Oncolytic virüs klinik öncesi Değerlendirme Çalışmaları Pamuk Rat Taşıma

Özet

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Özet

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Giriş

Onkolitik virüsler (OV) seçici olarak normal ve tümörlü hücrelerde ^1,2 arasındaki biyokimyasal farklılıklar yararlanılarak tümör hücreleri içinde replike. Doğal olarak meydana gelen doğal tipte virüs ifade seçici oncolysis elde etmek için bir mutasyon gerekmez olanlar, seçici oncolysis elde etmek için tasarlanmış olmalıdır ki bu: Ovs iki türü vardır. Belirli bir tümör türü içinde mutasyonların koleksiyonu OV ² normal hücreler üzerinde selektif büyüme avantajı doğasını belirler. kullanılarak Ovs güvenlik ve faydaları, klinik çalışmalarda ^3-7'de gösterilmiştir. Onkolitik viroterapi alanında ilerlemelere rağmen iyi modeller Ovs antitümör etkinliğini değerlendirmek için gerekli olduğunu düşündüren, klinik öncesi ve klinik sonuçlar arasındaki boşlukları söz konusudur.

Sığır herpes virüs tip 1 (BHV-1) Herpesviridae ailesinin üyesi ve Alphaherpesviridae alt familyası olduğunu. BHV-1 başlatılmaktadırates kötü bir soğuk ^8,9 benzeyen belirtiler geniş bir yelpazede tezahür, sığırlarda solunum hastalığı kompleksi bovin. BHV-1 gibi, heparan sülfat ve adiponektin-1, ^10, HSV-1 tarafından kullanılan bağlanma ve giriş reseptörleri bağlar. Bununla birlikte, adiponektin-2 ¹⁰ yerine CD155 bağlanır. BHV-1 verimli girerek, normal ve transforme hücreler sıçangil ^3,4,10 çoğaltma başlatmak için mümkün olduğu şekilde çok dar bir konakçı yelpazesine sahiptir. Bu geleneksel fare modelleri kullanımı sorunlu hale getirir. BHV-1 onkolitik kapasite in vitro ^11,12 gösterilmiştir. BHV-1 göğüs kanseri hücreleri ve meme kanseri başlatan hücrelerin ^11,12 dahil olmak üzere histolojik kaynaklı çeşitli insan tümör hücreleri içinde replikasyonunu başlatır ve öldürmek için gösterilmiştir. Bununla birlikte, BHV-1 ve anti-tümör kapasitesi İmmün kapsamında, in vivo olarak değerlendirilmesi gerekir.

İnsan Adenovirüs (Ad), hangi57 tanımlanan serotipi en yaygın insanlarda solunum hastalığa neden vardır. Onkolitik Ad vektorlerı çeşitli klinik denemeler ^13-15 ilerlemesini ile anti-tümör etkinliği için değerlendirilmiştir. Umut verici klinik öncesi verilere rağmen, klinik sonuçlar beklentilerini kısa düştü. Virüsün ^16,17 bağışıklık tepkilerinin zayıflatılmış sergileyen, ancak insan tümör ksenograft modelleri, tipik olarak, Reklam vektörlerin antitümör etkinliğini incelemek için kullanılır. Ayrıca, singeneik fare modelleri, Reklam enfeksiyona olmayan toleranslılar ^17,18 pratik bu modelleri kullanarak konak bağışıklık tepkilerinin değerlendirme yapılırken.

konukçu bağışıklık sisteminin Ovs tümör hücre ölümünü ¹⁹ ortaya olan en etkili bir mekanizma olarak tanımlanmıştır. Ile tolerize edilmiş ve tolerize edilmiş olmayan tümörle birleşmiş antijeni arasında antitümör tepkiler (TAD) modelleri farklıdır ve büyük ölçüde OV tedavinin başarısını etkiler. HSV-1 OV KM100 (ICP0 ^{n21220) 20,21 1814 VP16} bir murin Polyoma Orta T antijeni meme kanseri modelinde ²² tümör taşıyan farelerin% 80 tümör regresyonu ortaya çıkardı. Bununla birlikte, HER-2 / neu modellerinde KM100 antitümör etkinliği, transgenik farelerde sinjeneik farelerde% 20 tam bir gerileme ve tümör staz arasında değişmiştir, fareler HER2 tolerans kazandırma. Birlikte bu veriler tamamen iyi tamamen tedavi başarısını belirlemek özellikleri anlamak için insan bağışıklık manzara özetlemek hayvan modelleri kullanılarak Ovs değerlendirilmesinin önemini vurgulamak.

⁽⁵ gözden gibi), Kuzey ve Güney Amerika yerli pamuk sıçan (Sigmodon hispidus), en sık RSV enfeksiyonuyla bir model olarak kullanılmaktadır. Bunlar ^6,23 kompleks sığır solunum hastalığı ile bağlantılı patoloji özetlemek olarak pamuk fareleri aynı zamanda anti-BHV-1 aşı araştırmalarında kullanılmıştır. Pamuk sıçan Ayrıca, BHV-1 enfeksiyonuimmünojenik olan sürekli mukozal hem de sistemik bağışıklık tepkilerini ^6,23-25 ​​uyarılması. Hücre hatları, spontan fibrosarkom ve meme bezi (fazla tercih) ve kemik (TÇHK ve VCRT) sırasıyla ²⁶ ve osteosarkom elde edilmiştir. Pamuk fareler Reklam enfeksiyona yatkın olarak onkolitik Reklam vektörleri in vivo etkinliğini değerlendirmek ve insanlarda ^27-29 benzer bir patoloji gösteren için kullanılmıştır. OVS öncesi klinik değerlendirme için immün sistemi baskılanmış modellerin kullanımı sadece tedaviye klinik yanıtlar daha az göstergesidir ancak onkolitik viroterapi ^30,31 dikkate bağışıklık sisteminin rol almak için başarısız. Bu nedenle, singenik ve meme kanseri ve osteosarkom tümör-Tolerize pamuk sıçan modelleri, geleneksel kemirgen modelleri kullanılarak okudu olamaz gibi BHV-1 gibi OVS ve Ad öncesi klinik etkinliğini değerlendirmek için ilgili modellerdir.

Protokol

NOT: kullanılan protokoller Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi'ne göre McMaster Üniversitesi'nde kurumsal Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Deneyler McMaster Üniversitesi Merkez Hayvan Tesisleri'nde gerçekleştirildi.

1. Kültürleme fazla tercih Hücreler

1. Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde kültür fazla tercih hücreleri,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiştir. 37 ° C 'de, T-150 doku kültürü şişelerinden hücreler korumak ve% 5 _CO2. Geçiş hücreleri% 90 konfluent tek tabaka (2-3 günde, Şekil 1) oluşturmak zaman.
2. Ön sıcak 1x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), hücrelerin bölünmesi önce 10 dakika için 37 ° C su banyosu içinde 1 x tripsin ve orta.
3. Aspire şişeden orta ve 1x PBS 5 ml hücreleri yıkayın.
4. Duruladıktan sonra, PBS aspire ve inkübehücreler kadar 1x tripsin 2 ml hücre şişeye (yaklaşık 2 dakika) çözülür.
5. Yumuşak ve (10 mi hücre süspansiyonu, toplam), 8 ml ortam içinde yeniden süspanse hücreler, hücrelerin yığınları parçalamak için yukarı ve aşağı pipet ve.
6. Yan hafifçe yan ve kaya şişeye (T-150 25 ml toplam) 24 ml ortam içine 1 ml hücre süspansiyonu, tohumlama ile, bir T-150 şişesi içinde hücrelerin muhafaza edin. Bir sonraki bölünme kadar 37 ° C'de ve% 5 _CO2 hücreleri koruyun.

2. fazla tercih Hücreleri Virüs Çoğaltma ve Sitotoksisite Değerlendirilmesi

1. Virüs Çoğaltma
   NOT: yerli viral promoterlerin kontrolü altında yeşil floresan proteini (GFP) gibi bir floresan etiketi sentezleyen Virüs yapılan, virüs enfeksiyonu vizüalizasyon ve floresans plaka okuyucusu kullanılarak yayıldı.
   1. Sayma için kuyu bırakarak kültür plakaları içine Tohum fazla tercih hücreleri,. Tohum hücreleri gibi onlar bir gün sonra% 80-90 konfluent olacak. 10 ⁵ cel bir konsantrasyon kullanınls / ml (oyuk başına 100 ul) 96 oyuklu düz tabanlı plakalar içinde bir gün sonra, istenen konfluent üretilir.
   2. Bir sonraki gün, önceden sıcak 1x PBS, 1 x tripsin, 10 dakika önce deney başlamadan 37 ° C su banyosu içinde tam ve serumsuz ortam.
   3. Iyi yüzeyi üzerine sallanmasıyla 1x PBS, 5 ml iyi sayma ve durulama hücrelerden aspire ortamı.
   4. Durulamadan sonra, hücreler kadar 1x tripsin 2 ml PBS aspire ve inkübe hücreler şişeden (~ 2 dakika) çözülür.
   5. Bir hemasitometre kullanarak sayılabilir aralığı içinde bir hücre yoğunluğu vermek üzere tam orta uygun hacimde tekrar süspansiyon hücreleri. Doğru bir hücre sayısını sağlamak için, önce iyice yukarı ve aşağı pipetleme hemasitometre aşılamak için hücre süspansiyonu karıştırın.
   6. Enfeksiyon istenen çokluğu (İçişleri Bakanlığı) enfeksiyonu için gerekli virüs stokunun hacmini belirleyin.
      Birimleri Şekillendirme Gerekli Paque (pfu) = kaplama hücrelerinin sayısı * İçişleri Bakanlığı(Pfu / hücre)
      Virüs stokunun hacmi gerekli = gerekli pfu / virüs stok titresi (pfu / ml)
   7. Tüpler, serum barındırmayan ortam içinde, virüs inokulum hazırlayın. Hücrelere inokulum eklemeden önce vorteks veya pipetle iyice karıştırın.
   8. Bundan sonra DMEM +% 1 FBS bakım paylaşımı uygulama, 37 ° C de 1 saat süre ile hücreleri enfekte etmektedir.
   9. Tarama plakaları bir ve iki gün sonrası enfeksiyon (pi) GFP floresan görselleştirmek için.
2. Virüs Sitotoksisite
   NOT: Bileşik ışığa gibi düşük ışık koşullarında resazurin sitotoksisite deneyi gerçekleştirin. Aynı içeren ortam, sadece eşiğe düzeltmek için dahil edilmelidir.
   1. 1x PBS resazurin,% 5 (h / h) çözeltisi hazırlayın. Pipetleme tarafından çözüm karıştırın.
   2. Hücrelerden aspire orta ve% 5 resazurin çözümü uygulayın. Iyi içeren ortamı sadece eşiğe düzeltmek için ekleyin.
   3. 37 ° C'de 30 dakika boyunca kuluçkaya bırakılır C, sonrabu, bir floresan plaka okuyucu (eksitasyon 530 nm, emisyon 595 nm) kullanılarak floresans okundu.
   4. Eşiğe için düzeltme bulaşmamış kontrollere veri göreli analiz.

3. Konut ve Taşıma

1. Konut ve Diyet
   1. Ev pamuk fareleri tek tek kemirgen yatak (1/8 "mısır koçanı yatak), artık zenginlik olarak 8 inç ve nestlets daha PVC boru (Şekil 2) bir bölümünü içeren polikarbonat sıçan kafeslerde de söndürme azaltmak için.
   2. Üstünlük kafesin oturmak ve kemirgen yiyecek ve su şişesi içeren bir güvenilir çelik sepet kullanın.
      NOT: Bu kafes kurulum büyük önem kafes varlığının ucuna karşı zenginleştirme tüpün yerleştirilmesi ile, hayvan güvenli ve kolay bir yakalama sağlayacaktır.
2. Kullanma
   1. Hayvan tesis teknisyenleri tarafından mermi önce önce heyecan verici bunları önlemek için, sabah pamuk fareleri Kolubir prosedür.
   2. Tüm işlemler sırasında, koruma için kalın deri eldiven giyin.
   3. Hayvanlar öncelikle zenginleştirme tüplerinde kalır gibi, rutin temizlik sırasında yeni bir kafes içine sıçan aktarmak için kullanabilirsiniz. Alternatif olarak, işleyici kendi elini ulaşmasına izin biraz kafesi açmak, hayvan sonra sadece omuzlar üstünde cildi Eksfoliyant ve aşağı iterek ölçülü olabilir. Hayvan kendi dilini ısırabilir olarak Pratik bakım aşırı güç kullanmak değil.
   4. Sabırlı olun ve hayvanlar güçlü bir uçuş veya dövüş yanıt var ve çalışıyor ve kafesin dışına atlayarak yakalama önlemek için çalışacağız olarak istikrarlı bir elinizi kullanın. Derinin büyük oluşacak gibi Önemlisi, kuyruk hayvanlar dokunmayın.
   5. Tuzak doğrudan kullanım üzerindeki zenginleşme tüpler hayvanlar. Bu büyük ölçüde yaralanmaları ve kaçan azalır.

4. Yakalama ve Anestezi

1. Ele geçirmek
   1. Koruma için kalın deri eldiven giyinTüm işlemler sırasında iyon.
   2. Hava ve bir kapak, kap ve gaz çıkış hortumunun (Şekil 3) takılan bir burun konisi sığacak kadar büyük bir indüksiyon odası için delikli bir büyük şeffaf plastik kap kullanın.
   3. Prosedür daha verimli hale getirmek ve izofluran, bir inhalasyon anestezik hayvanların maruz kalma süresini azaltmak için çiftler halinde çalışın. Emin bir araştırmacı olun (işleyicisi # açılması ve kafes çelik kapağını yerine ve indüksiyon odasının kapağı (1 işleyicisi #) sorumludur ve onların ortak indüksiyon odasına tüp ve ulaşım hayvanın yakalanması için sorumlu 2).
   4. Düz bir yüzeye yerleştirin ve kafesi dış kapağı çıkarın. Biraz çelik besleme tepsisini kaldırın ve kafes kenarları ve arka karşı paralel çok yavaş zenginleştirme tüp manevra. Gerekirse, hayvan ajitasyon önlemek için kafes açmadan zenginleştirme tüp manevra bir nesne kullanın (işlemekr # 1).
   5. Hayvan ajite olur ve tüp bırakırsa, hayvan dinlenmek ve bir kez daha tüp (işleyici # 1) yerleşmek için yeterli zaman tanıyın.
   6. Yavaşça ve kasıtlı kafes ile temas diğer ucunu tutarak, zenginleştirme tüp çelik kapak sağdaki kenarını kaldırın. Plastik kap (2 işleyicisi #) için yeterli bir alan, büyük olun.
   7. Bir yumuşak, hızlı bir hareketle, zenginleştirme tüp üstünlük plastik kap itin. Tüp hayvan bindirme kafesin yüzü kabın temas halindedirler. Mümkün (işleyici # 2) olduğunca çabuk adımlar 4.1.6 ve 4.1.7 gerçekleştirin.
   8. Çelik besleme tepsisini çıkarın ve # 2 (işleyici # 1) işleyicisi için plastik kap kapağı vermek. Süreç içinde sıkışıp hayvanın ekleri dikkatli olmak, kafes ve kabın yan arasındaki plastik kapağı kaydırın. Bu sonraki adım daha zor hale getirecek gibi kabı mühür etmeyin (işleyici # 2).
2. Anesthesia
   1. Emin konteyner kapalı kalır emin olun ve indüksiyon odasına hayvan taşıma. Hızla odasında hayvan koyun ve bir sıvı hareketi (işleyici # 2) konteyner kapağı kaldırın. Açın ve hemen indüksiyon odası kapağı yerine (işleyici # 1).
   2. Indüksiyon odasına (/ dak 5 L) izofluran akışının açın ve hızlı bir şekilde gaz dolaşımını kolaylaştırmak için indüksiyon odasından çıkarmadan tüp ve kap, hayvanın slayt point hangi uyuşukluk belirtileri için hayvan izlemek.
   3. Sıçan tam anestezi olduğunda, çalışma yüzeyine taşıyın ve burun konisi (Şekil 3) içine burun ve ağız yerleştirin. Sıçan tam olarak güçlü bir ayak tutam tepkisiz olduğunda anestezi.
   4. Kuruluk ve aşınmaları önlemek için hayvanın gözleri veteriner vazelin oftalmik merhem yerleştirin. Bu pamuk fareleri yaralanma olursa enfeksiyona eğilimli olabilir büyük gözleri var gibi önemli bir adımdır.
   5. dikkatlice izlemek ve sabit solunum hızını korumak ve hayvanın burnu prosedürü boyunca uydurma burun konisi içinde kalmasını sağlamak. Uygun izofluran akış hızını ayarlayın. izofluran miktarı her hayvan değişecektir uyutmak için gerekli.
   6. Post-işlem, kendi kafesine hayvan dönün ve tam hareketlilik ve sternum yatma kavuşur sağlamak.

Subkutan Tümör Oluşumu için fazla tercih Hücreler 5. hazırlanması

Not: fazla tercih biri, tamamen T-150 şişesi (% 90 konflüans) yaklaşık 2 x 10 ⁷ hücreleri elde edilir. Ihtiyaç duyulan hücre sayısı gerekli T-150 şişelerinde sayı tabanıdır. Elde edilir gerekli hücrelerin toplam sayısını sağlamak için ekstra şişeler Tohum ve hazırlık ve ekstra enjeksiyonlar için gerekli olan sırasında kaybedilen hücreleri karşılamak için. Hücre canlılığı uzatmak için mümkün buz üzerinde hücreleri tutun.

1. Balon hücreleri, aspire orta hasat1x PBS, 5 ml d durulama hücreleri.
2. PBS aspire ve hücreler, bir şişeye (yaklaşık 2 dakika) ayrışmasına kadar 1x tripsin 2 ml hücreleri inkübe edin.
3. Yumuşak ve (10 mi hücre süspansiyonu, toplam), 8 ml ortam içinde yeniden süspanse hücreler, hücrelerin yığınları parçalamak için yukarı ve aşağı pipet ve. Ek matara hücreleri hasat devam edin.
4. Bir konik tüp, 50 ml konik tüp başına yaklaşık 4, T-150s içine tüm hücre süspansiyonları havuzda toplayın.
5. Santrifüj, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 160 x g'de tüpü.
6. Kültür ortamı basınçla bir hemositometre kullanılarak sayılabilir aralığı içinde bir hücre yoğunluğu vermek üzere bir PBS uygun hacmi (T-150 başına 10 ml PBS) hücre pelletini. Doğru bir hücre sayısını sağlamak için, önce iyice yukarı ve aşağı pipetleme hemasitometre yükleme hücre süspansiyonu karıştırın.
7. Toplam hücre sayısını hesaplayın:
   Hücrelerin toplam sayısı = hücre sayımı (hücre / ml) toplandı X yeniden süspansiyon hacmi (mi)
8. BelirlemekTüm enjeksiyonlar için gerekli olan hücre süspansiyonu hacmi. Deneme başına 2-3 ilave doz olun. Deri altına enjekte, 5 x 10 ⁵ fazla tercih hücrelerinin toplam 3-4 gün içinde aşikar tümörler oluşturacaktır.
   Gerekli hücrelerin sayısı = 5 x 10 ⁵ hücre x doz sayısı
   Birim hücre süspansiyonu gerekli (mi) = (* toplamı, püskürtme miktarının gerekli olan toplam hücreleri) /, (hasat edilmiş hücrelerin toplam sayısı)
9. Pipet gerekli PBS içeren bir konik tüp içine, hücre süspansiyonu hacmi ve iyice karıştırın. Eppendorf tüpleri içine kısım tek enjeksiyonu (100 ul). Enjeksiyon işlemi sırasında buz şok koruyun.

6. Enjeksiyonlar

NOT: Bir süre başka izler hayvanın solunum hızı ve genel durumu ise anestezi altında iğne yapmak, iki araştırmacı olan prosedürleri uygulayın. Tüm enjeksiyonlar ve yeni bir iğne için insülin şırınga (29 g 0.3 mi, '1/2 x) kullanarakHer bir hayvan.

1. Deri altı enjeksiyonları
   1. Yakalama ve hayvan (bölüm 4) uyutmak.
   2. Makası kullanarak enjeksiyon bölgesini tıraş. Pamuk sıçan kürk kalın ve enjeksiyonlar için pürüzsüz bir yüzey elde etmek için keskin bir düzeltici gerektirir. Bir pamuklu çubukla kullanarak% 70 etanol ile enjeksiyon bölgesini temizleyin ve ilerlemeden önce tamamen buharlaşmasına izin verin.
   3. Yavaş ve sürekli bir şekilde çizerek hücreleri ile yüklenebilir şırıngalar (29 g x 1/2 ", 0.3 ml) eklenmiştir. Kabarcıklar bazı kuvvet ile şırınga belirgin fiske iseniz. Kabarcıklar üst basarak kez sıvı kadar piston iğne üstünde olduğunu.
   4. (Cilt çadırlaşması olarak anılacaktır) enjeksiyon yerinde cilt kaldırın ve iğne konik tarafı yukarı yerleştirin. İğnenin kas enjekte önlemek için cilt altında serbestçe hareket edin.
   5. Eşit ve yavaş yavaş şırınga içeriğini boşaltınız. Aşağı iğne konik tarafı çekiniz.
2. İntratümöral enjeksiyonlar
   1. Yakalama birhayvan (bölüm 4) uyutmak d.
   2. Bir pamuklu çubukla kullanarak% 70 etanol ile enjeksiyon bölgesini temizleyin ve ilerlemeden önce tamamen buharlaşmasına izin verin.
   3. Dik bir pozisyonda iğne tutarken yavaşça ve sürekli yukarı çizerek virüs inokulum ile yük şırıngalar (29 G 0.3 ml, '1/2 x). Kabarcıklar bazı kuvvet ile şırınga belirgin fiske iseniz. Kabarcıklar üst basarak kez sıvı iğne üstünde olduğu kadar, sonra Pistonun.
   4. Tümör içine iğne konik tarafı yukarı yerleştirin ve kısmen tümörün laserasyonunu önlemek için her hareketinden önce iğneyi çekilmesi, fan gibi desen iğne hareket ederken eşit ve yavaş yavaş şırınga içeriğini sınırdışı. Aşağı iğne konik tarafı çekiniz.
      NOT: Subkutan fazla tercih tümörler hızlı büyüyen 5-7 gün içinde yaklaşık 100 mm ³ ulaşan vardır. Ayrıca, nekrotik ve hemorajik merkezleri genellikle birkaç gün içinde tümörün yüzeyinde oluşan ve ca gerektirirreful izleme (Şekil 4).
3. Periton içi enjeksiyonlar
   1. Yakalama ve hayvan (bölüm 4) uyutmak.
   2. Pamuklu çubuklarla kullanarak% 70 etanol ile enjeksiyon bölgesini temizleyin ve ilerlemeden önce tamamen buharlaşmasına izin verin.
   3. Yavaş yavaş ve sürekli yukarıya çizerek ilaç ile yük şırıngalar (29 G 0.3 ml, '1/2 x). Kabarcıklar bazı kuvvet ile şırınga belirgin fiske iseniz. Kabarcıklar üst basarak kez sıvı iğne üstünde olduğu kadar, sonra Pistonun.
   4. Karın sağ alt kadranda içine iğne takın. Kan ya da dışkı aspire değil emin olmak için tekrar pistonu çekin, bu iğnenin yanlış yerleştirme gösterir. Bu durum ortaya çıkarsa, iğneyi çıkartın ve yeni bir şırınga hazırlayın. İğne doğru yerleştirildiğinde, eşit ve yavaş yavaş şırınga içeriğini sınırdışı.

7. Tümör eksizyonu ve Nekropsi

1. Toplayın ve al temizlemek% 70 etanol önce hayvanın ötenazi için birlikte l araçları.
2. İstediğiniz yöntemle hayvan Euthanize, CO ₂ inhalasyon (5-10 dakika / dak 2 L) tavsiye edilir. Vücut durumda herhangi bir anormallik için hayvan inceleyin.
3. Bir diseksiyon gemide sırt yatma hayvan koyun ve% 70 etanol ile hayvan temizleyin.
4. Alt karın cildi kaldırmak için cımbız kullanın. Makas kullanılarak deri ve kas yoluyla kesin ve hayvan uzunluğunu (çene anüs) çalıştıran bir medial kesi yapmak.
5. İki kesim, yanal göğüs kafesi tarafı yukarı bir ve kalp ve akciğerler maruz sternum üzerinden bir yaparak göğüs kafesi kesin. Herhangi bir metastaz ^27,29 akciğerin lobları inceleyin.
6. Anormallikler için tüm organlarını incelemek ve renk, boyut ve tutarlılık içinde herhangi bir değişiklik kayıt. Gerekirse, iç dokuları incelemek için bir neşter ile organları insizyon. Özellikle, karaciğer, böbrekler, dalak ve mide yolu incelemek.
7. Metastaz için lenf düğümleri kontrol edin ve ^27,29 genişleme.
8. Tümör toplamak için, cenah kesiler üstünde ve cilt cımbız ile vücuttan uzak çekilebilir şekilde tümör altında olun. Sıkıca cımbız ile cilt tutarken, dikkatli tümör ve dermis (Şekil 5) arasındaki keserek tümörü çıkarmak için bir neşter kullanabilirsiniz.
9. Hemen% 10 nötr tamponlu formalin etiketli bir kap içinde tümör yerleştirin.
10. Tümörün büyüklüğüne bağlı olarak, 1-2 gün izin (≤ 2 mm, küçük) ya da 5-6 gün histolojik analiz (Şekil 6) bölümler hazırlamadan önce sabitlemek için (> 2 mm geniş).

Sonuçlar

Nedeniyle pamuk sıçanların son derece heyecanlı doğası, aşina olmak ve bir klinik öncesi hayvan modeli olarak kullanımı kolaylaştıracak hayvanların stresi azaltmak için optimize prosedürler kullanılarak için. Uygun kullanım tekniklerinin kullanımı da araştırmacı riskini en aza indirecektir.

Pamuk fareleri kullanırken sakin kalmak zorunludur. sıçanlar son derece heyecanlı ve onların kafesini kaçmaya çalışacaktır. Bir zenginleştirme tüpü ve kaçış girişim...

Tartışmalar

Cotton rats are highly excitable and have a strong flight response. Therefore, special care should be taken to minimize any undue stress on the animal. The cage setup described will allow for safe and easy capture of the animals, with the placement of the enrichment tube being of the utmost importance. When setting up cages, ensure that the enrichment tubes meet the size and shape requirements, and are placed in proper orientation in the cage. It is also important to ensure that any technicians who might be aiding in ani...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Gibco	11965-092	May use any brand
1X Phosphate Buffered Saline			Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine	Gibco	25030164	May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	May use any brand
Fetal bovine serum	Quality Biological Inc.	110-001-101HI	May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask	Fisher Scientific	14-826-80	May use any brand
1X TypLE Express	Life Technologies	12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom	Fisher Scientific	08-772-29	May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue	Life Technologies	DAL1025	May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet	Harlan	8640
1/8” corncob rodent bedding	Harlan	7092
Nestlets	Ancare	-	Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22	May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	M60302
70% Ethanol			Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	May use any brand
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood)	NAPCO	Model used not currently available	May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath	Fisher Scientific	Model used not currently available	May use any brand
[header]
Reichert Bright-line Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer	GE Healthcare Life Sciences	Model used not currently available	May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader	Tecan	Model used not currently available	May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge	Beckman Coulter	366816	May use any brand
Table Top Anaesthesia machine	VetEquip	Model used not currently available	May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers	Wahl		May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL	BD	329464	May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin.
Cotton swabs	MedPro	018-425	May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	8940	May use any brand
Dissecting Tissue Forceps	Fisher Scientific	13-812-41	May use any brand