JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Аннотация

Центросомах небольшие, но важные органеллы, которые служат в качестве полюсов митотического веретена для поддержания геномной целостности или собирают первичные реснички, чтобы облегчить сенсорные функции в клетках. Уровень белка может регулироваться по-разному в центросомах, чем в других местах .cellular, а изменение в центросомного уровне нескольких белков в различных точках клеточного цикла, как представляется, имеет решающее значение для надлежащего регулирования центриолей сборки. Мы разработали количественный анализ флуоресцентной микроскопии, который измеряет относительные изменения в уровне белка на центросомах в фиксированных клеток из различных образцов, например, в различных фазах клеточного цикла или после обработки различными реагентами. Принцип этого теста заключается в измерении фона исправлены интенсивность флуоресценции, соответствующую белку в небольшой области, и нормализуют что измерение по сравнению с аналогичным по другим белком, который не меняется в соответствии с выбранным экспериментальным Condition. Используя этот анализ в сочетании с BrdU импульса и стратегии погони изучения невозмущенных клеточных циклов, мы количественно подтверждено наше наблюдение, что в последнее время центросомных пул VDAC3 регулируется на центросомах во время клеточного цикла, скорее всего, от протеасомы-опосредованной деградации конкретно на центросомах.

Введение

Центросомах состоят из пары центриолей, окруженных pericentriolar материала (ИКМ). Будучи основным микротрубочек организующих центров (MTOCs) в клетках млекопитающих, Центросомы служить как два полюса митотических веретен в делящихся клетках, и, таким образом, помогают поддерживать геномную целостность 1. В покоящихся клетках (например, при G0 фаза), один из двух центриолей центросомы, а именно материнской центриоли, превращается в базальной тела, чтобы собрать первичную ресничку, сенсорный органеллы, выступающий из клеточной поверхности 2. После того, как клетки повторно ввести в клеточный цикл, первичной реснички разобранном и каждый центриоль направляет сборку procentriole на ее проксимальном конце, который постепенно удлиняется с образованием зрелого центриоль 3. В начале S-фазы, колесом, как структура, которая обеспечивает 9-кратной симметрии к центриоли образуется на поверхности каждой существующей центриоли и станет основой каждого procentriole. Sas6 тшляпа является необходимым условием для центриоль сборка на работу, чтобы сформировать ступицу колесом 4-6. Другие центриолярных белки затем собираются на колесом в очень регулируется, проксимальнее дистальной образом 7. После точно завершения центриоли дублирования, клетки собрать дополнительные pericentriolar материалы, чтобы построить две функциональные центросомами к концу фазе G2 8. В дополнение к основным центриолярных компонентов 9-11, несколько других белков, включая киназы, фосфатазы, сопровождающих, компонентов строительных лесов, мембранные, связанных белков и деградации техники связаны с центриолей, базальных тел и PCM в разное время клеточного цикла 12-16. Часто отмечается, что центросомной уровни многих белков временно регулируются центросомных механизмов обеспечения адресности и / или деградации протеосомной на центросомах. Важно отметить, что колебания в центросомной уровне нескольких белков, таких как Plk4, Mps1, Sas6 и CP110 ат различные точки клеточного цикла, как представляется, важно, чтобы регулировать центриоль узел 5,17-22, а в случае Mps1 предотвращения этого центросомных деградации приводит к образованию избыточных центриолями 19. С другой стороны, центросомных фракции нескольких белков менее лабильным сравнению с цитозольных бассейнов. Например миРНК опосредованного вниз регулирования ЦентрИН 2 (Cetn2) привело к лишь умеренное снижение уровня белка в центриолей, несмотря на сильное снижение во всем его уровням клеток 23. Поэтому очень важно, чтобы измерить изменения в уровне центросомных белков на центросома, а не измерения целые уровни белка клеток при оценке их центросомой определенные функции.

