Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Özet

Bu tam hücre patch-kelepçesi ve fare beyin, akut doku dilimleri dendrit ve hipokampal nöronlar dikenler Hücre içi sodyum transient çoklu foton görüntüleme ile, nöro-aktif bileşiklerin fokal UV uyarımlı foto-aktivasyon kombinasyonunu tarif eder.

Özet

Çoklu foton floresan mikroskopi yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip sağlam doku beyin hücrelerinin morfolojik ve fizyolojik parametrelerin analizini sağladı. Elektrofizyoloji ile birlikte, yaygın olarak dendrit ve dendritik dikenler gibi küçük subselüler bölümlerinde etkinlik ile ilgili kalsiyum sinyalleri incelemek için kullanılır. Kalsiyum geçici ek olarak, sinaptik etkinliği de postsinaptik sodyum sinyalleri, sadece marjinal anlaşılmalıdır ki özelliklerini neden olur. Burada, merkezi nöronların hücre mikro etki kombine tam hücre patch-kelepçesi ve çoklu foton sodyum görüntüleme için bir yöntem tarif eder. Ayrıca, doku, glutamat reseptörlerinin, güvenilir ve fokal hareketliliğe olanak tanıyan, ultra viyole (UV) ışığı-glutamat kaynaklı uncaging için modifiye edilmiş bir prosedürü getirmektedir. Bu amaçla, tam-hücre kayıtları cornu ammonis alt bölüm 1 (CA1) akut doku dilimleri piramidal nöronlar üzerinde gerçekleştirilmiştirFare hippocampusu. Nöronlar yama pipet ile sodyum duyarlı floresan boya SBFI ile dolu, ve SBFI çoklu foton uyarma dendritler ve komşu dikenler görselleştirme sağlanmıştır. UV yol açtığı fokal uncaging oluşturmak için, ışık yoğunluğu, UV ışın Uncaging etkilenen hacmi, ışının pozisyonu ile kafesli bileşik konsantrasyonuna dahil olmak üzere birçok parametre olarak test edilmiş ve optimize edilmiştir. Bizim sonuçlar kafesli glutamat (MNI-Glutamat) ile yerel perfüzyon ve dendritler ve dikenler içe akımlar ve sodyum geçici onun odak UV-Uncaging sonuç gösterebilir. Bir zaman ve içeri doğru akımlar ve sodyum sinyalleri hem genlik Uncaging palsın süresi ile ilişkilidir. Ayrıca, sonuçlar, bu yolun da sodyum girmesi aracılık ettiğini gösteren hücre içi sinyaller sodyum iyonotropik glutamat reseptörleri için bloker varlığında bloke olduğunu göstermektedir. Özetle, bizim yöntem için güvenilir bir araç sağlarsağlam beyin dokusunda fokal reseptör aktivasyonu tarafından uyarılan hücre içi sodyum sinyallerinin incelenmesi.

Giriş

Bu tür çoklu foton mikroskopi gibi hafif mikroskobik tekniklerindeki son gelişmeler, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip sağlam doku beyin hücrelerinin morfolojik ve fizyolojik parametrelerin çalışma sağlamıştır. Elektrofizyoloji ile birlikte, bu teknikler artık yaygın yani ince dendritler ve dendritik dikenler, küçük subselüler bölümlerinde nöronlar üzerinde etkinlik ile ilgili elektrik sinyalleri yanı sıra eşlik eden kalsiyum sinyalleri analiz etmek için kullanılır. Kalsiyum geçici ek olarak, sinaptik etkinliği de dendrit ve omurga içinde sodyum sinyalleri uyarır özellikleri büyük oranda araştırılmamıştır. Bu tür sinyaller [Na ^+] önemli boya ağartma veya foto-hasarı ^1,2 vermeden uzun süre _i Transientlerin on-line ölçüm sağlar hücre içi sodyum iki-foton görüntüleme ([Na ^+] _i) ile analiz edilebilir.

[Na ^+] _i görüntüleme için alt sadece birkaç kimyasal gösterge boya maddeleri, örneğin korona Yeşil veya Asante Sodyum yeşil ^3,4 mevcuttur. ^Na görüntüleme için en yaygın biçimde kullanılan flüoresan prob sodyum bağlayıcı benzofuran izoftalat (SBFI) 'dir. Bu iyi bilinen kalsiyuma duyarlı boya Fura-2'ye benzer bir oran ölçer, UV ile uyarılmış ve boya (örneğin, ^5,6), birçok hücre tipinde, geleneksel ^Na görüntüleme için kullanılmıştır. Heyecan verici boya ve floresan toplama farklı olasılıklar vardır. Yüksek temporal çözünürlük (yani yüksek görüntüleme kare hızı) mekansal bilgi ile birlikte gerekiyorsa, SBFI yüksek hızlı şarj ile tespit ksenon ark lambasından veya yüksek güç ışık yayan diyot (LED) cihaz ve emisyon ile heyecanlı olabilir -coupled cihaz (CCD) kamera ^7,8. Derin doku, maksimal uzamsal çözünürlük için, çoklu foton lazer tarama mikroskobu tercih ⁹ yöntemdir. Nispeten düşük kuantum efficie(- 2 mM 0.5) ve keskin bir mikroelektrot ¹⁰ veya yama pipet ¹ ile SBFI membran geçirmeyen biçiminin doğrudan yükleme SBFI arasında ncy nispeten yüksek boya konsantrasyonları gerektirir.

