다중 광자 세포 내 나트륨 이미징 CA1 피라미드 뉴런의 글루타메이트의 UV 매개 초점 Uncaging과 결합

요약

우리는 전체 세포 패치 - 클램프 및 마우스 뇌의 급성 조직 슬라이스에서 수상 돌기 및 해마 신경 세포의 쪽의 세포 내 나트륨 과도 다중 광자 이미징 신경 활성 화합물의 초점 UV 유도 된 사진 활성화의 조합을 설명합니다.

초록

다중 광자 형광 현미경은 높은 시공간 해상도의 손상 조직에서 뇌 세포의 형태 학적 및 생리 학적 파라미터들의 분석을 가능하게했다. 전기 생리학과 결합, 그것은 널리 돌기 및 돌기 쪽이 작은 세포 내 구획 활동 관련 칼슘 신호를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 과도 외에도 시냅스 활성은 또한 시냅스 나트륨 신호 미미한 이해되고있는 특성을 유도한다. 여기서는 중앙 신경 세포에 결합 된 미소 영역 전체 세포 패치 - 클램프 및 다중 광자 나트륨 촬상하기위한 방법을 설명한다. 또한, 우리는 조직의 글루타메이트 수용체의 신뢰성과 초점 작동되도록 자외선 (UV) 글루탐산 - 빛에 의한 uncaging에 대한 수정 절차를 소개합니다. 이를 위해, 전체 셀 녹음 Cornu Ammonis 세분 한 (CA1)의 급성 조직 슬라이스의 피라미드 뉴런에서 수행 하였다마우스 해마. 뉴런은 패치 피펫을 통해 나트륨에 민감한 형광 염료 SBFI 가득하고, SBFI의 다 광자 여기에는 수상 돌기에 인접한 쪽의 시각화를 사용 하였다. UV-유도 된 초점 uncaging을 확립하기 위해, 광량, UV uncaging의 빔에 의해 영향 볼륨 빔의 위치 결정뿐만 아니라, 케이지 화합물의 농도 등 여러 가지 파라미터를 테스트하고 최적화 하였다. 우리의 결과는 갇힌 글루타메이트 (MNI-글루타민산)와 그 지역의 관류와 수상 돌기 및 등뼈의 안쪽으로 전류와 나트륨 과도에서의 초점 UV-uncaging 결과를 보여줍니다. 시간 경과와 내측 전류 나트륨 신호 모두의 진폭은 uncaging 펄스의 지속 기간과 연관. 또한, 우리의 결과는이 통로 비록 나트륨 유입에 의해 매개된다는 보여주는 세포 내 나트륨 이온 성 신호가 글루타메이트 수용체 차단제의 존재 하에서 차단되는 것으로 나타났다. 요약하면, 우리의 방법에 대한 신뢰할 수있는 도구를 제공합니다뇌 조직 손상에 초점 수용체 활성화에 의해 유도 된 세포 내 나트륨 신호들의 조사.

서문

이러한 다중 광자 현미경과 같은 광학 현미경 기술의 최근 개선은 높은 공간 및 시간 해상도로 그대로 조직에서 뇌 세포의 형태 학적 및 생리 학적 파라미터의 연구를 활성화. 전기 생리학과 결합,이 기술은 현재 널리 즉 미세 돌기 및 돌기 쪽의 작은 세포 내 구획에서 신경 세포의 활동과 관련된 전기 신호뿐만 아니라 부수적 인 칼슘 신호를 분석하는 데 사용됩니다. 칼슘 과도 외에도 시냅스 활성 또한 덴 드라이트 및 등뼈 나트륨 신호를 유도의 특성은 크게 비경이다. 이러한 신호는 [나 ^+] 상당한 염료 표백 또는 광 손상 ^1,2없이 장기간 _제가 과도 온라인 측정을 가능하게 세포 내 나트륨 이광자 영상 ([나 ^+] _I)에 의해 분석 될 수있다.

[나 ^+] _난의 이미징을위한 서브, 단 몇 화학 표시기 염료는, 예를 들어 코로나 녹색 또는 아산테 나트륨 녹색 ^3,4 사용할 수 있습니다. ⁺ 나 ^촬상 대한 가장 일반적으로 사용되는 형광 프로브는 나트륨 - 결합 벤조 푸란 이소 프탈레이트 (SBFI)를이다. 이것은 잘 알려진 칼슘 민감 염료의 Fura-2와 유사한 비율 적, UV 여기 된 염료이고 (예 ^5,6)는 많은 세포 유형에서 종래 ⁺ 나 ^촬상을 위해 사용되었다. 흥미로운 염료 및 형광을 수집하는 다른 가능성이 있습니다. 높은 시간 해상도 (즉, 높은 촬상 프레임 레이트), 공간 정보와 함께 필요한 경우 SBFI는 고속 전하 검출 크세논 아크 램프 또는 고출력 발광 다이오드 (LED) 장치 및 그 발광으로 여기 될 수있다 -coupled 소자 (CCD) 카메라 ^7,8. 깊은 조직에서 최대 공간 해상도를 들어, 다중 광자 레이저 주사 현미경 ^(9)의 선택 방법이다. 상대적으로 낮은 양자 efficie(- 0.5 mM의 2) 및 날카로운 미세 전극 ⁽¹⁰⁾ 또는 패치 피펫 ¹ 비아 SBFI의 불 투과성 멤브레인 형태의 직접 로딩 중 SBFI NCY 염료는 비교적 높은 농도를 필요로한다.