В этом исследовании мы разработали анализ с использованием непрямой иммунофлюоресценции (IIF) для количественной оценки относительного уровня белка в центросомах. Этот анализ разработан особенно для анализа клеток, которые из разных образцови, таким образом, не могут быть отображены одновременно. Эти образцы могут быть клетки, которые обрабатывали различными реагентами (например, препарат по сравнению с контролем), собранных в различные моменты времени (то есть, по сравнению с импульсным погоне), или находятся в различных фазах клеточного цикла. Принцип этого теста заключается в измерении фона исправлены интенсивность флуоресценции, соответствующую белку в небольшой области и нормализовать это значение по сравнению с аналогичным по другим белком, уровни не изменяются при выбранных условиях эксперимента. Несколько исследований в биологии центросом недавно использованы различные количественные методы микроскопии, в обоих живых или фиксированных клеток, чтобы определить, центросоме-специфической функции белков-кандидатов 24-27. Как и в этих анализах, настоящая методика также измеряет фона исправлены интенсивности флуоресценции исследуемого белка. Тем не менее, включение нормализации с использованием внутреннего стандарта в этом анализе будет скорее всего больше предложитьточность и уверенность в анализе двух различных образцов, которые находятся на двух разных покровные. Кроме того, в дополнение к рассмотрении уровня белка в центросомах, с незначительными изменениями этот метод может быть применен к разнообразным набором экспериментальных условиях или в других клеточных сайтов.

Здесь мы объединим наши количественные микроскопии анализа со стратегией импульса погони BrdU сравнить клетки от различных стадий клеточного цикла. Вместо того, чтобы, используя стандартные ареста и освобождения клеточного цикла методы, чтобы изучить различные моменты времени клеточного цикла, асинхронно растущих клеток инкубируют с BrdU, чтобы маркировать клетки в S-фазе, и меченые клетки преследовали в течение различного времени (как правило, 4-6 ч). Большинство из меченых клеток будет в S-фазе непосредственно после импульса. Длина погоне выбрана так, что после того, как в погоне, меченые клетки будут в конце S, G2, или митоза, которые могут быть проверены с помощью морфологических характеристик, таких AS-положении центросомах по отношению к NUCлей, расстояние между центросомах, конденсации хромосом и т.д. Таким образом, длина погоне зависит от средней продолжительности S, G2 и M фазе конкретного типа клеток. Так как этот подход позволяет избежать ингибиторы клеточного цикла, такие как гидроксимочевина, aphidicolin, нокодазолом и т.д., что позволяет более физиологически значимого анализа клеточного цикла.

Таким образом, мы демонстрируем, что количественный флуоресцентной микроскопии в одиночку анализ, или в сочетании с BrdU импульса погони анализа, является простой, но мощный метод для точного измерения относительных изменений в центросомной уровня белка-кандидата во время невозмущенной клеточного цикла. Мы измерили центросомной уровень VDAC3, белка, который мы недавно были определены на центросомах в дополнение к митохондриях 16,28, используя эти анализы. Результаты, полученные здесь, проверить наш предыдущее замечание, что центросомной бассейн VDAC3 регулируется деградации, а также меняется в dependen клеточного циклат манера 16, кроме того, проверки применимости этого метода.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Культура клеток

  1. Используйте теломеразы человека обратной транскриптазы (hTERT) увековечил эпителиальных пигментных клеток сетчатки (hTERT-RPE1; именуемый здесь RPE1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: RPE1 клетки почти диплоидные, без культурах трансформированных клеток человека, которые обычно используются для изучения центриолей сборку и ресничек. Эти клетки имеют нормальное центриоли цикл дублирования согласованный с регулируемой клеточного цикла.
  2. Прохождение почти сливающийся 100 мм клеточной культуры блюдо RPE1 клеток в отношении 1: 5 разбавлении исходного культуры в свежую 100 мм чашку, содержащую 10 мл DME / F-12 (1: 1), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 Ед / мл пенициллина G и 100 мкг / мл стрептомицина (полную среду называют как DME / F-12 среду). Рост клеток при 37 ° С в присутствии 5% СО 2.
    1. Инкубируют 12 мм круглые покровные стекла в 50 мл 1 N HCl в закрытый стекл нный стакан, O / N без встряхивания при 60 ° С на водяной бане или инкубатора.
    2. Мтер отбрасывая раствор кислоты, мыть покровные три раза в 100 мл дистиллированной воды путем инкубации в течение 15 мин при периодическом встряхивании. Повторите промывание аналогично в 70% этанола и 95% этанола.
    3. Высушите покровные индивидуально распространения их на лабораторное промокательной бумаги в шкафу биобезопасности, с последующей стерилизацией УФ-излучением в течение 60 мин.
  3. Поместите 2-4 сухих покровных в 35 мм культуры клеток блюда. Развести раствор фибронектина или фибронектин, как инженерии полимера (концентрации запас 1 мг / мл) до концентрации 25 мкг / мл в культуре клеток PBS.
    1. Поместите 80-100 мкл разбавленного раствора на каждый покровное и инкубировать в течение 60 мин, чтобы покрыть верхнюю сторону покровное. Вымойте покровные три раза с помощью PBS перед добавлением полной среды.

2. растущих клеток и обработке клеток протеасома ингибиторов

  1. Прохождение 2 х 10 5 асинхронно растиING RPE1 клеток в каждой 35 мм блюдо с покровные и расти клетки в 2 мл полной среды. Замените культуральной среде каждые 24 ч со свежими подогретого полной среде.
    1. Для анализа влияния ингибирования протеасом на центросомной уровне тестового белка (здесь VDAC3 или γ-тубулина), растут клетки в двух 35-мм блюд на 44 часов. Заменить культуральную среду с полной среде и добавить либо MG115 или ДМСО в качестве контроля растворителя при конечной концентрации 5 мкМ или 0,05% соответственно. В то же время, добавление BrdU в клетки в конечной концентрации 40 мкМ и инкубировать клетки в течение 4 ч.
    2. Передача каждого покровное в 24-луночный планшет. Добавить 500 мкл охлажденного метанола в каждую лунку и инкубируйте при температуре -20 ° С в течение 10 мин, чтобы зафиксировать клетки на покровных стеклах. Немедленно промыть покровные три раза 500 мкл промывочного буфера (1X PBS, содержащий 0,5 мМ MgCl 2 и 0,05% Тритон Х-100).
  2. Урожай остаточнаяКлетки от 35 мм чашку и центрифуги клетки при 1000 х г в течение 5 мин. Используйте осадок клеток для анализа общего белка по вестерн-блоттинга (шаг 6).

3. BrdU импульса и Чейз Анализ Анализировать уровни белка в разных фазах клеточного цикла

  1. Для анализа изменения уровня белка (здесь VDAC3, Sas6 или Cep135) на центросомах на разных фазах клеточного цикла, роста клеток в двух 35-мм блюд, содержащих покровные для 44 часов. Заменить культуральную среду с полной среде, содержащей 40 мкМ BrdU и инкубировать клетки в течение 4 ч в инкубаторе для клеточных культур.
  2. С одной тарелки, передавать покровные в 24-луночный планшет для фиксации клеток с использованием охлажденного метанола, как описано выше в стадии 2.1.2.
  3. После BrdU импульса 4 ч, удалить BrdU-содержащий носитель, промыть клетки один раз PBS и один раз с полной среде, добавляют свежую среду, а затем растут клетки в отсутствие BrdU в течение различного времени (обычно другим 4 чДля RPE1 клеток) до фиксации клеток, как описано в стадии 2.1.2.
    Примечание: Для RPE1 клеток, большинство из BrdU-положительных клеток в конце S или G2-фазы после 4 ч погоне. Это должно быть определено независимо для каждого типа клеток.

4. Иммуноокрашивание

  1. Инкубируйте фиксированные клетки на покровных стеклах в 200 мкл блокирующего буфера (2% BSA и 0,1% Тритон Х-100 в 1x PBS) в течение 30 мин.
    1. Инкубируйте клетки с соединением первичных антител (как правило, один поднял у кролика, а другой поднят в мыши) разводили в блокирующем буфере O / N при 4 ° С во влажной камере.
    2. Для того, чтобы влажной камере, положить влажное бумажное полотенце в нижней половине пустого 1000 мкл кончика пипетки коробке. Lay полоску парафильмом на поверхности стойки, и определить каплю (15-20 мкл) раствора антитела на пленке в течение каждого покровное быть инкубировали. Обратить покровное на капли раствора антител (так, что клетки погружаются) и близкоКрышка коробки наконечника.
    3. Обратить покровные снова и вернуть их обратно в 24-луночного блюдо. Промыть покровные, а затем инкубируют их в 150 мкл смеси вторичного антитела (здесь зеленый флуоресцентный краситель-конъюгированного антитела против кроличьего и красный флуоресцентный краситель-конъюгированного антитела против мышиного разводили в блокирующем буфере) в течение 1 ч при комнатной температуре. Вымойте покровные три раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: флуорофорные-сопряженных вторичные антитела к свету. Защитите образцы из света во время шагов 4.1.3-5.1.2.
  2. Подготовка к анти-BrdU окрашивание с помощью фиксации окрашенные клетки RPE1 раз с 500 мкл охлажденного метанола при -20 ° С в течение 10 мин, как описано в стадии 2.1.2. Вымойте покровные три раза.
    Примечание: Это крепление обеспечивает первичную и вторичную маркировку антител белка (ов), представляющие интерес в процессе кислотного гидролиза на следующей стадии.
    1. Инкубируйте клетки в 200 мкл 2 N HCl в течение 30 мин при комнатной температуре. Нейтрализовать с 300 мкл 1 М Трис-Cl, рН 8бы мыть клетки три раза, используя промывочный буфер.
    2. Блок клетки снова с помощью 200 мкл блокирующего буфера в течение 30 мин при комнатной температуре.
    3. Инкубируйте клетки с анти-крысиного BrdU антителами (разбавленный в блокирующем буфере) в течение 45 мин при 37 ° С во влажной камере. Возвращение покровные обратно в чашке 24-а, промыть их и затем инкубируют с красителем конъюгированного анти-крыс вторичными антителами синего флуоресцентного (разведенного в 150 мкл блокирующего буфера в 24-луночных блюдо в течение 1 ч при комнатной температуре.
  3. Вымойте покровные три раза. Найди капли (примерно 3-6 мкл) монтажной раствора, содержащего antifade реагента на предметное стекло микроскопа. Обратить покровное, с сотового стороной вниз, на монтажной решения. Протрите лишнюю жидкость, слегка нажав покровное против скольжения с помощью мягкой чистки ткани. Применение прозрачного лака для ногтей по краю покровного стекла, чтобы запечатать его на предметное стекло микроскопа.

5. Иммунофлуоресценции изображения Acquisition и анализ

  1. Использование 100X Plan Apo масла иммерсионный объектив (с числовой апертурой 1,4), чтобы получить образы BrdU-положительных клеток RPE1 при температуре окружающей среды.
    1. Положите слайд на микроскопе (см оборудования), который прилагается с камерой, способной цифровых изображений. Для каждого флуорофора, определить подходящее время экспозиции (как правило, между 300-1000 мс) вручную изучения всех образцов эксперимента. Перед получения изображения клетки, вручную определить соответствующий верхний и нижний фокальной плоскости вдоль оси Z. (обычно 0,2 мкм размера шага). Получение изображений различных образцов, которые находятся на отдельных стеклах с использованием идентичных времени экспозиции для различных флуорофоров вдоль Z-оси с помощью цифровой пакет программного обеспечения обработки изображений микроскопии.
  2. Выполните деконволюции (в этих случаях не с помощью алгоритма, сосед) всех стеков изображения, полученных по Z-оси.
    1. Получить полную проекцию интенсивности каждого стека изображения поZ-оси.
  3. В клетках, где Центросомы близких (расстояние между двумя центросомах составляет менее 2 мкм), нарисуйте маленький квадрат (обычно 20-30 пикселей с каждой стороны) вокруг обеих центросом и отметьте выбранную область.
    1. Нарисуйте большую площадь (как правило, 24-35 пикселей с каждой стороны), окружающий первый квадрат и отметьте выбранную область большого квадрата.
    2. Получить область (А) и суммарную интенсивность флуоресценции (F) для каждого флуорофора в каждой коробке (S обозначает небольшую коробку и L обозначает большую коробку).
    3. Анализ фона исправлены интенсивности флуоресценции каждого флуорофора по формуле, описанной Howell и др 29:. F = F S - [(F L - F) × A S / (а L - S)].
    4. Получение нормированной интенсивности флуоресценции белка, представляющего интерес (здесь VDAC3 или Sas6) путем расчета отношения фонового коррекцией интенсивности флуоресценции ее FLuorophore к тому, что флуорофора, используемого для выбранного внутреннего стандарта (здесь γ-тубулина, Sas6 или Cep135).
  4. В случае анализа клетки, где Центросомы хорошо разделены (расстояние между двумя центросомах больше, чем 2 мкм), анализировать каждый центросому отдельно рисунок двух отдельных наборов коробок. Нарисуйте небольшой квадрат (обычно 15-25 пикселей с каждой стороны) вокруг каждого центросома и отметьте выбранную область. Нарисуйте большую площадь (20-30 пикселей на каждой стороне), окружающий первый квадрат и пометить выделенную область.
    1. Получение область (А) и суммарную интенсивность флуоресценции (F) каждого флуорофора в каждой коробке, и вычислить фоновые исправлены интенсивности флуоресценции каждого флуорофора, отдельно для каждого центросоме, как описано в стадии 5.3.3.
    2. Зерноуборочный фоновые исправлены интенсивности флуоресценции каждого белка из двух центросом, чтобы получить общее центросомных уровень этого белка в этой ячейке.
    3. Получитьнормированной интенсивности для интересующего белка путем расчета отношения от общего центросомного интенсивности к суммарной интенсивности центросомного внутреннего стандарта.
  5. Анализ по крайней мере, 15-25 клеток для каждой экспериментальной состоянии и построить график в таблице.

6. Анализ общего белка с помощью Вестерн-блоттинга

  1. Ресуспендируют клеток в анализе радиоиммуноосажден (РИПА) буфера, содержащего рН 50 мМ Трис-HCl, 8 150 мМ NaCl, 1% Nonidet Р-40, 1% дезоксихолат натрия, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) и инкубируют в течение 10 мин на льду чтобы лизировать клетки.
    1. Центрифуга смеси при 10000 х г в течение 10 мин, отделить от лизата гранулы фракции и измерить общую концентрацию белка каждого лизата с использованием бицинхониновой кислоты (BCA) набора для анализа.
  2. Смешайте 40 мкг лизата с 4-кратным SDS-PAGE загрузки буфера (50 мМ Трис-Cl, рН 6,8, 2% SDS, 10% глицерина, 100 мМ дитиотреитола, 0,1% бромвичophenol синий).
    1. Отварить образцы в течение 10 мин и запуска образцов на 12,5% денатурирующих SDS-PAGE при постоянном напряжении 200 В.
  3. Передача белков, разделенных на SDS-PAGE на нитроцеллюлозную мембрану с использованием Вестерн-блоттинга техники (при постоянном напряжении 90 В в течение 1 ч в холодной).
    1. Блок мембраны с 3% обезжиренным молоком в PBS 1x, а затем инкубируют мембрану с разбавленными растворами первичных антител (в данном случае анти-кролик VDAC3, кролик анти-γ-тубулина и мыши анти-α-тубулина) в течение 1 ч при комнатной температуре.
    2. После промывки мембраны три раза (каждый 5 мин инкубации при встряхивании) с помощью PBS-T (буфер 1X PBS и 0,2% Твин-20), инкубируют мембрану в смеси ближней инфракрасной (ИК) флуоресцентным красителем конъюгированного анти-кролик и ИК флуоресцентный краситель конъюгированные анти-мышиные вторичные антитела (разбавленный в PBS-T) в течение 1 ч.
    3. Вымойте мембраны три раза, а затем сканировать мембраны для анализа полосы с помощью инфракрасного Fluorescence система визуализации подходит для обнаружения иммуноблот.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Наши недавние исследования выявили новый центросомной локализацию и функцию VDAC3, один из митохондриальных поринов 16,28. Иммуноокрашивание нескольких клетках млекопитающих, включая RPE1 клеток с использованием VDAC3-специфические антитела показали заметную центросомной окрашивание...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Количественный микроскопии в клеточной биологии обычно ассоциируется с анализами изображений живых клеток, таких как флуоресцентного резонанса передачи энергии (FRET), флуоресцентная Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP), и т.д. Однако, там растут примеры клеточных биолого?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
FibronectinSigmaF8141Stock of 1 mg/ml in water
DMSOSigmaD2650
MG115SigmaSCP0005Stock of 10 mM in DMSO
BrdUSigmaB5002Stock of 10 mM in DMSO
Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)SigmaT 65571:200 in IIF blocking buffer 
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) Aviva Systems BiologyARP35180-P0501:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal) Santa cruz biotechnologysc-814311:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)Abcamab-750051:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal) Abcamab63261:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)Life technologiesA210931:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212021:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212031:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212061:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212071:1,000 in IIF blocking buffer
Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal)SigmaT51921:1,000 in WB blocking buffer
Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)SigmaT90261:20,000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Life technologiesA100431:10,000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW ConjugatedRockland antibodies610-731-0021:10,000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent Life technologiesS36936Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1Fisherbrand12-545-80
Olympus IX-81 microscopeOlympus
Retiga ExiFAST 1394 IR cameraQImaging 32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objectiveOlympus1.4 numerical aperture
Slidebook software packageIntelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging SystemLi-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assayThermo Scientific23227
U-MNU2 Narrow UV cubeOlympusU-M622Filter
U-MNU2 Narrow Blue cubeOlympusU-M643Filter
U-MNU2 Narrow Green cubeOlympusU-M663Filter

Ссылки

  1. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  2. Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
  3. Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
  4. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
  5. Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
  6. Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
  7. Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9(2011).
  8. Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976(2009).
  9. Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
  10. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
  11. Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
  12. Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
  13. Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
  14. Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
  15. Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
  16. Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
  17. Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
  18. Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
  19. Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
  20. Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
  21. Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
  22. Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
  23. Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287(2002).
  24. Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291(2011).
  25. Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
  26. Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
  27. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
  28. Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
  29. Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
  30. Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
  31. Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
  32. Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
  33. Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
  34. Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
  35. Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
  36. Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
  37. Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
  38. Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
  39. Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
  40. Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
  41. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  42. Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

94VDAC3BrdU

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены