklı örnekleri analiz güven. Ayrıca, sentrozom protein seviyesinin incelenmesine ek olarak, küçük ayarlamalar ile bu yöntem, deney şartlarının farklı ayarlamak için ya da diğer hücresel sitlerde uygulanabilir.

Burada, farklı hücre döngüsü aşamalarında hücreleri karşılaştırmak için BrdU darbe-kovalamaca stratejisi ile kantitatif mikroskopi tahlil birleştirir. Bunun yerine, hücre döngüsünün farklı zaman noktalarında çalışma zaman uyumsuz büyüyen hücreler standart hücre döngüsü tutuklama ve serbest bırakma teknikleri kullanılarak S-fazında hücreleri etiketlemek için BrdU ile inkübe edilir, ve etiketlenmiş hücreler, çeşitli zamanlarda (tipik olarak 4-6 saat) boyunca takip edilir. Etiketli hücrelerin çoğu hemen darbesinden sonra S-faz olacaktır. Chase sonra işaretli hücrelerin morfolojik özellikleri nuc göre sentrozom gibi maddelerle pozisyonu tarafından kontrol edilebilir geç S, G2 veya mitoz içinde olacak şekilde Chase uzunluğu seçilirLei, sentrozom arasındaki mesafe, vb kromozom kondansasyon Böylece, kovalama uzunluk S, G2 ve belirli bir hücre tipinin M fazında ortalama süresine bağlıdır. Bu yaklaşım, vb hidroksiüre, afidikolin, nokodazol, hücre döngüsü inhibitörleri önler olduğundan, fizyolojik olarak daha uygun hücre döngüsü analizi sağlar.

Bu yüzden, tek başına nicel floresan mikroskobu deneyi veya BrdU Darbe kovalayıcı tahlilinde ile kombinasyon halinde, doğru bir soğukkanlı hücre döngüsü sırasında aday protein centrosomal seviyesinde göreli değişiklikleri ölçmek için basit ama etkili bir yöntem olduğu burada ortaya koymaktadır. Biz, bu deneyler kullanılarak, VDAC3, son zamanlarda 16,28 mitokondri ek olarak sentrozom de tanımlanan bir protein centrosomal düzeyleri ölçüldü. Burada elde edilen sonuçlar VDAC3 arasında centrosomal havuz bozulması ile düzenlenir bizim daha önceki bir gözlem doğrulamak, ve aynı zamanda bir hücre döngüsü bağımlı hazırlık değişirt şekilde 16, ayrıca bu yöntemin uygulanabilirliğini doğrulanması.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Hücre Kültürü

  1. Ters transkriptaz (hTERT) ölümsüzleştirdi retina pigment epitel hücreleri, insan telomeraz kullanın (hTERT-RPE1; RPE1 burada anılacaktır).
    Not: RPE1 hücrelerde bu centriole montaj ve ciliogenesis incelemek için kullanılır yakın-diploid, dönüştürülmemiş insan hücreleridir. Bu hücreler düzenlenmiş hücre döngüsü ile koordineli normal centriole çoğaltılması döngüsünü izleyin.
  2. Geçiş 1 ile RPE1 hücrelerinin yakın bir birleşik, 100 mm'lik bir hücre kültürü çanağı: 10 ml ihtiva eden bir taze 100 mm tabak için orijinal kültür 5 seyreltme DME / F-12 (1: 1) ortamı,% 10 fetal inek serumu ile desteklenmiş (FBS), 100 U / ml penisilin G ve 100 ug / ml streptomisin (tam bir ortam, DME / F-12 ortamı olarak adlandırılır). % 5 CO2 varlığında 37 ° C'de hücreler büyür.
    1. Bir su banyosu veya inkübatör içinde 60 ° C'de, çalkalanarak olmadan kapalı bir cam beher O / N HC1 50 ml 12 mm yuvarlak cam lamelleri inkübe edin.
    2. Afasit çözeltisi atılması ter arada çalkalanarak 15 dakika boyunca inkübe edilerek lamelleri damıtılmış su, 100 ml, üç kez yıkayın. % 70 Etanol ve% 95 etanol ile benzer şekilde yıkama tekrarlayın.
    3. Ayrı ayrı 60 dakika UV radyasyonu ile sterilizasyon ardından biyogüvenlik kabini içinde bir laboratuvar kurutma kağıdı, onları dışarı yayarak lamelleri kurulayın.
  3. Bir 35 mm hücre kültür çanağı 2-4 kuru lamelleri yerleştirin. Hücre kültürü, PBS içinde 25 ug / ml'lik bir konsantrasyona kadar işlenmiş polimerin (1 mg / ml stok konsantrasyonu) gibi fibronektin çözeltisi ya da fibronektin ile seyreltilir.
    1. Her lamel üzerine seyreltilmiş çözeltinin 80-100 ul yerleştirin ve kaplamak için 60 dakika lamel üst tarafı için kuluçkaya yatmaktadır. Tam orta eklemeden önce PBS ile üç kez lamelleri yıkayın.

2. Büyüyen Hücreler ve Proteazom inhibitörleri ile tedavi Hücreler

  1. Passage 2 x 10 5 asenkron olarak büyümekHer 35 mm çanak ing RPE1 hücreleri lamelleri içeren ve 2 ml tam orta hücreleri büyür. Kültür ortamı, taze, önceden ısıtılmış tam ortam maddesi ile her 24 saatte değiştirin.
    1. Test protein centrosomal düzeyde proteazom inhibisyonunun etkisini analiz etmek (burada VDAC3 veya γ-tubulin), 44 saat için iki adet 35 mm yemekleri hücreleri büyümek. Komple ortam ile kültür ortamı yerine sırasıyla 5 uM veya% 0.05'lik bir nihai konsantrasyonda kontrol çözücü olarak MG115 veya DMSO ya da eklemek. Aynı zamanda, 4 saat süre ile hücreler 40 uM'lik nihai bir konsantrasyonda, hücrelere BrdU ekleme ve inkübe edilir.
    2. 24 oyuklu bir plaka içerisinde her bir lamel aktarın. Her bir oyuğa 500 ul soğutulmuş metanol eklenir ve 10 dakika lamelleri hücreleri düzeltmek için, -20 ° C 'de plaka inkübe edin. Hemen lamelleri 500 ul yıkama tamponu ile üç kez yıkayın (0.5 mM MgCI2 ve% 0.05 ihtiva eden 1x PBS, Triton-X-100).
  2. Artık Hasat35 mm tabak ve santrifüj 5 dakika boyunca 1000 x g'de hücrelerinden hücre. Western blotting (aşama 6), total protein analiz üzere hücre pelleti kullanın.

3. BrdU Darbe ve Chase Testi Farklı Hücre Döngüsü Evreleri Protein Düzeylerinin Analiz

  1. 44 saat lamelleri içeren iki adet 35 mm yemekleri hücreleri büyümek, hücre döngüsünün farklı aşamalarında sentrozomlarla bir proteinin (burada VDAC3, Sas6 veya Cep135) seviyesi değişimini analiz etmek. 40 uM BrdU içeren tam ortam maddesi ile kültür ortamı yerine ve hücre kültürü kuluçka makinesi içinde 4 saat kuluçkalayın.
  2. Bir tabak, Aşama 2.1.2 tarif edildiği gibi soğutulmuş metanol kullanılarak hücreleri gidermek için bir 24 oyuklu plaka lamelleri aktarın.
  3. 4 saat BrdU puls sonrasında BrdU-içeren ortam maddesinin ayrılması bir kez PBS ile yıkayın hücreleri ve tam ortam maddesi ile bir kez çeşitli zamanlarda (tipik olarak bir 4 saat boyunca BrdU yokluğunda hücreleri taze ortam ilave ve daha sonra büyüyecekAdım 2.1.2 de açıklandığı gibi hücrelerin sabitleme önce RPE1 hücreleri) için.
    Not: RPE1 hücreleri için, BrdU-pozitif hücrelerin çoğu, bir 4 saat Chase sonra geç S ya da G2 faz içindedir. Bu, her bir hücre tipi için ayrı ayrı belirlenmelidir.

4. immün

  1. 30 dakika boyunca (1 x PBS içinde% 2 BSA ve% 0.1 Triton X-100), bloke edici tampon 200 ul lamelleri ile sabitleştirilmiş hücreler inkübe edin.
    1. Birincil antikor karışımı ile inkübe hücreleri nemlendirilmiş bir bölmede 4 ° C'de tampon O / N engelleme seyreltilmiş (tipik olarak bir tavşan içinde yetiştirilmiş ve bir fare arttırılmış).
    2. Nemlendirilmiş bir odasını yapmak için, boş bir 1.000 ul pipet kutusunun alt yarısında ıslak kağıt havlu koymak. Raf yüzeyinde Parafilm bir şerit yatıyordu, ve inkübe her lamel için Parafilm üzerine antikor çözümün bir damlacık (15-20 ul) nokta. Antikor çözeltisi bir damlacık üzerine bir lamel haricindekileri (hücre dalmış böylece) ve yakınucu kutusunun kapağı.
    3. Yine lamelleri ters çevirin ve 24 kuyu çanak onları geri dönün. Lamelleri yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca (yeşil flüoresan boya konjuge edilmiş anti-tavşan ve kırmızı flüoresan boya konjuge edilmiş anti-fare, bloke edici tampon içinde seyreltilmiş burada) 150 ul ikinci antikor karışımı içinde inkübe. Lamelleri üç kez yıkayın.
      NOT: florofor-konjuge İkincil antikorlar duyarlı hafif. Adım sırasında ışıktan koruyunuz örnekleri 4.1.3-5.1.2.
  2. Aşama 2.1.2 tarif edildiği gibi, 10 dakika boyunca -20 ° C 'de 500 ul soğutulmuş metanol ile tekrar boyanmış RPE1 hücrelerin tespit anti-BrdU boyama için hazırlayın. Üç kez lamelleri yıkayın.
    Not: Bu tespit, takip eden basamakta asit hidroliz işlemi sırasında ilgili protein (ler), primer ve sekonder antikor etiketleme korur.
    1. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 2 N HCI, 200 ul hücreleri inkübe edin. 1 M Tris-Cl, 300 ul, pH 8, ile nötralizehücreleri yıkama tamponu kullanarak üç kez yıkayın d.
    2. Tekrar, oda sıcaklığında 30 dakika blokaj tamponunda 200 ul kullanarak hücreleri bloke eder.
    3. Nemli bir bölmede 37 ° C 'de 45 dakika boyunca (blokaj tamponu içinde seyreltilmiş) sıçan anti-BrdU antikoru ile inkübe hücreleri. 24 oyuklu tabağa geri lamelleri Dönüş yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat süre ile, 24-çukurlu tabak bloklama tamponu 150 ul seyreltilmiş mavi floresan boya konjuge edilmiş anti-fare ikincil antikoru (kuluçkalayın.
  3. Lamelleri üç kez yıkayın. Bir cam mikroskop lamı üzerine antifade reaktif içeren bir montaj çözümün bir damlacık (kabaca 3-6 ul) Nokta. Hücre tarafı montaj çözümü üzerine, aşağı bakacak şekilde, bir lamel haricindekileri. Yavaşça yumuşak doku temizleme kullanarak slayt karşı lamel basarak fazla sıvıyı silin. Mikroskop lamı üzerine mühür lamel kenarında şeffaf oje sürün.