SBFI kullanarak, kemirgen hipokampus akut doku dilimleri yapılan önceki çalışmaları ağırlıklı olarak ^1,2 reseptörleri İyonotropik NMDA ile sodyum akını kaynaklanır CA1 piramidal nöronların dendrit ve dikenler etkinlik ile ilgili sodyum transientler gösterdi. Daha ayrıntılı olarak, yerel sodyum sinyallerin özelliklerinin çalışma için, reseptör agonistlerinin uygulanması ile postsinaptik reseptör özgü aktivasyon tercih edilen bir çok uygun bir yöntemdir. Presinaptik aktivite ve verici salınımını taklit etmek, uygulama nispeten kısa olması ve yerel uyarımı sağlamak için odaklı olmalıdır. Ancak bu, sağlam dokularda oldukça zor olduğu kanıtlanmıştır. Ince uçlu bir pipet kullanarak reseptör agonistlerinin lokal basınç uygulanması çok odak ap sağlarkatmer, ama (böyle bir dendrit ve dendritik dikenler gibi örneğin) ilgi yapısının hareketini üretmek için potansiyel risk barındıran ve böylece yüksek çözünürlüklü görüntüleme engellemektedir. Nöro-aktif maddelerin iyontoforez uygunluğu elektrik durumuna bağlıdır ve yüksek akım genlikleri, hem de hücresel eserler üretebilir.

Bu engelleri aşmak için bir yol fotoğraf aktive bileşiklerin ve bunların flaş photolysis istihdam olduğunu. Temel olarak iki farklı prensipler kafesli maddeler foto-aktivasyon için kullanılır: ¹² ile birlikte lazer tarama modülleri kullanılarak I) 'in geniş alan flaş fotoliz ve ¹¹ II)' fokal Uncaging. Geniş alan flaş potoliz ilgi geniş bölgelerini aktive etmek için kullanılır iken, örneğin bütün bir hücre, odak Uncaging özellikle küçük hücresel bölmeleri uyarmak için kullanılır. Bu çalışmada biz tüm hücre yama-kelepçe ve çok p bir prosedür göstermekDokuda, glutamat reseptörlerinin, güvenilir ve fokal hareketliliğe olanak tanıyan glutamat UV ışık kaynaklı uncaging, modifiye edilmiş bir prosedür ile birlikte dendrit ve merkezi nöron dikenler hoton sodyum görüntüleme.

Protokol

Bu çalışma sıkı Heinrich Heine Üniversitesi Düsseldorf, Almanya kurumsal kurallarına uygun, yanı sıra Avrupa Topluluğu Konseyi Direktifi (86/609 / EEC) yürütülmüştür. (: Ø52 / 05 kurumsal Sayılı Kanun'la) Tüm deneyler Heinrich Heine Üniversitesi Düsseldorf, Almanya Hayvan Bakımı ve Kullanımı Tesisi'nde Hayvan Refahı Dairesi tarafından tebliğ ve onaylanmıştır. Alman Hayvan Refahı Yasası uyarınca (Tierschutzgesetz, Madde 4 ve 7), beyin dokusunun postmortem kaldırılması için resmi bir ek onay gerekli.

Deney hayvanlarının Ötanazi, Lüksemburg: akut dilimleri nesil için, farenin yayımlanan Avrupa Komisyonu önerisi şu (decapitated hızla CO ₂ ile anestezi edildi ve Avrupa Toplulukları 1997 Resmi Yayınlar Ofisi; ISBN 92-827-9694 -9).

1. HazırlıkÇözümler

1. % 95 O ₂ ile fokurdatıldı 125 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 _CaCl2, 6 _MgCl2, 1.25 NaH ₂ PO _4, 26 _NaHCO3 ve 20 glikoz, (mM olarak) diseksiyon için yapay serebrospinal akışkan (ACSF) hazırlanması % 5 _CO2, 7.4 olan bir pH ile sonuçlanır.
2. (MM olarak) ihtiva eden deneyler için ACSF hazırlayın: 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 _CaCl2, 1 _MgCl2, 1.25 NaH ₂ PO _4, 26 _NaHCO3 ve% 95 _O2 ve% 5 CO2 ile kabarcıklandırılmış 20 glikoz, elde edilen 7.4 bir pH.
3. 150 KMeSO _3, 12.5 hidroksi etil-piperazin etan sülfonik asit (HEPES), 40 KCI, 5 NaCI, 1.25 etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 5 Mg-ATP, 0.5 Na: hücre içi çözelti (ICS), (mM olarak) hazırlanması GTP. 7.3 pH ayarlayın. -20 ° C'de 1 ml'lik alikotları saklayın.
4. Iki kere distile edilmiş su içinde sodyum bağlayıcı benzofuran izoftalat (SBFI) TUZ seyreltilir ve 5 ul alikotları hazırlamak10 mM'lik bir stok çözeltisi.
5. Çözülme ICS, 1 mM'lik bir son konsantrasyonda SBFI stok çözeltisi eklenmekte ve. Vortex ve mikro-süzüntü (0.22 mikron). Deneyde kullanılıncaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edin. Refreeze ve sadece bir gün için kullanmayın.
6. Çifte damıtılmış su içinde eritilmesi ile 50 mM glutamat MNI stok çözelti hazırlayın. Normal ACSF 5 mM'lik bir son konsantrasyona kadar MNI glutamat stok solüsyonu ile seyreltilir. Deneyde kullanılıncaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edin. Refreeze ve sadece bir gün için kullanmayın. Derhal -20 ° C 'de, deneyde kullanılan olmayan mağazası alikotları.

Doku 2. Diseksiyon

Not: kemirgen beyin akut hipokampal dilimler hazırlanması daha önce ^13,14 detaylı bir şekilde tarif edilmiştir. Kısaca aşağıdaki protokol bu çalışmada kullanılmıştır.

1. Başlarının kesilmesi işleminden sonra, hızlı bir şekilde kafatası beyin çıkarın.
2. Hemen bir petri beyin yerleştirinbuz-soğuk diseksiyon ACSF ile orta hat boyunca bir sagital kesim yaparak bir yarımkürede incelemek ve.
3. Bir engel yüzeyi olarak istenen yönde bir ikinci kesim gerçekleştirilmesi ve güçlü bir yapıştırıcı ile bir vibratome kesme aşamasına bu ekleyin.
4. Haznesi kesme ve soğutucu elemanın alın bölme beyin bölümü ile dondurucu ve yer kesme aşamasında üzerinden vibratome (her ikisi de, -20 ° C'de tutulur). Daha sonra oda içinde soğutma elementi koymak ve buz soğukluğunda diseksiyon ACSF doku daldırın. Hazırlanmasını stabilize etmek için, bir agar jeli ile doku bloğu karşı isteyebilir.
5. Vibratome ile hipokampus 250 mikron kalınlığında, parasagital dilim kesin. Tüm ACS sıvılar her zaman kabarmış emin olun.
6. Dilimleme sonra, normal ACSF ile bir çanak içinde bir ağ örgü üzerinde tutmak ve doku, 30 dakika boyunca 34 ° C'de inkübe edin. Daha sonra oda sıcaklığında tutulması.

Donanım 3. hazırlanması

-sayfa içinde
Şekil ışık yolları ve çoklu foton görüntüleme, lazer tarama UV flaş fotoliz ve elektrofizyoloji oluşan. Çoklu foton ışın (kırmızı) teçhizat deneysel kontrolünü gösteren 1. Şema darbeli bir ayarlanabilir kızılötesi (IR) lazer tarafından üretilen (Tisa). Bu lazer güç ve yönetim süresi denetimini etkinleştirmek hepsi mekanik bir deklanşör, bir Pockels 'hücre ve IR dedektörü (ışık yoğunluğu tespiti), geçer. Flip-in / flip-üzerinden isteğe lazer diyotu, bir lazer ışınının temel hizalanması için kullanılmaktadır. , Işın, çok geniş bir arka odak düzlemi ile objektif ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Uzaktan kontrollü önceden tekerlek ilave olarak veya bunun yerine bir lazer ışını gücünü kontrol etmek için Pockels hücresindeki kullanılabilir. Tarama kafası geçtikten sonra, darbeli kızılötesi ışık numunesine yönlendirilir. Emitted floresan ışığı (açık yeşil), harici veya dahili photomultiplier dedektörleri (PMT) yoluyla toplanır. Dış dedektörler tam bir yüksek frekans anahtarı (PMT kontrolör) ile iç PMT'lerin ile senkronize edilir. Uncaging kiriş (açık mavi) UV katı hal lazer (DPSS UV-Lazer) tarafından üretilir. Daha sonra, bir ışık kılavuzu ile epi-floresan kondansatörün üst arka galvo tahrik tarama birimi yöneliktir. Hassas konumlandırma Uncaging nokta veya alan (görüntüleme ve Uncaging ışını arasındaki renk sapmaları) görüntüleme yazılımından görüntü ihracat etkindir. Görüntüleme, elektrofizyoloji ve flaş fotolizini senkronizasyonu için zamanlama yönetimi elektronik olarak kontrol edilir. Transillüminasyonu dedektörü (TL-PMT) dokusu içinde pipet konumlandırma dokümantasyonu için ihtiyaç olduğunu. Kontrol birimleri ve değiştirilmiş görüntüleme sistemi, yazılım, kontrol ve diğer cihazları senkronize etmek için kullanılırSistemi çalıştırmak için gerekli. "Özel" yazarlar tarafından uyarlanan / tasarlanmış ve inşa edilmiş gibi sistem bileşenleri etiketlenmiş. Bazı bileşenler özel inşa çoklu foton sisteminin gereksinimlerini karşılamak için adapte edildi ve "değiştirilmiş" olarak etiketlenmiş. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

1. Çoklu foton sisteminin bileşenleri açın. Test ve kızılötesi lazer ışını hizalamayı.
   1. Yerine bir amacın merkezleme prizması çevirerek kontrol ışın konumlandırma. Kiriş yerinden ise, periskop yılında aynalar bunu yeniden ayarlayın. Prizmanın merkezleme düzlemi ise görüntüleme hedefi arka odak düzlemi olarak aynı seviyede olması gerektiğini unutmayın.
   2. Spektrometre açınız ve kirişin çoklu foton özelliklerinin kontrol edin.
   3. Aşağıdaki değerlere görüntüleme yazılımı parametreleri ayarlayın: Seçiniz(yüksek kare hızı ve yüksek uzaysal çözünürlüğü için sırasıyla 2.5 yakınlaştırma faktörü ile daha küçük klip kutuları) hücre bakış görüntüler için 512 x 512 piksel bir kare boyutu. Hızlı modu ve XYT tarama moduna ayarlayın görüntüleme hızı. Z-step sonra yapılan deconvolution için uzamsal örnekleme gereksinimlerini karşılamak için detaylı yığınlarının için 1 genel yığınları için mikron ve 0.2 mikron olmalıdır.
2. Ve fotoğraf-çarpanları (PMT) -: (16 μW ≈ 14 hedefi altında nihaî güç) Pockels 'hücre ayarlarını değiştirerek çoklu foton lazer ışını (790 nm) yoğunluğunu ayarlayın.
3. Açma ve objektif mercek altında floresan örnek slayt koyarak Uncaging sistemini kalibre.
   1. Dürbün kullanarak, UV optik odak ayarlamak ve mekansal UGA tarama kafasına odaklama birimi kullanılarak maksimum çapı 2 mikron arasında bir boyuta UV lazer nokta sınırlar.
   2. Uncaging ünite kontrol Softwar kalibrasyon rutin başlayınör.
      1. Floresan, bir CCD kamera ile elde edilir ise, bunun tarama aralığı içinde çeşitli noktalarına UV lazer ayarlayın. Her noktada UV lazer noktada tıklayarak, yazılım koordine belli bir karşılık için galvanik tarama aynalar konumlandırma ayarlayın.

Uyarma, emisyon ve Uncaging ışın yollarının özelliklerini gösteren Şekil 2. Ayrıntılı şeması. IR uyarma ışın (kırmızı) mikroskop epi-floresan kondansatör ve amacı için dosyalayıcı tarete düzeyde dikroik ayna birleştirerek ışın geçer Numuneyi ulaşır. Uncaging kiriş (mavi) tarama mil üniteyi odaklama kolimasyonu ve kiriş bir kuvars optik ışık fiberden ve sonradan yönlendirilirtarama biriminde rrors, kiriş birleştirme dikroik ayna bir dikroik aynayı geçer. Burada uyarım tarama kiriş ile birleştirilmiştir. Örnekten yayılan ışık görüntü tarama kafasına doğru ters yönde eksitasyon taraması, ışın yolunun yolunu izler. Kamera yama pipet görsel kontrolü için ve odaklı lazer tarama mikroskobu ile kombinasyon halinde Uncaging kirişin konumlandırma için kullanılabilir (gösterilmemiştir). Yeşil ışık yolu diğer uygulamalar ile kullanım olabilir isteğe bağlı epi-floresan aydınlatma temsil eder.

3. 2. 2. Fokal uygulamaları kazanmak için nokta modunda flaş potoliz sistemini kullanın. Emin olun (hedef altında ortalama güç: 0.55 mW) olması Uncaging ışınının odak ayarlaması çapı 1,5 um (xy uzantısı) bir nokta boyutu ile sonuçlanır z düzeyinde yerleştirilmiş bir floresan slayta ortaya olarak tekabül Dokudilim (gösterilmemiştir).
   3. Uncaging nokta doğru konumlandırma uncaging- ve görüntüleme-bilgisayar arasında bir ağ bağlantısı üzerinden görüntüleme sisteminin bir görüntünün ithalat ile elde edilir.
      1. Bir ekran kapmak yazılımı kullanarak, sürekli görüntüleme yazılımı (yerine kamera besleme) çerçeveleri okumak ve örtüşecek görüntüleme ve Uncaging çerçeveleri ayarlayın. Flaş ünitesinin içine bir referans görüntü tüm deney sırasında uygun ayarı sağlamak için görüntüleme yazılımı her ^10. kareyi ihracat.

Şekil Uncaging nokta 3. Ayarı: tam Uncaging nokta, Uncaging yazılım (yeşil çerçeve) ithal edilir görüntüleme yazılımı (sarı çerçeve) bir ekran görüntüsü konumlandırmak için.Tüm CA1 piramidal hücre (doymuş piksel: siyah pikseller, kırmızı, mavi) sarı çerçeve içinde sol görüntü bir Hi-Lo kodlu görüntüyü temsil eder. Görüntü Uncaging yazılımı (yeşil bir "X" ler) in kalibrasyon ızgara tarafından örtülmektedir. Sağında, hücrenin büyütülmüş bir parçası Kaplanmış Uncaging nokta (kırmızı çapraz) ile gösterilir. Sarı nokta Uncaging kirişin otomatik olarak üst üste görüntü. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

4. Hedef bölgeye kafesli bileşiğin teslimat için mikromanipülatörler, elektrofizyoloji bileşenleri ve basınç uygulama cihazı açın.
5. Kafesli bileşiklerin lokal perfüzyon için bir odak basınç uygulama cihazı takın. Bu maddelerin Banyo perfüzyonu ile karşılaştırıldığında, bu son derece maliyetlerini azaltacaktır. AC bir nefes önlemek için belirli bir atmosfer basıncına tutan basınç ayarlamaIçine SF veya uygulama pipetle kafesli maddelerin kaçak.
   NOT: basınç uygulama cihazı pipet tutucu son derece hassas ve ultra hızlı mikro-valf ev sahipliği yapıyor. Bu minimum uygulama basınçların kullanılması mümkün kılar ve bu nedenle kafesli bileşiği ile perfüzyon sırasında yerel minimum hareket dıştan müdahale ürünlerini indirgemektedir.
6. Yangın cilalı borosilikat cam kılcal damarları kullanarak tüm hücre yama kelepçe ve yerel perfüzyon için pipetler çekin. Pipetler ~ 1 um'lik bir uç çapına ve R ≈ 3 MW _(K-3 mezo merkezli, ICS ile tespit edilmiş değerlerin) bir dirence sahip olmalıdır.
7. Yer deneysel banyosunda dilim ve bir ızgara ile yapıştırın (Şekil 4A, B) (250 mikron kalınlığında platin çerçeve, cerrahi iplikler ile yayılmış 40 mikron od). Dilim transferi için (kırık ucu tarafında emme topu) bir ters, ucu kırık ve yangın cilalı Pasteur pipet kullanın. Bükme ve dilimin herhangi bir diğer sert taşıma kaçının.

Şekil mikroskop aşamada deney banyo ve banyo konumlandırma 4. Bileşenleri (A). Deney banyosu Manyetik metal halkayla çevrelenmiş olduğu bir banyo cebin (mavi kare) oluşur. Boru tuzlu su (ACSF) ile banyo sürekli perfüzyon sağlar. Basılı tutun ve dilim düzeltmek için ızgara banyo odasına konur. Banyo odasının içinde konumlandırılmış (B) Akut dilim hazırlık. Dilim ızgara parçacıkları tarafından tespit edilir. (C) Konumlandırma ve mikroskop aşamada deneysel banyo geometri deneyler sırasında.

8. ACSF dilim serpmek kalıcı mikroskop aşamada banyo yerleştirin ve.

4. Tüm hücre Patch-sıkma

1. SBFI içeren ve kafesli bileşik ile lokal perfüzyon pipet yüklemek ICS yükleyin yama pipet. İlgili mikromanipülatörler pipetler takın. Banyosunda referans elektrot yerleştirin. Eğer baş aşamasında (cf Şekil 4C) zarar vermemek için kalıcı topraklı emin olun.
2. Banyoya hem pipetler indirin ve hipokampal CA1 bölgesinde yukarıda koyun. ACSF ICS seyreltme önlemek için yama pipet (+40 mbar) hafif bir basınç uygulayın.
3. Elektrofizyoloji yazılımı kullanılarak yama pipet ofset potansiyelini dengeleyin.
4. IR-DIC Video mikroskopi kullanılarak yama pipet ile bir CA1 piramidal hücre yaklaşın. Giga-mühür elde edilinceye kadar nazik vakum uygulayın. Bir hücre, diğer taraftaki Uncaging ışınının bir taraftan düşük dağılma ve zayıflama ile sağlam hücre morfolojisi sağlamak için dilim yüzeyinin altında 30 -70 um arasında bulunduğu soma seçin.
5. Hızlı kapasitesini telafi. Arası membranE ve açık hücre bütün hücre yapılandırmasını kazanmak için.
6. Yavaş kapasite ve seri direnç için telafi eder.
7. Hücre görüntüleme bir deney başlamadan önce en az 30 dakika boyunca SBFI-ICS ile diyalize izin verin.

5. Çoklu-foton görüntüleme ve stimülasyon

Şekil 5. Deneysel protokol. Deney, (kırmızı işareti (ᴨ) ve kırmızı çizgi ile gösterilen) bir pals başlatmak için aynı anda görüntüleme (mavi), elektrofizyoloji (yeşil) ve kafesli yönetimini başlatmak için ayarlanır zaman noktası 0 sn bileşik (sarı). Bu ilk dönemde, görüntüleme kiriş tamamen (mavi ışık) soluk edilmelidir. 4.5 s (kesikli çizgi) sonra, kafesli bileşiğin lokal perfüzyon sonlandırılır ve görüntüleme demet kel ayarlanmalıdırveri toplama (mavi) için kral yoğunluğu. Sarı flaş gösterilen; 300 msn'den: 1.5 sn sonra (zaman noktası 6 sn), ikinci bir pals verilen UV flaş birimi (flaş süresini başlatır, (kırmızı işareti (ᴨ) ve kırmızı çizgi ile gösterilen) bir ) ve elektrofizyoloji ve görüntüleme protokolünde göstergesini belirler.

1. Aksiyon potansiyellerinin voltaj-kapılı sodyum kanallarının aktivasyonu ve oluşumunu önlemek için ACSF için Tetrodotoksin (TTX, 500 nM) ekleyin.
2. Çoklu foton uyarılması ile ve SBFI floresan edilen hücresel morfoloji görselleştirmek ve deney için bir dikenli dendrit seçin. Daha yüksek çözünürlükte görüntüler için büyüt ve dendrit etrafında bir klip kutusu yerleştirin.
3. Kafesli glutamat içeren 10 ul ACSF ile standart bir yama pipet doldurun. Basınç uygulama sistemi için pipet bağlayın ve micromanipulator takın.
4. Dendritin yakın kafesli bileşik (~ 30 mikron) ile pipet yerleştirin. Izin pipet yerleştirinseçim dendritin etkin yerel perfüzyon. Uncaging lazer ayarlayın: yakın Uncaging noktaya konumu - ilgi yapısına (~ 1 2 mikron).
5. Seçilen dendritin faiz ve görüntüleme yazılımı kullanarak komşu dikenler Set bölgeleri.
6. Ilgi bölgeyi yaklaşım ve fokal düşük basınç ile birkaç sn (<3 PSI) için kafesli bileşik enjekte. Tetikleme sinyali ile yama kelepçe ve (790 nm çoklu foton uyarma) floresan kayıtları başlatın.
   NOT: kafesli bileşiğin yerel perfüzyon sırasında, uyarma ışın tamamen beyazlatma önlemek için soluklaşır.
7. Kafesli bileşik yerel perfüzyon durdurun. SBFI verimli uyarma etkinleştirmeniz ve Uncaging (Uncaging süresi 300 msn'den) başlatmak için UV flaş uygulamak için iki foton lazer yoğunluğunu artırın.
8. SBFI floresan değişiklikleri izlemek. SBFI floresan başlangıç ​​noktasına geri kurtarıldı sonra kaydı durdurmak.

6. Farmakoloji

1. Reseptör blokerleri istihdam, kafesli glutamat UV flaş fotoliz uyandırdığı akım ve / veya sodyum sinyalleri üretimi, iyonotropik glutamat reseptörlerinin yer aldığını test etmek için.
   1. AMPA-reseptör bloke edici siyano-nitrokuinoksalin-dion (CNQX, 10 uM) ve TTX (yukarıya bakınız) ek olarak NMDA-reseptör bloke edici-amino-phosphonopentanoate (APV, 50 uM) ihtiva eden geçiş ACSF ve en az 10 bir dilim serpmek Min.
   2. Tekrar stimülasyon prosedürü (5.4 ve 5.5 bakınız.)
2. Engelleyicilerin etkilerinden geri dönüştüğü
   1. Sadece TTX içeren normale ACSF geri dönün.
   2. 20 dakika boyunca dilim serpmek.
   3. Tekrar stimülasyon prosedürü (5.4 ve 5.5 bakınız.).

7. Morfoloji

1. Yapılan ölçümler için klip kutu bölge kümesinin bir XYZ-yığını kaydedin. Bu yığın oversample olduğundan emin olunuzamsal (piksel başına en az 0.2 mikron) en iyi görüntü dekonvulasyon etkinleştirmek için d ve görüntü kalitesi ve çözünürlüğü artırmak için.
2. Hücre morfolojisini değerlendirmek için tüm hücrenin bir XYZ-yığını kaydedin.
3. Çalıştırın dekonvolüsyon algoritması.

Sonuçlar

Bu çalışmada, akut fare hipokampal doku dilimleri CA1 piramidal nöronlarda natriyuma bağlı floresan boya SBFI Hücresel sodyum dinamiklerinin çoklu foton mikroskopi için bir prosedürü göstermektedir. Ayrıca, nöro-aktif bileşiklerin lazer tarama-tabanlı uncaging (örneğin kafesli glutamat) ve hücresel mikro-etki hedefleyen onun kesin olan bu görüntüleme tekniği birleştirmek için nasıl gösterir.

Yama pipet ile SBFI ile olan yükleme, nöronlar ince dendrit ve çoklu foton uyarılması kullanılarak bitişik dikenler (Şekil 6 A, B, D ve Şekil 7A) dahil olmak üzere bütün hücre görselleştirme sağladı.

Şekil 6. Sodyum sinyaller ve kafesli glutamat flaş photolysis tarafından uyarılan sinaptik akımlar. (A) Maximyama pipet (PP) üzerinden SBFI yüklü bir CA1 piramidal nöron al projeksiyon görüntüsü. Kutusu B. LP büyütülmüş olarak gösterilen alan kafesli glutamat yerel perfüzyon için pipet konumunu ve yönünü gösterir gösterir. (B) bitişik dendritik dikenler ile dendritlerin optik bölümleri bir yığının Yüksek güç maksimum projeksiyon. Optik kesit yığınları z hizalama ve dekonvulasyon uygulandı. Kırmızı çapraz Uncaging ışınının hedef bölgeyi gösterir. Turuncu noktalı çizgi floresans emisyon kaydedildiği ilgi bölgesini belirlemektedir. (Sarı flaş ile gösterilir) kafesli glutamat flaş photolysis oluşturduğu akım (alt satır) içeri Sodyum sinyali (üst sıra) ve somatik: kutusu Sol D. (C) büyütülmüş olarak gösterilen bölgeyi gösterir. Kırmızı çizgi, deneysel verilerin bir uyumu temsil eder. Gri alan dönemini temsil eden Uncaging flaş (300 içindekafesli glutamat ile ön-perfüzyon olmadan, aynı UV flaş ne SBFI emisyonunda bir değişiklik, ne de içe doğru bir akım uyarılmış (D) Sol:. msn) Sağ SBFI floresan görüntüleme engel. dendrit ve bitişik Yüksek güç imajını yanı sıra B'de tarif gibi, ters gri değerleri ile aynı görüntüyü spines. Noktalı çizgiler, floresans emisyon kaydedildiği ilgi olduğu bölgeleri belirtmektedir. Kırmızı çapraz Uncaging kirişin lokalizasyonu gösterir Sağ:. Kafesli glutamat UV-flaş photolysis tarafından uyarılan Sodyum transientler. Mavi iz: dendritin sodyum sinyalleri; kırmızı iz: Uncaging noktaya bitişik üç diken yanıtı ortalama; yeşil iz: uzak üç diken yanıtı ortalama. , bu rakamın büyük bir versiyonu için lütfen buraya tıklayın.

Kafesli yerel perfüzyon sonraglutamat, bir dendrit yakın UV flaş uygulanması Hücre içi sodyum konsantrasyonu (Şekil 6C, D ve Şekil 7B) bir artışla, SBFI floresan emisyonunda bir düşme gözlendi. Aynı zamanda, içeri doğru akım soma (Şekil 6C ve Şekil 7B) kaydedildi. UV flaş süresini artırmak sistemi de dinamik aralığı içinde ve Uncaging ne de hücresel tepkiler de doymuş olduğunu olduğunu göstermektedir, her iki akım ve sodyum sinyalleri (veri gösterilmemiştir) içeri doğru ortaya genliklerini artmasına neden. Kafesli glutamat ile önceden perfüze değil dilimleri aynı ya da daha uzun bir süre için bir UV flaş uygulanması, bu sinyaller glutamat uncaging (Şekil 6C) bağlı olduğunu gösteren, SBFI floresan veya içeri doğru akımlar ortaya değişiklik olmadı. Ayrıca, bu sonuçlar imaging- ve Uncaging bileşenlerin herhangi bir bağımlılık u görülmektedir olduğunu göstermektedirBizim deneysel koşullar nder. Sodyum sinyaller de dendritik dikenler (Şekil 6D) tespit edilebilir. Biz sadece glutamat uncaging tek bir omurga hareketini elde girişimi yoktu iken, genlik zirve dikenler daha uzakta ana dendrit (Şekil 6D) gibi hemen hemen aynı floresan değişiklikler göstermesine karşın, Uncaging yakın nokta dikenler biraz daha yüksek olma eğilimindeydi.

Son olarak, glutamat uncaging yanıt dendritler ve dikenler içine sodyum girmesi için yolu okudu. Bu amaçla, sırasıyla AMPA- ve NMDA alt tipi, sodyum geçirgen iyonotropik glutamat reseptörleri için selektif blokerler oldukları, CNQX ve APV yararlanılmıştır. Sonuçlarımız, glutamat ile indüklenen hücre içi sinyal ve sodyum ortaya çıkardı somatik akımlar bu bloke edicilerin (Şekil 7B) mevcudiyetinde ihmal olduğunu göstermektedir. Bloker yıkama-out sırasında, sinyalleri yeniden kazandırılır. Bu tha gösteriyorglutamat t Uncaging hücre içi sodyum geçici ve içe akımları sonuçlanan, dendritler ve dikenler içine sodyum akını aracılık CA1 piramidal nöronlar üzerinde İyonotropik glutamat reseptörleri aktive.

Uyarılmış sodyum sinyalleri ve içe akımları Şekil 7. Farmakolojik profili. Soma bağlı (A) yama pipet (PP) ile SBFI dolu CA1 piramidal nöron (B) Sol:. Sodyum geçici ve bir dendrit kafesli glutamat foto-aktivasyonu ile tetiklenen bedensel akımı ve bağlı dikenleri Merkezi:. Ile Perfüzyon İyonotropik glutamat reseptör blokerleri CNKX ve APV sodyum sinyali ve uncaging tarafından uyarılan içe akımını hem inhibe Sağ:. bloker yıkama-out sırasında sinyalleri geri yüklenir. Kırmızı çizgi Temsilci Vekilideneysel verilerin bir uyum ts. Gri alan Uncaging flaş (300 msn) SBFI floresan görüntüleme tıkalı olduğu dönemi temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonu için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Bu çalışma, SBFI küçük hücresel bölümlerinde Hücre içi sodyum transient iki foton görüntüleme için uygun olduğunu göstermektedir. Bu SBFI kuantum etkinliği, sodyum konsantrasyonu oldukça ^{azdır, 15} ve nispi değişikliklerin fizyolojik aktiviteye sahip oldukça küçük olduğu, ancak, akılda tutulmalıdır. Böylece, ince süreçlerin Na ⁺ Transientlerin yüksek çözünürlüklü ölçüm nispeten sıkıcı bir iştir, ve birkaç deneme binning veya ortalama tatmin edici sinyalleri elde etmek için gerekli olabilir. Ayrıca, sodyum Transientlerin kinetik uzun süreler için kayıt zorunlu hale şaşırtıcı yavaş. Bu gözlem, nöronal dendritler ve astrositlerin sodyum transient monoexponential bozunma oda sıcaklığında ^1,2,6 10 saniye aralığındaki büyük bozulma süresi sabiti ile karakterize edilir burada daha önceki çalışmalarda, olanlara karşılık gelir. Sodyum geçici Bu şekilde çok daha düşük bir zaman co gösterir gibi görünürURSE ve kalsiyum geçici ¹⁶ oranla çok daha büyük bozulma zaman sabitleri.

Bu sakıncaları bir kenara, sodyum görüntüleme nöronal alt etki fizyolojik özelliklerinin araştırılması için değerli bir araç olduğunu kanıtlıyor. Örneğin, sodyum görüntüleme ya da yakın aktif sinaps uyarıcı sinaptik aktivitesini izlemek için hizmet edebilir. Sodyum esas ^8,17 tamponlanmamış için, aktivitesi ile uyarılan geçici sodyum doğrusal sinaptik glutamat salınımı geniş bir ilişkili ya da dışsal olarak glutamat uygulanır. Bu nedenle bir nöronal Glutamaterjik aktivitenin doğrudan ve tarafsız göstergeleri temsil eder. Ayrıca, sodyum göstergesi boyalar yüksek K _d '(SBFI en _Kd 25 aralığında mM ¹ ise) sergilerler. (- 1 mM genellikle 0.5), yüksek _Kd 'nin boyaları kendileri s tampon olarak hareket yok olduğunu ima bile yeterli bir parlaklık elde etmek için kullanılan nispeten yüksek hücre içi boya konsantrasyonlardaiğrençlik. Sonuç olarak, onlar kalsiyum duyarlı boyalar hücrelere ¹⁸ sokulur her zaman bir endişe olduğu, sodyum Transientlerin genlik ne zaman ders bozmaz. Bu nedenle bulgulanan sinyaller, hücre içi sodyum, "gerçek" değişiklikleri iyi bir ölçümünü temsil ettiği kabul edilebilir. Bunların yavaş olan süreçleri nöron sodyum için hücre içi difüzyon hızı önceden tahmin ¹⁹ daha küçük olduğu anlamına gelir.

Dikenler ve dendritler içine uyarıcı sinaptik iletim ve sodyum akını yolların özelliklerini ele deneylerin başarılı bir şekilde yürütülmesi için önemli bir gereklilik postsinaptik yapıların hızlı ve son derece lokalize aktivasyon indüksiyon olduğunu. Bu, bir omurga bölgesinin hemen yakınında ya da kafes bileşiklerin flaş fotoliz dendritlerin glutamat glutamat agonistleri ve hızlı yerel uygulanması ile elde edilebilir. Flaş potoliz değil mekanik Dama yokge doku, hareket eserler ücretsiz ve bununla ilgili sorular soruşturma için (örneğin, yerel kalsiyum sinyalizasyonu) kuruldu. Uncaging spot çapı xy düzleminde 1,5 um idi. Uncaging hem dikenleri bir dikenli dendrit kaynaklı sodyum sinyalleri yakın ve ana dendrit. Sinyalleri Uncaging noktaya en yakın dikenler büyük olma eğilimi ise, ana dendrit amplitüdleri ve omurgaları daha uzakta hala Uncaging noktasının hemen yakınında kişilerce oldukça benzerdi. Uncaging içeri doğru akımlar amplitüdünün artış sırasında 300 milisaniye boyunca uygulandı. Uncaged glutamat daha uzakta Uncaging yerden dendritik bölgelere ve dikenler üzerinde İyonotropik glutamat reseptörleri ve sodyum akışını aktive aynı dönemde dokuda yayılmış olabilir.

Hücre banyo çözümü aracılığıyla uygulanan kafesli bileşiklerin photolysis için UV lazer kullanılarak oluşur içsel bir sorun'İç filtreleme' olduğunu. Çünkü kafesin yüksek emme oranı, UV ışığı uyarım siteye ^20,21 için hedeften yol boyunca güçlü zayıflatılmaktadır. Bunu önlemek için bir uygun yol, sadece, ayrıca en az bir kafes için gerekli bileşik miktarını azaltır uyarı bölgesinden, sınırlıdır kafes yerel bir perfüzyon. UV lazer tarama aracılı Uncaging, yakın enfraruj, iki foton ile karşılaştırıldığında, ²² Uncaging stimülasyon doğruluğu z ekseni artar çünkü esas olarak, uzaysal olarak daha hassas. Diğer taraftan nedeniyle, iki foton uyarılması ile birlikte kullanılan bir yüksek kafesli bileşik konsantrasyonu ya da çok yüksek olmak üzere, potansiyel olarak fototoksik ışık yoğunlukları gereken daha uzun dalga boyları için yaygın olarak kullanılan kafeslerin küçük kesitine. Ayrıca, iki foton Uncaging ekipman çok daha yüksek bir yatırım gerektirir; diğerlerinin yanı sıra, ek bir kızılötesi lazer artı gerekli olan optik bileşenler ihtiyaç vardır.

SBFI ve MNI-glutamat ikisi de aynı dalga boyu aralığında uyarılabilir bulunmaktadır. Bu, flaş Uncaging ve / veya kızılötesi ışın ile glutamat sürekli uncaging ile SBFI ağartılmasında sonuçlanan UV Uncaging lazer ve SBFI veya kızılötesi görüntüleme lazer ve MNI-glutamat istenmeyen bir ara bağımlılığı yol açabilir. Şekil 6C'de gösterildiği gibi Ne var ki, tek başına veya çoklu foton görüntüleme ile, UV flaş bizim deney koşulları altında, bu karşılıklı etkilere neden olmuştur.

Burada açıklanan benzer UV flaş sistemler, pek çok diğer laboratuarlarda rutin olarak kullanılır ve nispeten kolay herhangi mevcut bir foton görüntüleme mikroskop içine dahil edilebilir. Bu fotoliz için lazer ışını görüş alanında serbestçe konumlandırılabilir avantajını sunmaktadır. Buna ek olarak, sistem bir deney sırasında, görüş alanı sırasıyla lazer ışınının hızlı ve otomatik yeniden konumlandırılması ve serbest hacmi, sağlar. OuR modifikasyon kolaylaştırır ve görüntüleme yazılımı çerçeveleri örtüşecek görüntüleme ve Uncaging çerçeveleri ayarlamak üzere iş görmektedirler, böylece Uncaging noktasının doğru konumlandırma artırır.

Birlikte ele alındığında, glutamat UV ışık kaynaklı uncaging için modifiye edilmiş bir prosedür ile birlikte dendrit ve merkezi nöron dikenler tam hücre patch-clamp ve çoklu foton sodyum görüntüleme, doku glutamat reseptörlerinin, güvenilir ve fokal aktivasyonunu sağlar. Böylece, sağlam doku nöronların uyarıcı sinirsel iletimin ve postsinaptik sodyum sinyallerin özelliklerini analiz etmek için hizmet edebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosilicate-glass capillaries	Hilgenberg	1405059	75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm
Camera	Jenoptik	ProgRes MF	IR-DIC compatible camera
Deconvolution software	SVI	Huygens Pofessional X11
Fiber optic spectrometer	Ocean Optics	USB 4000	Miniature fiber optic spectrometer
Filter tubes	VWR		cenrifugal filter, 0.2 µm
Imaging software	Olympus Europe	Flowview Ver 5.0c, Tiempo
IR beam power controller	Custom built		Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell
IR laser	SpectraPhysics	Mai-Tai	fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION
IR power monitor	Custom built
Micromanipulator	Burleigh	PCS 5000
Microscope/Imaging System	Olympus Europe	BX51WI/FV300	Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified
ND filter wheel	Newport	50Q04AV.2	UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0
Objective	Nikon Instruments Europe	NIR Apo 60x/1.0w
Patch clamp amplifier	HEKA	EPC-10
Pipette puller	Narishige	Model PP-830
Pneumatic drug ejection system	NPI Electronic	PDES-DXH
Pockels cell	Conoptics	350-80 LA-BK	EOM, used as fast switch and for power adjustment
Pockels cell driver	Conoptics	M302-RM	High voltage differential amplifier
Shutter	Vincent Associates	LS6ZM2	ALMgF2-coated BeCu blades
Shutter controller	Custom built
Shutter driver	Vincent Associates	Uniblitz VCM D1
Slicer/Vibratome	Thermo Scientific	Microm HM 650 V
Uncaging software	Rapp OptoElectronic	UGA40 1.1.2.6 + NetCam
UV laser	Rapp OptoElectronic	DL-355/10	cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION
UV laser scanning system	Rapp OptoElectronic	UGA 40	Galvanometric scanning system
Name of Compound	Company	Catalog Number	Comments/ Description
CNQX	Sigma Aldrich	C-127	AMPA receptor antagonist; CAUTION
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	NMDA receptor antagonist; CAUTION
SBFI K+ salt	Teflabs	OO32
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION
NMI-caged-L-Glutamate	Torcis	1490	Caged glutamate released upon UV absobtion