SBFI를 사용하여 쥐 해마의 급성 조직 슬라이스에서 수행 초기 연구는 주로 ^{1,2 수용체} 이온 성 NMDA을 통해 나트륨의 유입에 의해 발생 CA1 피라미드 뉴런의 수상 돌기 및 등뼈 활동 관련 나트륨 과도를 보여 주었다. 더 자세하게 현지 나트륨 신호의 특성 연구를 위해, 수용체 작용제의인가에 의해 시냅스 수용체의 활성화는 특정 선택의 매우 적합한 방법이다. 시냅스 활동 및 송신기 릴리스를 모방하기 위해, 응용 프로그램은 상대적으로 짧은하고 현지 자극 수 있도록 집중해야한다. 그러나, 이것은 조직 손상에 매우 어려운 것으로 판명. 뾰족한 피펫을 사용하여 수용체 작용제의 현지 압력 응용 프로그램은 매우 초점 AP 통신을 가능하게습곡은 있지만 (예컨대 수지상 또는 돌기 쪽로서 예) 관심있는 구조의 움직임을 제조 위험을 호스팅, 따라서 고해상도의 촬상을 방해. 신경 활성 물질의 이온 토 포레 시스의 적합성은 자신의 전기적 특성에 따라 달라지며 높은 전류 진폭뿐만 아니라 세포 아티팩트를 생성 할 수있다.

이러한 장애물을 회피하는 한 방법은 광 활성 화합물 및 이의 플래시 광분해의 채용이다. 기본적으로, 두 개의 서로 다른 원리가 갇힌 물질의 광 활성화를 위해 사용된다 : 레이저 ^(12)와 조합하여 스캐닝 모듈을 이용하는 I) 와이드 필드 플래시 광분해 ⁽¹¹⁾ 및 II)의 초점 uncaging. 와이드 필드 플래시 광분해가 큰 관심 영역을 활성화하기 위해 사용되지만, 예를 들면, 전체 셀은 초점 uncaging 특별히 작은 세포질 구획을 자극하기 위해 사용된다. 본 연구에서 우리는 전체 세포 패치 - 클램프 및 다중 페이지를위한 절차를 보여조직의 글루타메이트 수용체의 신뢰성과 초점 작동되도록 글루타메이트의 자외선에 의한 uncaging에 대한 수정 절차와 결합 돌기 및 중앙 신경 세포의 등뼈에 hoton 나트륨 이미징,.

프로토콜

이 연구는 엄격한 하인리히 하이네 대학, 독일의 뒤셀도르프의 제도적 지침에 따라뿐만 아니라 유럽 공동체위원회 지침 (6백9분의 86 / EEC)에 실시 하였다. (: Ø52 / 05 기관의 행위 번호) 모든 실험은 하인리히 하이네 대학, 독일의 뒤셀도르프의 동물 관리 및 사용 시설에서 동물 복지 사무소에 통보하고 승인 하였다. 독일의 동물 복지법에 따라 (Tierschutzgesetz, 제 4 조 및 제 7), 뇌 조직의 사후 제거를위한 공식적인 추가 승인이 필요 없었다.

실험 동물의 안락사, 룩셈부르크 : 급성 조각의 생성을 위해, 생쥐에 발표 된 유럽위원회 (European Commission)의 권고 다음 (참수 빠르게 CO _2로 마취되었고, 유럽 공동체, 1997의 공식 간행물에 대한 사무실, ISBN 92-827-9694 -9).

1. 준비솔루션

1. 95 % O _2와 버블 링 (125)의 NaCl, 2.5의 KCl, 0.5 염화칼슘 _2, 6 _MgCl2를, 1.25의 NaH ₂ PO _4, 26 탄산 수소 나트륨 _3, 20 포도당 : (mm 단위)를 포함 절개 인공 뇌척수액 (ACSF)를 준비 5 % CO _2, 7.4의 pH의 결과.
2. (mm 단위)를 함유하는 실험 ACSF 준비 : 125의 NaCl, 2.5 KCl을,이 _{염화칼슘,} 1 _MgCl2를, 1.25의 NaH ₂ PO _{4, 26의} NaHCO3 및 95 % O _2와 5 % CO2로 버블 (20) 글루코스, 얻어진 7.4의 pH이다.
3. 150 KMeSO ₃ 12.5 히드 록시 에틸 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 40의 KCl, 5의 NaCl, 1.25 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산 (EGTA), 5의 Mg-ATP, 0.5는 Na- : 세포 내 용액 (ICS) (mm 단위)을 함유 준비 GTP. 7.3으로 산도를 조정합니다. -20 ° C에서 1 ㎖를 저장 분취.
4. 두 번 증류수에 나트륨 결합 벤조 퓨란 이소을 (SBFI) - 소금을 희석하고 5 ㎕의 일정량을 준비10 MM의 원액.
5. ICS는 녹여 최종 농도 1mM SBFI 원액을 추가하고. 소용돌이와 마이크로 여과 (0.22 μm의). 실험에 사용 된 때까지 4 ℃에서 보관하십시오. 재 냉동 만 일일 사용하지 마십시오.
6. 이중 증류수에 용해시킨 화합물을 50 mM의 글루타메이트 MNI의 스톡 용액을 준비한다. 정상 ACSF 5 mM의 최종 농도 MNI 글루타메이트 원액을 희석. 실험에 사용 된 때까지 4 ℃에서 보관하십시오. 재 냉동 만 일일 사용하지 마십시오. 즉시 -20 ° C에서, 실험에 사용하지 않는 저장 분취.

조직의 2 해부

참고 : 쥐 뇌의 해마 급성 조각의 준비는 이전 ^13,14 상세하게 설명했다. 요약하면, 다음과 같은 프로토콜이 본 연구에 사용 하였다.

1. 잘린 후, 신속하게 두개골에서 뇌를 제거합니다.
2. 즉시 페트리 접시에 뇌를 배치얼음처럼 차가운 해부 ACSF으로 중간 선을 따라 시상 컷을 수행하여 반구를 해부.
3. 차단 표면으로 원하는 방향으로 두번째 컷을 수행하고 superglue와 vibratome의 절단 단계로이를 연결합니다.
4. 실 절단 및 냉각 소자 타고 챔버 뇌 섹션 냉장고와 장소 절단 단계에서 vibratome의 (모두 -20 ° C로 유지). 이어서 챔버에서 냉각 요소를 넣고 빙냉 해부 조직 ACSF에서 잠수함. 준비를 안정화하기 위해, 하나는 한천 젤 조직 블록에 대응 할 수 있습니다.
5. vibratome와 해마의 250 μm의 두께, parasagittal 조각을 잘라. 모든 ACS 유체는 항상 거품이되어 있는지 확인합니다.
6. 슬라이스 한 후, 정상 ACSF와 비커에 메쉬 조직을 유지하고 30 분 동안 34 ° C에서 배양. 그런 다음 실온에서 보관하십시오.

하드웨어의 3 준비

페이지 내
도 광 경로 및 다중 광자 영상화 레이저 주사 UV 플래시 광분해 및 전기 생리학 이루어지는. 다중 광자 빔 (적색)을 감싸고 실험 제어를 나타내는 1 반응식은 펄스, 가변 파장의 적외선 (IR) 레이저에 의해 생성된다 (TISA). 이 레이저 파워 및 투여 기간의 제어를 가능하게 모두 기계 셔터, 포켈 '셀 및 IR 검출기 (광 강도의 검출)를 통과한다. 플립 - 인 / 아웃 플립 선택적 레이저 다이오드는 레이저 빔의 기본적인 정렬을 위해 사용된다. 빔 확장기는 매우 넓은 후면 초점면과 목표와 병용 할 수있다. 원격 제어 ND 필터 휠 외에 또는 대신에, 레이저 빔의 전력을 제어하기 포켈 '세포로 사용될 수있다. 주사 헤드를 통과 한 후, 펄스 광은 IR-시편에 안내된다. 방출테드 형광 빛 (밝은 녹색) 외부 또는 내부 광전자 증 배관 탐지기 (PMT가)에 의해를 수집합니다. 외부 감지기가 완전히 고주파 스위치 (PMT 컨트롤러)를 통해 내부 PMT가 동기화됩니다. uncaging 빔 (하늘색)는 UV 고체 레이저 (DPSS UV 레이저)에 의해 생성된다. 그 다음 도광 의해 에피 형광 응축기의 상단 후면의 갈보 구동 주사 유닛에 관한 것이다. 정확한 위치 uncaging 지점 또는 지역 (이미징 및 uncaging 보 사이 색수차)는 이미징 소프트웨어에서 이미지 내보내기로 사용할 수 있습니다. 촬상, 전기 생리학 및 플래시 광분해를 동기화하기위한 타이밍 관리는 전자적으로 제어된다. transillumination 검출기 (TL-PMT)은 조직 내의 피펫의 위치의 문서에 대한 필요성이다. 제어 유닛과 수정 된 촬상 시스템의 소프트웨어 제어 및 모든 다른 장치를 동기화하는 데 사용시스템을 실행하는 데 필요한. "정의"가 저자에 의해 적응 / 설계 및 구축 하였다으로 시스템 구성 요소 레이블. 일부 구성 요소는 사용자 지정 빌드 다 광자 시스템의 요구 사항을 충족하기에 적합하고 "수정"으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 다중 광자 시스템의 구성 요소에 전환합니다. 테스트 및 적외선 레이저 빔 정렬을 조정합니다.
   1. 대신 대물 프리즘의 센터링에 의한 제어 뒤집기 빔 포지셔닝. 빔이 어긋나 있으면, 잠망경의 거울에 의해이를 다시 조정. 프리즘의 평면 중심이 촬상 동안 목표의 후면 초점면과 동일 레벨에 있어야합니다.
   2. 분광계에 전환하여 빔의 다중 광자 특성을 확인합니다.
   3. 다음 값으로 이미징 소프트웨어의 매개 변수를 설정하기 :(높은 프레임 레이트 및 높은 공간 해상도를 각각 2.5의 줌 배율로 작은 클립 박스) 셀의 개요 이미지 512 X 512 화소 프레임 크기. 고속 모드와 XYT에 스캔 모드로 설정 이미징 속도. Z-스테핑 나중에 수행 디컨 볼 루션을위한 공간 샘플링 요구 조건에 맞게 자세한 스택 1 개요 스택에 대한 μm의 0.2 μm의이어야한다.
2. 및 광 멀티 플라이어 (PMT가) - (16 μW ≈ 14 목적에서 최종 전력) 포켈 '셀의 설정을 변경하여 다중 광자 레이저 빔 (790 nm의) 강도를 조정합니다.
3. 스위치를 켜고 대물 렌즈에서 형광 샘플 슬라이드를 배치하여 uncaging 시스템을 보정하십시오.
   1. 망원경을 사용하여, UV 광학계의 초점을 조절하고 공간적으로 스캔 UGA 헤드에 포커싱 장치를 이용하여 최대 직경이 2 μm 인 사이즈에 UV 레이저 스폿을 제한한다.
   2. uncaging 유닛 제어 softwar의 교정 루틴을 시작할전자.
      1. 형광 CCD 카메라로 촬영하는 동안, 그 스캔 범위 내에서 여러 지점에 UV 레이저를 설정합니다. 각 점에서의 UV 레이저 스폿 클릭하면, 소프트웨어가 특정 좌표에 대응하여 스캔 갈바닉 미러의 위치를​​ 조정한다.

여기, 발광 및 uncaging 빔 경로의 특성을 나타내는도 2 상세한 방식. IR 여기 빔 (적색) 현미경의 에피 형광 응축기 및 대물 행에서 파일러 포대로 레벨에서 다이크로 익 미러를 조합 한 빔 전달 시편에 도달합니다. uncaging 빔 (청색)의 주사 마일 단위로 포커싱 시준 및 빔 광학 석영 광 섬유를 통해 전달하고이어서 안내주사 유닛에서 패 널 오 류는, 빔 조합 다이크로 익 미러에 이색 미러를 통과한다. 여기가 여기 주사 빔과 조합된다. 시료로부터 방출 된 광은 영상 스캔 헤드를 향해 반대 방향으로 여진 주사 빔 경로의 경로를 따른다. 카메라 패치 피펫의 시각 제어 및 공 초점 레이저 주사 현미경과 조합 uncaging 빔의 위치 결정을 위해 사용된다 (도시 생략). 녹색 빛의 경로는 다른 응용 프로그램과 함께 사용 될 수있는 선택적 에피 형광 조명을 나타냅니다.

3. 2. 2. 국소 애플리케이션을 획득 스폿 모드 플래시 광분해 시스템을 사용한다. 있는지 확인 (목표 아래 평균 전력 : 0.55 MW) uncaging 빔의 초점 조정 직경 1.5 μm의 (XY 확장)의 스폿 사이즈의 결과 Z-레벨에 위치 형광 슬라이드에서 계시의에 해당 조직조각 (도시 생략).
   3. uncaging 스폿의 정확한 위치는 uncaging- 및 이미징 시스템들 사이의 네트워크 연결을 통해 상기 촬상 장치의 화상의 수입에 의해 달성된다.
      1. 스크린 그래버 소프트웨어를 사용하여 연속적으로 이미징 소프트웨어 (대신 카메라 피드)의 프레임을 판독하고 복합적 으 이미징 uncaging 프레임을 조정한다. 플래시 장치로, 참조 화상이 전체 실험 기간 동안 적절한 조정을 보장하기 위해 이미징 소프트웨어에서 매 10 ^{번째 프레임을} 내보낼.

그림 uncaging 자리의 3 조정 : 정확하게 uncaging 자리 uncaging 소프트웨어 (녹색 프레임)로 가져 이미징 소프트웨어 (노란색 프레임)의 스크린 샷을 배치합니다.전체 CA1 피라미드 세포 (포화 픽셀 : 검은 색 픽셀, 빨강, 파랑) 노란색 프레임 내에서 왼쪽 이미지는 하이 - 로우 코딩 된 이미지를 나타냅니다. 화상 uncaging 소프트웨어 (녹색 "X"들)의 보정 그리드로 겹쳐있다. 오른쪽에있는 셀의 확대 된 부분은 오버레이 uncaging 자리 (적십자)와 함께 표시됩니다. 노란색 자리 uncaging 빔의 자동 겹쳐 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 대상 지역에 갇힌 화합물의 전달을 위해 미세 조작기, 전기 생리학 구성 요소 및 가압 장치를 켭니다.
5. 갇힌 화합물의 지역 관​​류 초점 가압 장치를 설치합니다. 이러한 물질의 목욕 관류에 비해이 엄청난 비용을 줄일 수 있습니다. AC의 저항을 방지하기 위해 주어진 대기압 잡고 압력을 조정SF로 또는 애플리케이션 피펫 갇힌 물질의 누설.
   주 : 가압 장치는 피펫 홀더 고정밀 및 초고속 마이크로 밸브를 호스팅. 이것은 최소한의 응용 프로그램에 압력을 적용 할 수 있으므로 갇힌 화합물과 지역 관​​류 동안 최소로 이동 아티팩트를 줄일 수 있습니다.
6. 화재 연마 붕규산 유리 모세관을 사용하여 전체 세포 패치 - 클램프 및 지역 관​​류 피펫을 당깁니다. 피펫 ~ 1 μm의의 팁 직경 및 R ≈ 3 MΩ (K-메조 ₃ 기반 ICS로 측정 값)의 저항이 있어야합니다.
7. 장소 실험 목욕 슬라이스와 그리드로 부착 (그림 4A를, B) (250 μm의 두께 백금 프레임은, 수술 필라멘트 스팬 40 μm의 중독). 슬라이스 전송 (깨진 팁의 측면에서 흡입 공) 역, 팁 파손, 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 굽​​힘 및 조각의 다른 가혹한 취급하지 마십시오.

도 현미경 단계에서 실험 목욕 욕조의 위치 4의 구성 요소. (A) 실험 조를 자성 금속 링에 의해 둘러싸여 욕 실 자체 (청색 사각형)로 구성된다. 튜브 식염수 (ACSF)와 함께 목욕을 지속적으로 관류을 보장합니다. 누른 상태에서 슬라이스를 해결하기 위해 그리드는 목욕 챔버가됩니다. 목욕 챔버 내에 위치 (B) 급성 슬라이스 준비. 슬라이스는 그리드의 스레드에 의해 고정되어있다. (C) 위치 및 현미경 단계에서 실험 화장실의 구조 실험 중.

8. ACSF와 슬라이스를 관류 영구적으로 현미경 단계에서 목욕을 놓고.

(4) 전체 세포 패치 클램프

1. SBFI를 포함하고 갇힌 화합물과 지역 관​​류 피펫을로드 ICS와로드 패치 피펫. 해당 미세 조작기에 피펫을 연결합니다. 욕조에 기준 전극을 배치합니다. 당신이 머리 단계 (CF도 4C)의 손상을 방지하기 위해 영구적으로 접지되어 있는지 확인하십시오.
2. 화장실에 두 피펫을 내리고 해마 CA1 영역 위에 배치합니다. ACSF와 ICS의 희석을 방지하기 위해 패치 피펫 (40 밀리바)에 약간 힘을 주어.
3. 전기 생리학 소프트웨어를 사용하여 패치 피펫의 오프셋 전위를 보상.
4. IR-DIC 비디오 현미경을 사용하는 패치 피펫 CA1 피라미드 세포에 접근. 기가 밀봉 얻을 때까지 부드러운 흡입을 적용합니다. 셀에게 다른 편에 uncaging 빔의 한 편과 낮은 산란 및 감쇄에 그대로 세포 형태를 보장하기 위해 조각의 표면 아래에 30 μm의 -70 위치해있는 소마를 선택.
5. 빠른 용량 보정합니다. 브레이크 membran전자와 오픈 셀이 전체 셀 구성을 얻을 수 있습니다.
6. 천천히 용량과 직렬 저항을 보정합니다.
7. 셀은 이미징 실험을 시작하기 전에 적어도 30 분 동안 SBFI-ICS 투석되도록.

5 멀티 광자 영상화 자극

그림 5 실험 프로토콜입니다. 실험, (빨간색 기호 (ᴨ)과 붉은 선으로 표시) 트리거 펄스를 초기화하는 동시에 영상 (파란색), 전기 생리학 (초록), 리테이너 타입의 관리를 시작하도록 설정되어 시점 0 초에서 화합물 (황색). 이 첫번째 기간 동안 상기 영상 보 전적으로 (청색광) 흐리게한다. 4.5 초 (점선) 후 케이지 화합물의 로컬 관류는 종료되고 이미징 빔의 법과로 설정해야데이터 수집 (파란색)에 대한 왕의 강도. 노란색 플래시로 표시, 300 밀리 초 : 1.5 초 후에 (시간이 포인트 6 초), 초 트리거 펄스가 주어 자외선 플래시 (플래시 지속 시간을 초기화 (빨간색 기호 (ᴨ)과 붉은 선으로 표시)합니다 ) 및 전기 생리학 및 이미징 프로토콜의 마커를 설정합니다.

1. 활동 전위의 전압 - 게이트 된 나트륨 채널의 활성과 생성을 방지하기에 ACSF 테트로도톡신 (TTX, 500 나노 미터)에 추가.
2. 다 광자 여기를 사용 SBFI 형광 결과 세포 형태를 시각화 및 실험 가시 덴 드라이트 (dendrite)를 선택합니다. 높은 해상도로 이미지를 확대하고 수상 돌기 주위에 클립 상자를 배치합니다.
3. 갇힌 글루타메이트를 포함하는 10 μL의 ACSF와 표준 패치 피펫을 채 웁니다. 가압 시스템에 피펫을 연결하고는 미세 조작기에 연결합니다.
4. 수상 돌기 근처에 갇힌 화합물 (~ 30 μm의)와 피펫을 놓습니다. 수 있도록 피펫의 위치를선택의 수상 돌기의 효율적인 지역 관​​류. uncaging 레이저 조정 : 가까운 uncaging 자리를 위치 - 관심의 구조 (1 ~ 2 μm의).
5. 선택한 덴 드라이트 (dendrite)에 대한이자 및 이미징 소프트웨어를 사용하여 인접한 쪽의 설정 영역.
6. 관심 영역에 접근하고 focally 낮은 압력으로 몇 초 (<3 PSI)에 갇힌 화합물을 주입. 트리거 신호를 통해 패치 클램프 (790 nm의 다중 광자 여기에서) 형광 녹음을 시작합니다.
   NOTE : 케이지 화합물의 로컬 재관류 동안, 여기 빔이 완전히 탈색을 방지 흐리게된다.
7. 갇힌 화합물의 지역 관​​류를 중지합니다. SBFI의 효율적인 여기를 활성화하고 uncaging (uncaging 지속 시간 300 밀리 초)을 초기화하는 UV 플래시를 적용하는 두 광자 레이저의 강도를 높입니다.
8. SBFI 형광의 변화를 모니터링합니다. SBFI 형광 다시 기준선에 복구 후 녹화 중지합니다.

6 약리학

1. 수용체 차단제를 사용한다, 갇힌 글루타메이트의 UV 플래시 광분해에 의해 유발 된 전류 및 / 또는 나트륨 신호들의 생성에 이온 성 글루타메이트 수용체의 관여를 시험한다.
   1. AMPA 수용체 차단제 시아 노-퀴녹 살린 디온 (CNQX, 10 μM) 및 TTX (위 참조)에 부가하여 NMDA 수용체 차단제 아미노 phosphonopentanoate (APV, 50 μM)을 함유 ACSF로 전환하고, 적어도 10 슬라이스 관류 분.
   2. 반복 자극 절차 (5.4 및 5.5를 참조하십시오.)
2. 억제제 '효과의 가역성
   1. 만 TTX를 포함하는 정상 ACSF로 다시 전환합니다.
   2. 20 분 동안 관류 슬라이스.
   3. 반복 자극 절차 (5.4 및 5.5를 참조하십시오.).

7 형태론

1. 측정을 수행하는 클립 박스 영역 세트의 XYZ 스택을 기록합니다. 이 스택 오버 샘플링 있는지 확인공간 (픽셀 당 최소 0.2 μm의)는 최적의 이미지 디컨 볼 루션을 가능하게 D 및 이미지 품질과 해상도를 증가 할 수 있습니다.
2. 세포 형태를 평가하는 전체 셀의 XYZ 스택을 기록합니다.
3. 실행 디컨 볼 루션 알고리즘입니다.

결과

본 연구에서는 급성 마우스 해마 조직 슬라이스의 CA1 피라미드 뉴런의 나트륨 의존 형광 염료 SBFI와 휴대 나트륨 역학의 다중 광자 현미경을위한 절차를 보여줍니다. 또한, 우리는 신경 활성 화합물의 레이저 스캐닝 기반 uncaging (예 갇힌 글루타메이트) 및 셀룰러 마이크로 도메인 대상의 정확한로이 영상 기술을 결합하는 방법을 보여줍니다.

패치 피펫을 통해 SBFI와로드 신경 미세 돌기 및 다중 광자 여기를 이용하여 인접한 쪽 (그림 6A, B, D 및도 7a)를 포함하여 전체 셀의 시각화를 가능하게했다.

도 6 나트륨 신호 갇힌 글루타메이트의 플래시 광분해에 의한 시냅스 전류. (A) 맥심패치 피펫 (PP)를 통해 SBFI로드 CA1 피라미드 뉴런의 알 투사 이미지. 상자 B. LP에 확대 도시 된 영역에 갇힌 글루타메이트의 로컬 관류 용 피펫의 위치 및 방위를 나타내는 나타낸다. (B) 인접한 돌기 쪽 함께 덴 드라이트의 광 부분의 스택의 높은 전력 최대 투영. 광학 부분의 스택은 Z-정렬 및 디컨 볼 루션을 시행 하였다. 적십자는 uncaging 빔의 대상 영역을 나타냅니다. 점선은 오렌지 형광 방출이 기록되었던 관심 영역을 묘사한다. (노란색 플래시로 표시)에 갇힌 글루타메이트의 플래시 광분해에 의해 유도 전류 (아래 줄) 안쪽으로 나트륨 신호 (상단 행)와 체세포 : 상자가 왼쪽 D. (C)에 확대 표시 영역을 나타냅니다. 빨간색 선은 실험 데이터의 착용감을 나타냅니다. 회색 영역은 기간을 나타내는 uncaging 플래시 ((300)에갇힌 글루타메이트 미리 관류없이 동일한 UV 플래시하지도 SBFI 방출의 변화,도 내향 전류를 유발 (D) 좌측 :. 밀리 초)은 오른쪽 SBFI 형광의 촬상을 방해하지. 수지상 인접의 고성능 이미지 나란히, B에 묘사로, 반전 회색 값으로 같은 이미지를 등뼈. 점선은 형광 방출이 기록 된 관심의 영역을 나타냅니다. 적십자는 uncaging 빔의 현지화를 나타내는 오른쪽 :. 갇힌 글루타메이트의 UV-플래시 광분해에 의해 유도 된 나트륨 과도. 블루 추적 : 수상 돌기 나트륨 신호; 빨간색 추적 : uncaging 자리에 인접한 세 쪽의 응답을 평균; 녹색 추적 : 세 먼 쪽의 응답을 평균. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

리테이너 타입 로컬 재관류 후글루타메이트, 덴 드라이트에 가까운 UV 섬광을인가하는 세포 내 나트륨 농도 (도 6C, D 및도 7b)의 증가를 반영 SBFI의 형광 발광에서의 일시적인 감소되었습니다. 동시에, 안쪽으로 전류 소마 (도 6C 및도 7b)을 기록 하였다. UV 플래시의 지속 시간을 증가시키는 것은 시스템이 아니라 그것의 동적 범위 내에서 uncaging이나 셀룰러도 응답이 포화되었다는 것을 나타내는, 두 전류와 나트륨 신호 (미도 데이터)를 내측으로 유도의 진폭을 증가되었습니다. 갇힌 글루타메이트 사전 관류되지 않은 조각 동일하거나 더 긴 기간의 UV-플래시의 응용 프로그램이 신호는 글루타메이트의 uncaging (그림 6C)에 의한 것을 나타내는 SBFI 형광이나 안쪽으로 전류의 변화를 유발하지 않습니다. 또한, 이러한 결과는 imaging- 및 uncaging 구성 요소에는 상호 의존성 유 관찰되지 않았 음을 보여우리의 실험 조건 파인더. 나트륨 신호는 돌기 쪽이 (그림 6D)에서 검출 될 수있다. 우리는 단지 글루타메이트 uncaging 단일 척추 자극을 달성하지 못했지만, 피크 진폭 쪽이 더 멀리 부모 덴 드라이트 (그림 6D)로 거의 동일 형광 변화를 보여 주었다 반면, uncaging 지점에 가까운 쪽이 약간 높은 경향을 보였다.

마지막으로, 우리는 글루타메이트의 uncaging에 대한 응답으로 수상 돌기 및 등뼈에 나트륨 유입의 경로를 연구 하였다. 이를 위해, 우리는 각각 AMPA- 및 NMDA-아형의 나트륨 투과성, 이온 성 글루타메이트 수용체에 대한 선택적 차단제이다 CNQX 및 APV를 채용. 우리의 결과는 글루타메이트 - 유도 된 세포 내 나트륨 신호 및 유도 전류 체세포 이러한 차단제 (도 7b)의 존재를 생략되었다는 것을 나타낸다. 차단제의 워시 아웃시, 신호가 회복됩니다. 이 그쪽을 보여줍니다글루타메이트의 t의 uncaging 세포 내 나트륨 과도 안쪽으로 전류의 결과로, 수상 돌기 및 등뼈에 나트륨의 유입을 중재 CA1 피라미드 뉴런에 이온 성 글루타메이트 수용체를 활성화합니다.

유발 나트륨 신호와 내부 전류의 그림 7 약리 프로필. 소마에 부착 (A) 패치 피펫 (PP)와 SBFI 가득 CA1 피라미드 신경 세포 (B) 왼쪽 :. 나트륨 과도와 수상 돌기에 갇힌 글루타메이트의 사진 활성화에 의해 유도 된 체세포 현재와 연결된 척추 센터 :.와 관류 이온 성 글루타메이트 수용체 차단제 CNQX 및 APV는 나트륨 신호와 uncaging에 의해 유도 된 안쪽으로 현재를 모두 억제 오른쪽 :. 차단제의 워시 아웃시, 신호가 복원됩니다. 빨간색 선 represen실험 데이터의 적합의 TS. 회색 영역은 uncaging 플래시 (300 밀리 초)가 SBFI 형광 이미징을 방해하는 기간을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 연구는 SBFI 작은 세포의 세포 내 구획 나트륨 과도 이광자 촬상에 적합하다 보여준다. 그것은 SBFI의 양자 효율은 나트륨 농도가 다소 낮은 ¹⁵ 상대적인 변화가 생리 활성을 갖는 아주 작은이라는 점을 명심해야한다. 따라서, 미세 공정에서 나트륨 ^{+ 과도} 고분해능 측정이 비교적 지루한 작업이며, 여러 가지 실험의 비닝 (binning) 또는 평균화 양호한 신호를 얻을 필요가있다. 또한, 나트륨 과도 동력학 확장 된 시간 기간에 대해 기록하는 것이 의무화 놀랍게도 느리다. 이러한 관찰은 신경 돌기 교세포와 나트륨 과도 단지 수 붕괴 실온 ^1,2,6에서 10 초의 범위에서 큰 감쇠 시간 상수에 의해 특성화 된 곳 이전 연구에서 이들에 대응한다. 나트륨 과도 따라서 훨씬 느린 시간 협력을 발휘하는 것urse 칼슘 과도 ^(16)에 비해 훨씬 더 큰 감쇠 시상수.

이러한 단점을 따로 설정, 나트륨 이미징은 신경 세포의 하위 도메인의 생리 학적 특성 조사를위한 유용한 도구가 될 증명한다. 예를 들어, 나트륨 이미징 또는 가까운 활성 시냅스에 흥분성 시냅스 활동을 감시하는 역할을 할 수 있습니다. 나트륨은 본질적으로 ^{8, 17} 버퍼링되지 않으므로, 활성 유도 나트륨 과도 선형 시냅스 글루타메이트 방출 다양한 관련 또는 외생 글루타메이트를 적용한다. 그들은 따라서 신경 세포의 글루타메이트 활동의 직접적이고 공정한 지표를 나타냅니다. 또한, 나트륨 인디케이터 염료는 높은 K _D의 집 (SBFI의 K _(D)가 25 내지 ¹ mm의 범위에있다) 나타낸다. (- 1 ㎜ 통상 0.5), K의 높은 _D의이 염료 자체가 발을위한 버퍼로서 작용하지 않는 것을 의미하더라도 충분한 휘도를 달성하기 위해 사용되는 상대적으로 높은 세포 농도에서 염료odium. 결과적으로, 그들은 칼슘에 민감한 염료 셀 ^(18)에 도입 할 때 항상 문제가되는 나트륨 과도 전류의 진폭도 시간 과정을 왜곡하지 않습니다. 따라서 그것은 감​​지 된 신호가 세포 내 나트륨의 "진짜"변화의 좋은 척도를 나타내는 것으로 가정 할 수있다. 그들의 느린 시간 경과 후 뉴런에 대한 세포 내 나트륨 확산 속도는 이전에 ^19을 가정보다 훨씬 작은 것을 의미한다.

등뼈 및 수지상으로 흥분성 시냅스 전달 나트륨 유입 경로의 특성을 어드레싱 실험 성공적인 실행을위한 중요한 요구 사항은 시냅스 구조를 빠르고 높은 국부 활성화의 유도이다. 이는 척추의 직접 또는 근방 갇힌 화합물의 플래시 광분해 수지상에 글루타메이트 또는 글루타메이트 작용 물질의 신속하고 로컬 애플리케이션에 의해 얻을 수있다. 플래시 광분해하지 기계적 DAMA을 수행GE의 조직, 운동 유물의 무료이며 아니라 관련 질문의 조사를 위해 (예를 들어 지역의 칼슘 신호)를 설립한다. uncaging 스폿의 직경은 XY 평면 내에서 1.5 μM이었다. Uncaging 두 쪽의 가시 덴 드라이트에 의한 나트륨 신호에 가까운 부모 덴 드라이트 (dendrite). 신호 uncaging 스폿에 가장 가까운 쪽의 큰 경향 반면, 상위 덴 드라이트의 진폭과 등뼈가 여전히 멀리 uncaging 스폿의 직접적인 근방에서와 다소 유사 하였다. Uncaging 안쪽 전류 진폭이 증가하는 동안 300 밀리 초 동안 수행 하였다. Uncaged 글루타메이트가 멀어 uncaging 지점에서 수지상 영역과 등뼈에 이온 성 글루타메이트 수용체 나트륨 유입 활성화, 동일 기간 동안 조직에 확산 한 것이다.

셀 입욕 용액을 통해 투여 갇힌 화합물의 광분해를위한 UV 레이저를 사용할 때 발생하는 본질적인 문제'내부 필터링'입니다. 때문에 케이지의 높은 흡수율, UV 광 자극 사이트 ^{(20, 21)로부터} 대물 도중에 강하게 감쇠된다. 이를 방지하기 위해 적합한 방법은 또한 최소로 필요한 갇힌 화합물의 양을 감소 자극 사이트로 제한 케이지 로컬 관류이다. UV 레이저 주사 매개 uncaging, 근 적외선 이광자에 비해 uncaging ²² 자극 정밀도 z 축으로 증가하기 때문에, 주로, 공간적으로 더 정확하다. 한편, 때문에, 이광자 여기에 채용 높은 갇힌 화합물의 농도 또는 매우 높음 어느 잠재적 광독성 광도 필요할 때 장파장위한 일반적으로 사용되는 케이지 작은 횡단면. 또한, 이광자 uncaging은 장비에 훨씬 더 높은 투자를 필요로한다; 다른 사람의 사이에서, 추가로 IR 레이저 플러스 필요한 광학 부품이 필요하다.

SBFI 및 MNI 글루탐산 모두 동일한 파장 범위에서 고르기가있다. 이것은 uncaging 플래시 및 / 또는 IR 빔에 의해 글루타메이트의 연속 uncaging 의해 SBFI의 표백 결과, 레이저 및 UV uncaging SBFI 또는 IR 촬상 레이저 및 MNI-글루타메이트의 의도하지 않은 상호 의존성을 초래할 수있다. 도 6c에 도시 된 바와 같이 단, 어느 쪽도 그 자체 다 광자 촬상 의한 UV 플래시가 우리의 실험 조건 하에서 같은 상호 영향을 발생하지 않는다.

여기에 설명 된 것과 유사한 UV 점멸 시스템은 여러 실험실에서 일상적으로 사용되며, 비교적 용이하게 기존의 다중 광자 현미경 이미징에 혼입 될 수있다. 그것은 광분해 용 레이저 빔이 시야에 자유롭게 배치 될 수있는 장점을 제공한다. 또한, 시스템은 실험 기간 동안 시야에 각​​각 레이저 빔의 빠르고 자동화 재배치 및 박리 볼륨을, 가능하게한다. 오우R 개질 단순화 및 이미징 소프트웨어의 프레임이 복합적 으 이미징 uncaging 프레임들을 조정하는 역할을 할 수 있도록, uncaging 스폿의 정확한 위치 결정을 개선시킨다.

이와 함께, 글루타메이트의 자외선에 의한 uncaging에 대한 수정 절차와 결합 돌기 및 중앙 신경 세포의 등뼈에서 전체 세포 패치 - 클램프 및 다중 광자 나트륨 이미징, 조직의 글루타메이트 수용체의 신뢰성과 초점 활성화 할 수 있습니다. 따라서 그것은 본래 조직에서 신경 세포에서 흥분성 시냅스 전달 및 시냅스 나트륨 신호의 특성을 분석하는 역할을 할 수있다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosilicate-glass capillaries	Hilgenberg	1405059	75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm
Camera	Jenoptik	ProgRes MF	IR-DIC compatible camera
Deconvolution software	SVI	Huygens Pofessional X11
Fiber optic spectrometer	Ocean Optics	USB 4000	Miniature fiber optic spectrometer
Filter tubes	VWR		cenrifugal filter, 0.2 µm
Imaging software	Olympus Europe	Flowview Ver 5.0c, Tiempo
IR beam power controller	Custom built		Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell
IR laser	SpectraPhysics	Mai-Tai	fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION
IR power monitor	Custom built
Micromanipulator	Burleigh	PCS 5000
Microscope/Imaging System	Olympus Europe	BX51WI/FV300	Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified
ND filter wheel	Newport	50Q04AV.2	UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0
Objective	Nikon Instruments Europe	NIR Apo 60x/1.0w
Patch clamp amplifier	HEKA	EPC-10
Pipette puller	Narishige	Model PP-830
Pneumatic drug ejection system	NPI Electronic	PDES-DXH
Pockels cell	Conoptics	350-80 LA-BK	EOM, used as fast switch and for power adjustment
Pockels cell driver	Conoptics	M302-RM	High voltage differential amplifier
Shutter	Vincent Associates	LS6ZM2	ALMgF2-coated BeCu blades
Shutter controller	Custom built
Shutter driver	Vincent Associates	Uniblitz VCM D1
Slicer/Vibratome	Thermo Scientific	Microm HM 650 V
Uncaging software	Rapp OptoElectronic	UGA40 1.1.2.6 + NetCam
UV laser	Rapp OptoElectronic	DL-355/10	cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION
UV laser scanning system	Rapp OptoElectronic	UGA 40	Galvanometric scanning system
Name of Compound	Company	Catalog Number	Comments/ Description
CNQX	Sigma Aldrich	C-127	AMPA receptor antagonist; CAUTION
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	NMDA receptor antagonist; CAUTION
SBFI K+ salt	Teflabs	OO32
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION
NMI-caged-L-Glutamate	Torcis	1490	Caged glutamate released upon UV absobtion