5. Immünofloresan Görüntü EdinimEdinim ve Analizi

  1. Ortam sıcaklığında BrdU-pozitif RPE1 hücrelerinin görüntüler elde etmek için (1.4 sayısal diyafram ile) 100X Planı Apo immersiyon yağı hedefi kullanın.
    1. Dijital görüntüleme yapabilen bir kamera ile mikroskop ekli (donanım bakınız) bir slayt koyun. Her fluorofor için, manuel bir deney tüm örnekleri inceleyerek (tipik 300-1,000 msn arasında) uygun pozlama süresini belirler. Bir hücrenin görüntüleri almadan önce, elle Z-ekseni (genellikle 0.2 mikron adım boyutu) boyunca uygun üst ve alt odak düzlemi belirler. Bir dijital mikroskopi görüntüleme yazılımı paketi kullanarak Z-ekseni boyunca farklı floroforlar için aynı pozlama süresi ile ayrı lamelleri farklı örneklerin görüntüleri edinin.
  2. Z-ekseni boyunca elde edilen tüm resim yığınlarının (Yok komşu algoritması kullanarak bu durumlarda) dekonvulasyon gerçekleştirin.
    1. Boyunca her görüntü yığını toplam yoğunluk projeksiyonu eldeZ-ekseni.
  3. Sentrozomlar (iki sentrozomlarla arasındaki mesafe en az 2 mikron) yakın hücrelerde, hem sentrozomlarla etrafında küçük bir kare (yan başına tipik 20-30 piksel) çizmek ve seçilen alanı işaretleyin.
    1. İlk meydanı çevreleyen daha geniş bir kare (yan başına tipik 24-35 piksel) çizin ve büyük kare seçili alanı işaretleyin.
    2. Alan (A) ve her kutuya her floroforun toplam floresan yoğunluğu (F) elde (S küçük kutu gösterir ve L büyük kutu gösterir).
    3. . Howell ve ark 29 tarafından açıklanan formülü kullanarak her floroforun arka plan düzeltilmiş floresan yoğunluğu analiz: F = F S - [(F L - F S) S / (A L - A S) x].
    4. Bunu fl artalan-düzeltilmiş floresan yoğunluğu oranının hesaplanmasıyla ilgi (burada VDAC3 veya Sas6) proteinin normalize edilmiş floresan yoğunluğu elde edilir(Burada γ-tubulin, Sas6 veya Cep135) seçilen iç standart için kullanılan floroforun buna uorophore.
  4. Sentrozomlar iyi ayrılmış nerede hücreleri analiz durumunda, kutuların iki ayrı set çizerek ayrı ayrı centrosome analiz (iki sentrozomlarla arasındaki mesafe büyük 2 um daha). Her centrosome etrafında küçük bir kare (yan başına tipik 15-25 piksel) çizin ve seçilen alanı işaretleyin. İlk meydanı çevreleyen daha geniş bir kare (yan başına 20-30 piksel) çizin ve seçilen alanı işaretleyin.
    1. Alanı (A) ve her kutuya her fluorofor toplam floresan yoğunluğu (F) elde edilir, ve adım 5.3.3 tarif edildiği gibi, her bir sentrozom için ayrı ayrı her bir fluorofor arka düzeltilmiş floresan yoğunlukları hesaplamak.
    2. Bu hücredeki bu proteinin toplam centrosomal seviyesi elde etmek için, iki sentrozom her proteinin arka plan düzeltilmiş floresan şiddetleri birleştirin.
    3. Elde etmekİç standart toplam centrosomal yoğunluğu toplam centrosomal yoğunluğu oranının hesaplanmasıyla ilgili proteine ​​normalize şiddeti.
  5. Her deneysel koşul için en az 15-25 hücreleri analiz ve bir tablo grafiği çizmek.

6. Western Blot kullanma Toplam Protein Analizi

  1. 50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCl,% 1 Nonidet P-40,% 1 sodyum deoksikolat,% 0.1 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren (RIPA) tamponu radyoimmünopresipitasyon deneyinde hücreler yeniden süspanse edin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe hücreleri lize etmek için.
    1. 10 dakika için 10,000 x g'de santrifüjleyin Karışımı topak fraksiyonundan lizat ayrılması ve bir bisinkoninik asit (BCA) deneyi kiti kullanılarak her bir lizattan toplam protein konsantrasyonunun ölçülmesi.
  2. 4x SDS-PAGE yükleme tamponu (50 mM Tris-Cl, pH 6.8,% 2 SDS,% 10 gliserol, 100 mM ditiyotireitol,% 0.1 Brom ile lizat 40 ug karıştırın) Mavi ophenol.
    1. 10 dakika boyunca numune kaynatılır ve 200 V sabit gerilimde, SDS-PAGE, denatüre edici bir% 12.5 ile örnekleri çalıştırmak
  3. (Soğukta 1 saat süre ile 90 V sabit gerilim) Western lekeleme tekniği kullanılarak bir nitroselüloz zar üzerine, SDS-PAGE üzerinde ayrılmış proteinler aktarın.
    1. 1x PBS içinde% 3 yağsız süt ile bloke membran ve daha sonra 1 için (bu durumda, tavşan anti-VDAC3, tavşan anti-γ-tübülin ve fare anti-α-tübülin bağında absorbe edilmemesi) ile seyreltildi birincil antikor çözeltileri ile membran inkübe oda sıcaklığında bir saat.
    2. Membrana PBS-T tamponu kullanılarak üç kez (çalkalama altında, her 5 dakika inkübasyon) yıkandıktan sonra (1x PBS ve% 0.2 Tween-20), yakın kızılötesi (IR), floresan boya konjuge edilmiş anti-tavşan oluşan bir karışım içinde membran inkübe ve 1 saat boyunca (PBS-T içinde seyreltilmiş) IR florasan boya konjuge edilmiş anti-fare ikincil antikorlar.
    3. Membranı üç kez yıkayın ve sonra kızılötesi f kullanarak bantları analiz membran taramaimmünoblot tespiti için uygun luorescence görüntüleme sistemi olmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bizim son çalışmalar VDAC3, mitokondriyal porinlerini 16,28 birinin yeni centrosomal lokalizasyonu ve fonksiyonu tespit. Bir VDAC3 özel bir antikor kullanılarak RPE1 hücreleri dahil olmak üzere birçok memeli hücrelerinin immün belirgin centrosomal boyama ve nispeten zayıf mitokondriyal boyanma gösterdi. Ayrıca centrosomal VDAC3 tercihen ana sentriolden ve endojen hem de centrosomal havuzu ile ilişkili ve ektopik VDAC3 bozulma 16 düzenlenir ifade olduğunu göstermiştir. Kantitatif I...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Hücre biyolojisinde Kantitatif mikroskopi yaygın sabit farklı nicel mikroskopi deneyleri gelişmekte hücre biyologları artan örnekler vardır, vb Ancak, (sıkı bağlamak) Photobleaching sonra böyle Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET), Floresan Kurtarma gibi canlı hücre görüntüleme deneyleri ile ilişkilidir Son yıllarda 27,34-36 hücreler. Önemlisi, sentrozom biyoloji anlamada ilerleme genellikle centrosomal havuzları diğer havuzlar daha farklı düzenlenebilir proteinlerin cen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors declare that they have no competing financial interests.

Teşekkürler

This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
FibronectinSigmaF8141Stock of 1 mg/ml in water
DMSOSigmaD2650
MG115SigmaSCP0005Stock of 10 mM in DMSO
BrdUSigmaB5002Stock of 10 mM in DMSO
Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)SigmaT 65571:200 in IIF blocking buffer 
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) Aviva Systems BiologyARP35180-P0501:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal) Santa cruz biotechnologysc-814311:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)Abcamab-750051:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal) Abcamab63261:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)Life technologiesA210931:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212021:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212031:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212061:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212071:1,000 in IIF blocking buffer
Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal)SigmaT51921:1,000 in WB blocking buffer
Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)SigmaT90261:20,000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Life technologiesA100431:10,000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW ConjugatedRockland antibodies610-731-0021:10,000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent Life technologiesS36936Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1Fisherbrand12-545-80
Olympus IX-81 microscopeOlympus
Retiga ExiFAST 1394 IR cameraQImaging 32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objectiveOlympus1.4 numerical aperture
Slidebook software packageIntelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging SystemLi-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assayThermo Scientific23227
U-MNU2 Narrow UV cubeOlympusU-M622Filter
U-MNU2 Narrow Blue cubeOlympusU-M643Filter
U-MNU2 Narrow Green cubeOlympusU-M663Filter

Referanslar

  1. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  2. Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
  3. Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
  4. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
  5. Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
  6. Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
  7. Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9(2011).
  8. Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976(2009).
  9. Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
  10. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
  11. Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
  12. Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
  13. Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
  14. Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
  15. Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
  16. Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
  17. Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
  18. Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
  19. Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
  20. Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
  21. Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
  22. Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
  23. Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287(2002).
  24. Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291(2011).
  25. Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
  26. Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
  27. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
  28. Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
  29. Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
  30. Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
  31. Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
  32. Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
  33. Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
  34. Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
  35. Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
  36. Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
  37. Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
  38. Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
  39. Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
  40. Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
  41. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  42. Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

H cresel BiyolojiSay 94Sentrozom montajh cre d ng scentrosomal bozulmakantitatif floresan mikroskopinormalizasyonVDAC3BrdU darbe kovalamaca

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır