Kemokin Sinyalizasyonu Bağlı Hücresel ve Moleküler Polarizasyon Hızlı ve Sağlam Analizi

Özet

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Özet

Hücreler, bir süreç olarak adlandırılan kutuplaşma onların yuvarlak kaybederek ve birçok proteinlerin hücre içi lokalizasyonu değiştirerek uyarılmasını kemokin cevap. Klasik görüntüleme teknikleri bu olguları incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, morfolojisi ve hücre onlarca boyama eş-lokalizasyonu zaman alıcı miktarının ardından birçok hücrede elle toplama gerektiriyordu. Burada, hızlı ve güçlü bir yöntem, bir sitometresinde kişilerce mikroskop avantajlarını bir araya teknolojisi sitometri bir görüntüleme akışı kullanılarak hücrelerin birkaç bin oluşan numuneler üzerinde, bu olayları incelemek için tarif edilmektedir. MHC sınıf I molekülleri ve filamentli aktin için CCL19 ve boyama ile uyarılmış T lenfositleri kullanılarak bir yolluk stratejisi aynı zamanda şekil değişikliklerinin derecesi ve CCL19 sinyal etkilenen belirteçlerin eş-lokalizasyonu derecesini ölçmek için sunulmuştur. Üstelik, bu yolluk strateji gözlemleme için bize izine CXCL12 uyarıldıktan sonra polarize T hücrelerinde (ön) ipliksi aktin ve (arkada) fosforile Ezrin-Radixin-moesin (fosfo-ERM) proteinlerin ayrımı. Par6 / atipik PKC sinyal yolunun mutantlar bir farmakolojik inhibitörü ve ifade ile aktin polimerizasyonu inhibe: Bu teknik aynı zamanda iki farklı unsurların kutuplaşma engelleme etkisini gözlemlemek için yararlı oldu. Böylece, kanıtlar bu tekniğin morfolojik değişiklikler ve protein yeniden dağıtımı esnasında hem de analiz etmek yararlı olduğu gösterilmiştir.

Giriş

Kemokinler özel yerlere ¹ hücreleri çekmek küçük çözünebilir proteinlerdir. Bu nedenle, bu dokularda hücre doğru konumlandırılması, geliştirme ve fizyolojisi çok önemli bir işlevine katılırlar. Bu, etkili bir bağışıklık karşılığının ortaya çıkarılması için birlikte hareket birçok farklı hücre tiplerinin hareketlerine dayanır, bağışıklık sistemi, bu kurala istisna değildir. Yabancı antijenler tespit ve nötralize edilebilir önce belirli bir durumda bir bağışıklık hücre tipi özel konumunu kontrol ederek, kemokinler önceden gerekli bulunmaktadır.

Özellikle T lenfositleri kemokinler T hücresi hareketliliği ^2,3 tercih geçişi üzerine, hücreiçi sinyal ortaya, özel yüzey reseptörleri (kalsiyum yükselişi ERK fosforilasyonu, Rho GTPazlar aktivasyonu, integrinler afinite ve sitoskeletal değişimler artış) bağlanır. Hücresel düzeyde, bir kemokin stimülasyon üzerine ortaya morfolojik değişiklikler gözlemleyebilirsiniz.Hücre şekilleri bu değişiklikler T hücrelerinin özellikle dramatik: kanda seyahat ederken dinlenme T hücreleri, bir boncuk gibi yuvarlak morfoloji var. Ön bir ön kenarı: Bununla birlikte, iltihabik bölgelerde veya lenfoid organların yakınlık kemokinlerin varlığı algılama hemen iki kutuplu bir formundan oluşan tipik bir "el ayna" morfolojisi kabul T hücrelerinin şeklinin değiştirilmesi için gidiyor ve arka ⁴ bir arka kenar veya uropod. Buna ek olarak, hücre içi bileşenleri göç sürdürmek için polarize T hücresinin bu iki zıt bölgeye ayırmak olabilir. Örneğin kemokin uyarımı ⁵ ve polimerize aktin üzerine aktin filamentler polimerizasyon artar kutuplaşmış T hücresinin ² ön birikir. Öte yandan, bu tür kortikal F-aktin hücre iskeleti, plazma membranı bağlantı Ezrin-Radixin-moesin (ERM); ailesinin fosforile proteinler gibi bazı proteinler, kutuplaşmış uropod yeniden lokalizeT hücreleri, ^6. İlginç bir şekilde, ve diğerleri, bu kutuplaşma süreci T hücre göçü için gerekli olduğunu göstermiştir. Nitekim, polarizasyon müdahale herhangi bir tedavi hücresel hareketliliğini engeller. Örneğin, atipik protein üyelerinin etkinliğinin engellenmesi, C (PKC), aile, PKCζ ve PKCι blok T hücresi polarizasyon ve dendritik hücrelerin ⁷ için göç tarama işlemini kinaz. T hücre kutuplaşma da Rho GTPases tarafından düzenlenir. Son zamanlarda tarif edildiği Fam65b proteini ile RhoA aktivitesinin modüle bir Transwell tahlilinde ⁶ geçirilecek T hücre morfolojisindeki değişikliklerle ve kapasiteyi etkiler göstermiştir. Polarizasyon hücre motilitesi için bir ön adım olarak, kemokin tepkilerin ana okuma olarak ölçmek mümkün böylece önemlidir. Hücre şekli değişiklikleri önceden elle ⁸ ölçüldü. Ancak, miktar bu tür çok zaman tüketen olduğunu, genellikle sadece birkaç yüzdenhücre on dikkate alınmaktadır.

Burada, yeni bir yöntem hızlı uyarımı kemokin maruz bırakılan T lenfositlerinin şekil değişiklikleri derecesini ölçmek için sunulmuştur. Teknoloji sitometri bir görüntüleme akış kemokin stimülasyon farklı koşullarda verimli polarize hücrelerin miktarını ölçmek için bir akış sitometresinde ve bir mikroskop ⁹ avantajlarını birleştiren, kullanılan (Belirli Reaktifler / Ekipman Tablo). Bir bu teknoloji ile sağlam ölçebilen morfolojik değişimlerin değerlendirilmesiyle ek olarak, bu kemokin sinyali üzerine, bazı proteinlerin hücre altı lokalizasyonda değişiklikleri değerlendirmek için de mümkündür.

Protokol

T Lemfositleri hazırlanması 1.

1. ^10,11 tarif edildiği gibi primer, fare veya insan T hücrelerini hazırlamak.
2. 3 x 10 ⁶ hücre / mL - 2 arasında bir yoğunlukta% 10 insan serumu AB ile tam RPMI ortamı içinde insan T hücrelerini yetiştirmek.
   Not: kültürde insan T hücrelerinin büyük bir kısmını kendiliğinden polarizasyon ortaya fetal sığır serumu (FCS) yerine, insan serumu kullanılması. Bu dönemde herhangi bir zamanda 5 gün ve daha fazla işlem onları - 4 kültürde bu hücreleri tutun.
3. Benzer bir hücre yoğunluğunda,% 10 FCS ile desteklenmiş tam RPMI ortamı içinde fare T hücrelerini koruyun. 10 ng / ml IL7 mevcudiyetinde 37 ° C 'de hemen ya da ertesi gün, bir O / N kültürden sonra kullanın.
4. Tam RPMI,% 10 FCS ile takviye edilmiş CEM insan T hücre soyu geliştirin.

2. Kemokin Uyarım

1. 10 mM HIPE ile desteklenmiş sıcak HBSS ortamında deneysel koşul başına 5 x 10 ⁵ hücre yıkayıns. Bazı deneyler için, 2 ug pmaxGFP ve 8 ug pcDNA3.1 ⁺ (boş vektör kontrol), ölü yer PKCζ kinaz ya da N-ucu Par6 plazmidler ile bir gün önce, primer insan T hücrelerinin ko-transfekte.
2. Sıcak HBSS-hepes ortamında hücre pelletini (deneysel koşullar 0.3 ml x numarasını kullanın).
3. 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine hücreleri dağıtın.
   NOT: Bu nedenle, tek bir deneysel koşuluna karşılık gelen bir boru, 0.3 ml HBSS-HEPES ortamında 5 x 10 ⁵ hücre içerir. Bazı deneyler için, 500 nM Latrunculin A veya aracı (DMSO) ilave ediniz ve kemokin uyarılmadan önce 30 dakika için kuluçkalayın.
4. Her bir tüp içinde 10 ng / ml CCL19 veya CXCL12 kemokin 500 ekleyin.
   NOT: Biz genellikle 10 kullanın - İnsan T hücreleri için 200 ng / ml kemokini. CEM hücreleri CCL19 bağlayan CCR7 reseptörü ifade yoktur. Bu nedenle, CEM hücreleri sadece bir CXCL12 uyarısına cevap mümkün olacak. 500 N - Ayrıca, daha yüksek bir kemokin konsantrasyonları (300 kullanımıg / ml) fare T hücrelerini kutuplaşmaya.
5. Tüpler birkaç kez ters çevirin ve sırasıyla, birincil T hücrelerinin veya CEM 8 ya da 10 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde inkübe.
6. Her bir tüpe,% 2 paraformaldehit (PFA) ile PBS içinde 10 mM Hepes ihtiva eden ılık bir çözeltiye, 0.3 ml ilave etmek suretiyle polarizasyon işlemi durdurun. Tüpler ters çevirin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe.

3. Renklendirmeler

1. Tüpler akış sitometri mikrosantrifüj tüpleri hücreleri aktarın.
2. % 1 sığır serum albümini (BSA), 0.5 mM EDTA ve PBS içinde 10 mM Hepes ihtiva eden bir RT çözeltisi ile tam olarak tüpler doldurun.
3. 4 dakika için 460 xg'de tüpler santrifüj.
4. Süpernatant atılır ve PBS içinde% 5 FCS ihtiva eden bir RT çözeltisi 100 ul süspansiyon hücrelerin.
5. Işıktan uzakta, girdap onları, her bir tüp içinde FITC-anti-HLA-ABC 5 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe.
6. PBS,% 5 FCS ihtiva eden bir kez hücreler yıkayınSadece bir kez PBS ile nd.
7. Oda sıcaklığında: daha sonra% 1 BSA, 0.5 mM EDTA ve PBS içinde 10 mM HEPES içeren bir solüsyon ile yıkama hücreleri, 10 dakika süre ile inkübe edilir, 500 ul% 1 PFA ekleyin.
8. Süpernatant atılır, PBS,% 0.2 BSA,% 0.1 saponin, 0.5 mM EDTA ve 10 mM Hepes (permeabilizasyon tamponu) ihtiva eden bir çözelti ile tamamen tüpleri doldurun.
9. Bu ortam içinde hücreler iki kez yıkayın.
10. Orta kaldırmak ve hücre pelet ayırmak için onları vorteks tüpleri çevirin.
11. Her bir tüpe, anti-P-KRY antikorun 100 seyrelti, girdap onları ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir: ve / veya 1 ila 0.25 ug / ml TRITC-falloidin ekleyin.
12. Permeabilizasyon tampon maddesi ile hücreleri yıkayın. Bir fluorescent sekonder antikor gerektiğinde kuluçkalayın.
13. 200 ul PBS hücrelerin tekrar ve mikrosantrifüj tüpler aktarabilirsiniz.
    NOT: Hücreler edinimi için hazırız. Tüp başına 200 ul maksimum toplam hacmi korurken, alternatif olarak, bir son% 1 konsantre PFA eklemekHücreler daha fazla işlem için aynı gün kullanılmak üzere takdirde için yoğunlaştırma lekelenmelerinin korumak için.

4. Görüntüler Toplama ve Analiz

1. Aparat (Belirli Reaktifler / Ekipman Tabloya bakınız) açın ve üreticinin talimatlarına göre kendisini kalibre edelim.
   NOT: INSPIRE yazılımı 40X objektif (0.75 NA) ile kullanılmıştır. FİKİRLER 3.0 yazılımı tüm bildirilen sayımsal için kullanılmıştır.
2. Gelecek deneyler için bir şablona kaydedilebilir satın alma pencereleri bir dizi hazırlayın. RMS degrade değerlerini ölçmek histogramlar çizin. RMS degrade histogram seçilen "Focus" nüfus itibaren, Alan histogram "Tek hücreli" nüfus sınırlandırmak. Mikrosantrifüj tüpü makinesinde yerleştirildikten sonra, tek tek hücreler ile bir kapı lazer gücünün ayarlanması ve 5000 T lenfositleri kazanır.
3. Yumuşak Fikirlerware, satın alma dosyasını açın ve her hücre için elde edilen parlak bir alan görüntüler için degrade RMS değerini gösteren bir histogram (Kanal 1) oluşturun. 57 Yukarıda RMS degrade değeri sergileyen hücreler gördüğü RMS degrade histogram üzerinde bir kapı çizin.
   NOT: RMS degrade analizinde odak düzleminde sadece T lenfositler dikkate alarak sağlar. Bu 57 um'nin RMS gradyan değeri gösteren tek tek hücreler odak düzlem içindedir ve doğru olarak kabul edilebilir ampirik olarak tespit edilmiştir.
4. Analiz / Maskeler menüsünde, 2 piksel aşınmış aydınlık görüntüler M01, üzerinde morfoloji maskesinden (M01,2) Erode denilen, yeni bir maske oluşturmak. Ardından, Analiz / Erode (M01,2) maske hesaplanan Area, yeni bir özellik oluşturmak, menü bulunmaktadır. Bir önceki kapısı seçilen hücrelerden, bu yeni oluşturulan maske kullanarak hücrelerin Alan gösteren bir histogram açın.
   NOT: ulaşırsınız morfoloji maskeleriVarsayılan hücrenin gerçek boyutundan daha büyüktür. Böylece, 2 piksel o kadar aşındırmak için daha hassas.
5. Kalibrasyon boncuk ve enkaz (küçük Alan) ve çiftler (büyük Area) hariç, bireysel T hücreleri üzerinde bir kapı çizin. Her satın alma bu kapıyı ayarlayın.
   NOT: Hücre boyutu varyasyonlar kapısı konumunu etkileyecektir. Fare T hücrelerinin kendilerini CEM hücreleri daha küçük olan insan T hücrelerinin daha küçük olduğu için, her hücre tipi alan büyüklüğü ile orantılı olacaktır.
6. Önceki adımlarda Geçitli edildi tek odakta hücreleri göz önüne alındığında, Phalloidin Raw Max Pixel bir fonksiyonu olarak HLA-ABC boyama Raw Max Pixel (Kanal 2, x ekseni) oluşan bir nokta arsa açmak boyama (Kanal 4, y ekseni). Lekesiz veya doymuş floresan olayları dışlamak için bir kapı oluşturun. Ham Max HLA-ABC için Pixel (Kanal 2) ve Phalloidin (Kanal 4) lekelenmelerinin gösteren Aç iki histogramlar.
7. Analiz / Maskeler menüsünde, creat içinde2 piksel aşınmış HLA-ABC boyanmış hücreler (Kanal 2), morfolojisi maskesinden (M02,2) Erode denilen adet yeni maske. Ardından, Analiz / Erode (M02,2) üzerinden hesaplanan Circularity parametresi oluşan yeni bir özellik oluşturmak, menü bulunmaktadır.
   NOT: Bu parametre, bir daire hücre şeklinin sapmasını ölçer. Bu nedenle, mükemmel yuvarlak T hücresi düşük dairesellik endeksi sergileyecek uzatılmış polarize hücreler ise yüksek bir yuvarlaklık değerine sahip olacaktır.
8. Daha sonra, daha önce kapı hücrelerden Circularity özelliği değerlerini rapor başka bir histogram yaratmak. Doğrudan her bir hücre için daireselliğe değerine göre bir birey, odakta hücre popülasyonu dağılımının çizmek için bu histogram kullanın.
9. Uyarılmamış hücrelere için histogram şeklinde bakıldığında, dairesellik sınır değerine kadar düşük dairesellik değerden başlayarak polarize hücreler için bir kapı çizmek burada Uyarılmamış hücrelere ençizilmiştir. Kapılı nüfus arasında polarize hücrelerin yüzdesi istatistikleri ekrana bak (% Geçitli).
   NOT: Biz 13 altında Circularity indeks değerleri için bu kapıyı belirledik.
10. Hücrelerde aktin boyama kutuplaşma bakmak için, HLA-ABC boyama (Kanal 2) ve falloidin boyama karşılaştırarak, Parlak Detay Benzerlik R3 değeri için histogram arsa (Kanal 4).
    NOT: Bu özellik büyük değeri, en fazla iki Renklendirmeler vardır bindirilmiş.
11. Daha önce olduğu gibi aynı yolluk strateji kullanarak, polarize aktin boyama ile hücrelerin yüzdesini gösterir ayrılmış boyama için, uyarılmamış hücreler ile bir kapı çizilir.
12. Tamamlandığında, MHC Sınıf I ve falloidin boyamalar, birlikte SD ± bütün hücrelerin Circularity ve Benzerlik indeksleri ortalama değerleri ile polarize hücrelerin yüzdesi dağılımında bir ayrımı sergileyen hücrelerin yüzdesi Nominal değerden uygun olarak gösterilmektedironding istatistik paneller.

Sonuçlar

Burada seçilen ilk örnek CCL19 ile uyarılmış insan primer T lenfositlerinin kullanımı ile ilgilidir. Bununla birlikte, aynı strateji primer fare T hücreleri, T hücre çizgileri ya da kemokin stimülasyona yanıt veren herhangi bir başka hücre tipi ile kullanılabilir. Burada sunulan yolluk strateji odaklı olaylar, ardından tek hücreleri seçin pencerelerin bir dizi içerir. (Şekil 1) veya CCL19-uyarılmış (Şekil 2), T lenfositleri istirahat için MHC Sınıf I HLA-ABC...

Tartışmalar

Sitometri, hızlı ve bilgilendirici yolluk strateji kemokin uyarımı ile uyarılan hücresel ve moleküler olayları analiz etmek görüntüleme akışının son teknolojiyi kullanarak sunulmuştur. Kemokin uyarılması ve polarizasyon sürecinde farklı proteinlerin hücre içi dağılımı ile oluşturulan hücre morfolojisi değişiklikleri: Tek bir deney itibaren, bir iki ana bilgi edinebilirsiniz. İlginç bir şekilde, kanıtlar da istatistiksel sağlamlık ve bütün hücre nüfusun küçük bir fraksiyonu ilgi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Gibco	61870-010
Human serum AB	PAA	C11-021	Pre-heat to inactivate the complement.
Fetal calf serum	PAN Biotech	P30-3300	Pre-heat to inactivate the complement.
Human T cell nucleofactor kit	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Warm in 37 °C water bath before use.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CCL19	Peprotech	300-29B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CXCL12	Peprotech	300-28A	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 phalloidin	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC antibody	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM antibody	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis