Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

Özet

Yeşil floresan proteini füzyon göre, Escherichia coli içinde rekombinant zar proteinlerinin ifadesi için tarama için bir aerodinamik bir yaklaşım sunulmuştur.

Özet

yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için yeniden birleştirici zar proteinlerinin üretimi nedeniyle düşük seviyeli dışavurumu ve bir kez deterjanlar içinde çözünür bir çok zar proteinlerinin tabiatında bulunan kararsızlık için teknik açıdan zor olmaya devam etmektedir. Bir protokol GFP floresan tespit Escherichia coli ekspresyon GFP füzyonları olarak zar proteinlerinin bağlama bağımsız klonlama birleştiren tarif edilmektedir. Bu çoklu membran proteini inşaat ve ifade tarama / zaman ve çaba daha fazla yatırım için uygun adayları tespit varyantları sağlar. GFP raportör SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), aşağıdaki GFP floresan görselleştirerek ifade primer elemede kullanılır. Serbest GFP yokluğu ile gösterildiği gibi en az bozulma ile yüksek bir ifade seviyesi ortaya koymuştur Zar proteinleri, ikinci bir ekran için seçilir. Bu yapılar ölçekli ve toplam zar fraksiyonu hazırlanır ve çözünür vardırDört farklı deterjan d. Deterjan çözünmeyen malzemenin ayrılması için ultrasantrifüj sonra lizatlar floresans saptama boyut ayrımı kromatografisiyle (FSEC) ile analiz edilmiştir. GFP floresan boyut dışlama profili İzleme farklı deterjanlarda membran proteinlerinin mono-dispersiteleri ve bütünlüğü hakkında bilgi sağlar. Protein ya da çok az serbest GFP ve minimum agregasyonu ile simetrik bir zirve ile elüte deterjan kombinasyonu daha sonra saflaştırma için adaydırlar. Yukarıdaki metodoloji, E. heterolog ifade kullanma SED (şekil, uzama, bölünme ve sporülasyon) bakteri 47 farklı tür proteinlerin coli analiz edildi. Bu proteinler genellikle on transmembran ve hücre bölünmesi için gereklidir. Sonuçlar, E. coli 'de SED'leri ortologlara üretimi coli GFP füzyon proteinlerinin ifade seviyelerine saygı ve dürüstlük son derece değişken. Deney Idaha fazla araştırma için bir alt dentified.

Giriş

Bu zar proteinleri, insan genomu ² dahil olmak üzere tüm dizilenmiştir genomları ^1, kodlanmış genlerinin yaklaşık% 20-30 sorumlu olduğu tahmin edilmektedir. Ilaç hedefleri metabolitler, enerji üretimi, örneğin ulaşım ve birçok biyolojik süreçlerde kritik rolü göz önüne alındığında, onların üç boyutlu yapısını belirlemek yoğun ilgi var. Bununla birlikte, çözünür proteinler ile karşılaştırıldığında, zar proteinlerinin yüksek derecede yeterince temsil Protein Veri Bankası içindedir. Aslında, PDB (de 99.624 serbest yapıların http://www.rcsb.org/pdb/ ) Sadece 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) zar proteinleri olarak sınıflandırılır. Bu da doğal olarak, nispeten düşük seviyelerde ifade edilmiştir zar proteinleri ile çalışan teknik zorluklar yansıtmaktadır; rodopsin, birkaç istisna dışında ^3,4 biridir. Rekombinant sürümü Aşırı ifadesiheterolog hücrelerde ler genellikle üretim genel düzeyini sınırlayan zara hatalı katlanması ve yoksul hedefleme sonuçlanır. Bir kez eksprese eden bir membran proteinin ekstraksiyonu ve çözündürme için en iyi deterjan seçilmesi daha sonraki saflaştırma zorlaştırır ve dikkatli bir optimizasyon gerektirir.

Escherichia coli% 72 (muhasebe zar proteinleri için en yaygın olarak kullanılan ekspresyon konak kalır http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ bakteriyel kaynaklardan neredeyse sadece güncel çözülmüş yapılar). Belirli E. E. coli suşu C41 (DE3) ve C43 (DE3), zar proteinlerinin aşırı ifadesine neden olur ve bu nedenle, diğer BL21 için gözlenen toksiklik ^5,6 suşları etkilerini önlemek etmeyen izole edilmiştir. Rekombinant zar proteini ekspresyonu seviyesini ayarlama üretimi ^6,7 kalitesini optimize etmek için kritik olduğu görülmektedir.

yapı tayini için membran proteinlerinin başarılı üretim, amino-ve karboksi-ucu silme, doğal sekans varyasyonu ve farklı füzyon proteinleri ^6-8 yararlanmak için birden ortologlara de dahil olmak üzere birden çok alternatifler değerlendirilmesini gerektirmiştir. Bu nedenle, paralel bir çok zar proteinlerinin sentezlenmesi taranması için bir yöntem gereklidir. Bir yaygın kullanılan yaklaşım protein arındırmak gerek kalmadan izlenebilir yeşil floresan protein (GFP) sağlayan ifadeye protein kaynaştırmak için. Bu şekilde, farklı deterjanlarda ekspresyon düzeyi, kararlılık ve davranış hakkında bilgiler un saf malzeme ^9-12 küçük miktarları ile değerlendirilebilir.

Bu yazıda E. membran proteinlerinin klonlanması ve ifade taraması için bir aerodinamik protokol açıklar coli, üretim ve deterjan sonraki karakterizasyonu bir muhabir olarak GFP için füzyon kullanarak: Protein complexes (Şekil 1).

Protokol

İfade Vektörler 1. İnşaatı

1. Kullanım PCR İnfüzyon dizileri ¹³ sırasıyla ayrılabilen C-terminali ya da N-terminali GFP His6 füzyonlarının ya eklemek vektörleri pOPINE-3C-GFP ve POPIN-N-GFP ile paralel olarak 96 ekspresyon plazmidleri kadar oluşturmak için klonlama.
   Not: GFP sitozol içinde ifade edilmesi gerekir çünkü vektörün seçilmesi, bir sitosolik, N-terminal ve hücre dışı C-terminal biz POPIN-N-GFP ve için kullanmak bir proteini, proteinin topolojisi ile belirlenir hücre dışı N-terminali hem de sitosolik C-terminali biz pOPINE-3C-GFP kullanmak. Her iki Termini sitozolik nerede C-ucunu etiketlemek için değil fonksiyonel sebep olmadıkça biz pOPINE-3C-GFP kullanmak istiyorum.
2. Gösterilen aşağıdaki uzantıları içeren primerler ile zar proteinleri kodlayan DNA dizilerini çoğaltmak:
   pOPINE-3C-GFP (İleri primer - AGGAGATATACCATG; astar Ters - CAGAACTTCCAGTTT) ve POPIN-N-GFP (İleri primer - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; - ATGGTCTAGAAAGCTTTA) astar Ters.
3. Agaroz jel elektroforezi ile, PCR reaksiyonu analiz edin. Bir kez temiz PCR ürünleri elde edilmiştir, (1x DpnI reaksiyon tamponu, 5 ul içinde telafi) her 5 u DpnI ekleyin. 96 oyuklu bir formatta manyetik boncuklar kullanılarak PCR ürünleri saflaştırılır.
   Not: DpnI şablon uzaklaştırmak üzere eklenir; Genomik DNA, şablon olarak kullanıldığında, bu adım gerekli değildir.
4. PCR, plakanın her oyuğuna uygun doğrusallaştırılmış vektörün 1 ul (100 ng) ekleyin.
5. Saflaştırılmış PCR ul bir çok kanallı pipet eklenti x kullanılarak PCR plakanın uygun kuyulara takın. Tüm ürünler 10-250 ng aralığında olduğundan emin olun.
6. Çukuruna su (9-x) ul ekleyin ve kuru aşağı-füzyon reaktifi ihtiva eden bir tübe tam 10 ul transfer. 30 saniye bekletin.
7. Yukarı ve aşağı pipetleme kısaca içeriğini karıştırın. Transferözgün PCR plaka ve conta tepkiler.
8. Bir PCR 42 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.
9. Hemen TE 40 ul reaksiyon tamamlanana kadar kısa bir süre buz tepkileri transferi ve ekleme (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA).
10. Kerede Freeze veya yetkili hücrelere dönüşümü. Dönüşüm için, yüksek yeterlilik 50 ul alikotundan (> 5 x 10 ⁹ transformant / mikrogram) yetkili E. başına seyreltilmiş reaksiyon 3 ul kullanın E. coli hücreleri.
11. LB agar 1 ml 50 ug / ml karbenisilin oyuk başına bir 24 oyuklu doku kültürü plakası ile takviye ekle (klonlanması için, yapıları 2 x sayıda kuyu hazırlama).
12. Çıkıntı levhanın ardından büyümesinin sonra: 25 ul, 24 oyuklu doku kültürü plakaları içeren agar üzerine bir kültür 1 5 seyreltme 25 ul.
13. Hafifçe eğerek plaka hücreleri yayılır.
14. 37 ° C'de ya da bir flo 10-15 dakika için kapaklı plaka Kuruoda sıcaklığında w başlık.
15. Kapağı değiştirin ve baş aşağı çevirin ve plaka gece boyunca 37 ° C kuluçkaya yatmaktadır.
16. İki koloni ve mini-hazırlık vektörleri seçin.
17. PCR yapı belirli ters astar ve bir vektör özgü ileri primer (örn pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG) kullanarak yapıları doğrulayın.

E. 2. Dönüşüm coli E XPression suşlar

Not: Bundan önce protokolü, E. gerçekleştirmeden E. coli yetkin hücreleri yapılan bölündü ve daha önce tarif edildiği ^{gibi, 13} -80 ° C'de donmuş olarak saklanır. Membran protein ifadesi rutin iki suşları taranır, Lemo21 (DE3) ve C41 (DE3) pLysS. Sonuçların yorumlanması yardımcı olmak için bu gibi bir pozitif kontrol, bir plasmid GFP veya eksprese etmesi için bilinen bir GFP ile kaynaşmış bir zar proteini ve boş vektör negatif kontrol dahil etmek yararlı olabilir.

1. Ali çözülmequotted E. buz üzerinde coli. Seçkin hücrelerin ve her seferinde mini prepped ifade plazmidi 3 ul ekle.
2. 30 dakika boyunca buz üzerinde karışımı inkübe edin.
3. 42 ° C'de 30 saniye için hücrelerin ısı şoku.
4. Hücreler 2 dakika boyunca buz üzerinde geri ve sonra da her tüpe güç suyu 300 ul ilave izin verin.
5. 37 ° C kuluçka makinesi içinde, statik, 1 saat süreyle inkübe edin.
6. 50 ug / ml karbenisilin ve 35 ug / ml kloramfenikol ile takviye edilmiş, 24 oyuklu doku kültürü plakası, LB Agar hazırlayın. Lemo21 (DE3) ihtiva eden oyuklara 0.25 mM'lik bir son konsantrasyona kadar ramnoz ekleyin.
   Not: ürün, C41 ihtiva eden kuyular toksik olma olasılığı ise (DE3) pLysS,% 1 (ağ / hac) glikoz ile takviye edilebilir.
7. Aktarım LB agar plakaları üzerine dönüşüm karışımı elde edilen hücreler, 30 ul. Yayılma ve 1,13-1,15 açıklandığı gibi plaka kurulayın.

Gece Starter Kültürlerin 3. Hazırlık

Not: Her zaman eski bir dönüşüm plakasından asla dönüşüm sonra gecede Kültürlerin gün hazırlar.

1. 50 ug / ml karbenisilin ve 35 ug / ml kloramfenikol ile takviye edilmiş 96 oyuklu bir derin oyuklu plakanın her bir oyuğuna 0.7 mi güç suyu ekleyin. 0.25 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar Lemo21 (DE3) ihtiva eden oyuklara ramnoz ekleyin. İsteğe bağlı olarak,% 1 (ağ / hac) glikoz C41 (DE3) pLysS ek; Yukarıda (2.6 not) bkz.
2. Her kuyuya gecede dönüşüm plakaları bir koloni seçin. Bir gaz geçirgen conta ile blok Seal.
3. Gece boyunca 37 ° C 'de, küçük bir atış (örneğin 4.3 mm'lik bir yörünge) ile bir inkübatör içerisinde büyük bir atış (örneğin, 25 mm kalınlığında bir yörünge) veya 600 rpm'de bir kuluçka makinesi içinde 250 rpm'de blok çalkalayın.

4. Büyüme ve Kültürlerin İndüksiyon

1. Güç suyu 3 mi her 50 ug / ml karbenisilin ve 35 ug / ml kloramfenikol ağırlık ile takviye ekle24 gözlü derin gözlü plaka ell. Bölüm 3.1'de tarif edildiği gibi, L-ramnoz (ve glikoz) ekleyin. Iki kez alımına olanak sağlamak kültür 3 ml kullanın ve gaz geçirgen conta içinden suyun bir kısmı buharlaştırma hareketliliği sağlar.
2. 24 gözlü derin gözlü bloklara her oyuğuna Lemo21 (DE3) ya da C41 (DE3) pLysS, gece boyunca kültürler 150 ul ekleyerek sentezleme kültürleri ayarlayın.
3. 595 nm'de ortalama OD kadar 37 ° C 'de bloklar çalkalayın ~ plakası içinden 0.5.
4. 1.0 mM IPTG bir nihai konsantrasyona kadar kültürler IPTG eklenerek ifadesini teşvik eder.
5. 20 ° C de çalkalanarak kültürler, gece boyunca (18-20 saat) büyütün.

In-jel Floresan tarafından İfade 5. Analizi

1. Nüsha Hasat. Kare de, konik bir dip 96-iyice derin oyuklu bloğu her bir kuyudan kültür devri 1 mi.
   Not: Hasat iki kez blok veya kırılması durumunda alternatif akım test sağlamak içinİsterseniz deterjan ettik.
2. Blok kapatın ve 10 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüj ile hücreler hasat edilir.
3. Blok ters çevirin ve medya süzün. Kalan ortamı boşaltmak için kağıt havlu üzerine hafifçe blok dokunun.
4. 20 dakika içinde en az -80 ° C'de plakalar ve mağaza kapatın. İsteğe bağlı olarak, bu noktada deney ve ne zaman uygun işlenmiş blok bırakın.
5. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca pelet de-don.
6. Liziz tamponu (50 mM NaH ₂ PO _4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol,% 1 h, 200 ul tam hücreler tekrar süspansiyon, 4 ° C'de, bir çok-kanallı bir pipet veya bir orbital çalkalayıcı (10 dakika süre ile 1000 rpm) ya kullanın / hac Tween 20), NaOH kullanılarak 8.0 pH ayarlanır.
7. (2 ml su içinde nihai hacimde 20 ul DNase (4.000 birim / ml), 20 mg lizozim ve 20 | il proteaz inhibitör kokteyli) 20 DLPI çözeltisi ul ekleyin. 4 ° C 'de (~ 1000 rpm) çalkalama ile 10 dakika süreyle inkübe edin.
8. % 10 N -Dodecyl β-D-maltoside (DDİ) 25 ul ekle.
9. 4 ° C 'de (~ 1000 rpm), sallama ile 60 dakika boyunca inkübe edin.
10. Santrifüj 4 ° C'de 30 dakika boyunca 6000 x g'de kuyulu bloğu.
11. Bir mikro-titre plakasına temizlenir lizat 10 ul transferi ve SDS-PAGE jel yükleme tamponu (100 mM Tris, pH 6.8, ağ% 4, 10 ul / hac SDS,% 0.2 w Bromofenol mavisi,% 10 h / h β hac / mersaptoetanol ve% 20 hac / hac gliserol). DİKKAT NUMUNE kaynatın ETMEYİN.
12. Yük aşama 5.11'den örnek 10 ul / gözenek SDS-PAGE jel (ler) üzerine ve boya cephesinin, dip (2-2.5 saat) ulaşana kadar soğuk bir odada 100-120 V (sabit voltaj) çalışır.
13. (GFP füzyon proteinleri tespit etmek için mavi ışık filtresi ile örneğin) bir görüntüleyici üzerine jel yerleştirin. pozlama süresi parlak bantlar doymuş değil emin olmak için seçilir.

Hücre Kültürleri 6. Ölçek-up

1. Yetkili bir kısım Dönüşümü E. E. coli gibi, bölüm 2'de tarif edildiği.
2. (Bölüm 3 açıklandığı gibi takviye) güç suyu 10 ml bir koloni almak ve 37 ° C'de gece boyunca büyür.
3. 500 mi güç suyu içine gece boyunca kültür 5 ml seyreltin.
4. 595 nm 'de OD kadar 37 ° C'de 250 rpm'de çalkalanarak büyütün ~ 0.5.
5. 1.0 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar IPTG ilave edilerek ifadesini teşvik eder.
6. 20 ° C'de, 250 rpm ile çalkalanarak bir gece boyunca büyütün.
7. Santrifüj Hasat hücreler 15 dakika boyunca 5.000 xg'de.
8. Sil süpernatant. Hücre topakları -80 ° C'de saklanabilir.

Membranların 7. Hazırlık

1. Hücre topağı gramı başına 5 ml'lik bir hacimde 1x PBS pH 7.5 içinde, oda sıcaklığında ve tekrar süspansiyon ile çözülme hücreleri (eğer gerekli ise); Viskozite akıntısı kıvama düşene kadar gerekli ses düzeyini artırın. 10 ug / ml ve bir nihai konsantrasyon 1 mM, DNAz I nihai konsantrasyona _MgCI2 eklemeHücre topağı gramı başına 20 proteaz inhibitörü tablet ambalajlı. 30 Kpsi'de bir basınçta soğutulmuş bir hücre bozma kullanılarak açık hücre kırın.
2. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 30,000 g'de bozulmamış hücreler ve artık taneleri. Ultra-santrifüj tüpüne süpernatant aktarın.
3. 4 ° C'de 1 saat boyunca 200,000 x g hızında ultra santrifüj supernatant aşağı iplik toplam membran fraksiyonu toplamak.
4. Süpernatantı atın.
5. Hücre homojenleştirici kullanılarak buz gibi soğuk 10 mi, PBS pH 7.5 içinde membran topağı yeniden askıya. Membranlar yeniden süspansiyon haline getirildi, 1 ml her bir deterjan için gereklidir. İsteğe bağlı olarak, bu aşamada flaş -80 ° C'de, sıvı azotun ve deposunda membran süspansiyonu dondurma.

Membran Fraksiyon 8. Çözündürme ve Analizi

1. Çözülme membran fraksiyonu (gerekirse), ve her bir deterjan için çözündürme için kullanılmak üzere, bir 1.5 ml zar süspansiyonu alikotu 900 ul poliallomer mikro Santrifüjge tüp.
2. Belirtilen bir 1.5 ml'lik tübe% 1 bir son konsantrasyona kadar her bir yeni hazırlanmış bir deterjan 100 ul (% 10 w / DDM, DM h solüsyonlar, şimal-6 ve LDAO) ekleyin. Ökaryotik membran proteinleri, kolesterol hemisüksinat (% 0.2 son konsantrasyon) çözünürleştirme için deterjanlara ilave edilebilir.
3. Hafif çalkalanarak 1 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin karışımları.
4. 45 dakika boyunca 4 ° C'de 150,000 g, temin boruları, en az yarı dolu, bir tezgah üstü, ultra-santrifüj ile deterjan çözünmeyen payın taneleri hem süpematan saklayın.
   Not: Deterjan çözünme etkinliği ayni hacimde PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş deterjan çözünmez kısma sahip çözündürülmüş membran GFP floresan ölçümü ile bir flüoresan plaka okuyucusu kullanılarak tahmin edilebilir.
5. Farklı bir deterjana mono-dağıtma özelliği analiz: Membran protein kompleksleri floresans tespit boyut dışlama kromatografisi kullanılarak (FSEC).
6. FSEC analizi için, / dakika 0.3 ml'lik bir akış hızında tamponu (20 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCI,% 0.03 DDM) çalışan, molekül ağırlığı 5,000,000 geniş bir fraksiyonlara ayırma aralığı bir ebat eksklüzyon kolonu, örneğin 5000 dengeye . Tüm numuneler için bu tampon kullanın, bu test her deterjan için değiştirilmez yani.
7. / Dakika 0.3 ml'lik bir akış oranında sütun üzerine çözündürülmüş membran 100 ul enjekte edilir. Floresan optik (488 nm'de uyarma ve emisyon 512 nm) ile elüsyon profilini izler. Bir satır içi floresan monitör mevcut değilse, fraksiyonlarım toplamak ve bir plaka okuyucusunda floresans okuyun.
8. Grafiksel gösterim için bir elektronik tablo programı içine İthalat elüsyon hacmi ve floresan yoğunluğu verileri.
9. Bölüm 5'de tarif edildiği gibi in-jel floresan ile çözündürülmüş membran malzemesi kalan analiz eder.

Sonuçlar

Proteinlerin (şekil, uzama, bölünme ve sporülasyon) olarak SEDS ailesi bakteriyel hücre bölünmesi için gereklidir. Bu tamamlayıcı proteinler tipik olarak hücre içinde hem de amino ve karboksi sonlarını on transmembran etki vardır. Yukarıda tarif edilen protokol örneklemek amacıyla, 47 SED'leri ortologlara vektör pOPINE-3C-EGFP klonlanmıştır. Konstruktlarının bir küçük ölçekli ekspresyon ekranı iki D .coli suşları gerçekleştirildiği, 0.25 mM mevcudiyetinde büyütülen Lemo21 (DE3) rutin membran ekspresyonu için kullanılan sızan ifade ve C41 (DE3) pLysS, bloke etme ramnoz proteinler ^5-8.

İndüklenmiş kültürlerin deterjan çözünebilir lisatları, SDS-poliakrilamid elektroforez ile analiz edilmiştir. -Jel floresan kullanılarak ifade GFP füzyon proteinleri 47 SED'ler yapıları üzerinden iki suşları arasında 38 üretilmiş olduğunu gösterdi görselleştirmek için. İlginçtir iki ifade suşları arasındaki farklar vardı. 38 yapıları ifade edilen, sadece 18, her iki soy, yalnızca C41 (DE3) pLysS içinde Lemo21 (DE3) 'e ve 6'da ifade edilen, 14 üretildi. Genel olarak, C41 (DE3) pLysS (24 vs 38) ile karşılaştırıldığında Lemo21 (DE3) için daha yüksek bir başarı oranı oldu. Ancak, bazı proteinler, soy spesifik olduğu ortaya çıktı gözlem hem de tarama yararlı olduğu anlamına gelir.

47 SED'ler ve 24 için temsili veri yapıları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bantların yoğunluğu, ancak her iki soy iyi ilave olarak ifade edilir, örneğin Şekil 1A ve 1 B' de de C4 füzyon proteini ekspresyon seviyesinin bir göstergesini verir, düşük molekül ağırlıklı bant, protein olarak kısmen indirgenen olduğunu göstermektedir. Birçok şerit tek başına GFP boyutundaki gelen bir grup var. Protein bütünlüğünün kalite değerlendirmesi serbest GFP füzyon proteini nisbetle yoğunluğu bakarak gerçekleştirilebilir;Örneğin G4 ve H4 tamamen bazı Sağlam protein (Şekil 1A) bulunmaktadır Lemo21 (DE3'ün) oysa C41 (DE3) pLysS (Şekil 1B) ücretsiz GFP aşağı kırılmış. 38 olarak ifade edilen proteinleri üzerinden 14 için serbest GFP bandının yoğunluğu (serbest GFP bir bandın şiddeti, füzyon proteini ve füzyon proteinlerinin bir kısmında daha büyük olan 21 için, 3 füzyon proteininin benzerdir / 38) ifade örneğin F6 ve Şekil 1A G6 füzyon proteinine kıyasla nispeten az serbest GFP var.

Ve G6 (küçük ücretsiz GFP) ifade edildi ve 500 ml hücre kültüründen hazırlanan toplam membran fraksiyonunun (ücretsiz GFP ve füzyon proteinleri için yüksek yoğunluklu bantları) birincil ekran B5 iyi ifade yapıları iki. Tekrar süspansiyon haline getirilen zarlar kısma bölünmüştür ve floresan ile saptanan boyut ayrımı kromatografisiyle (FSEC) ile analiz edilmiştir. FSEC profilleri Figür sunulmuşture 2A ve 2B sırasıyla iki SED'ler proteinler test dört deterjanlarda farklı davrandığını göstermektedir. Bir durumda (Şekil 2A: Örnek B5) proteini sadece bu nedenle daha sonraki saflaştırma için tercih edilen bir deterjan olacaktır DDM az agregasyonu ile simetrik bir tepe verdi. Aksine diğer füzyon proteini tarafından (Şekil 2B: Örnek G6) test edilen tüm deterjanlarda benzer bir profil verdi.

Şekil 1: E. membran proteini ifade taranması için iş akışı şeması coli GFP muhabiri kullanarak.

Şekil 2:-jel floresan kullanılarak zar proteini ifade birincil ekranı. E.> Deterjan lizatları E. coli, SDS-PAGE ile analiz edildi hücreleri ve jeller Mavi Epi aydınlatma ve 530/28 filtre kullanılarak görüntülenmiştir. Sonuçlar (96 oyuklu bir plaka içerisinde pozisyonlarına göre A4 H6 etiketli) 24 yapıları için gösterilmiştir. serbest GFP ve GFP füzyon proteinleri için bantlarının pozisyonları gösterilir. Lemo21 (DE3). (B), C41 (DE3) pLysS ifade Proteinlerin ifade (A), proteinler.

Şekil 3:. Zar proteini ifade ikincil ekran Floresan tespit boyut dışlama kromatografisi (FSEC) kullanılarak toplam membran fraksiyonları dört farklı deterjanlarda ekstre edilmiş ve çözündürülmüş membran proteinleri bir floresan detektörüne bağlanmış bir FPLC sistemi kullanılarak boyut dışlama kromatografisi ile analiz edilmiştir. Için FSEC profiller (A), membran proteini B5 ve (B) zar proteini G6. birleştirilmiş protein, çözündürülmüş, GFP füzyon proteini ve serbest GFP'ye karşı gelen bir zirve konumu belirtilmiştir. Test deterjanlar profilleri aşağıda belirtilmiştir.

Tartışmalar

Bu makalede anlatılan protokolde, bir GFP raportör vektörü içine ligasyon bağımsız klonlama hızla E. birden fazla zar proteinlerinin nispi ifade taranması için floresan ile birleştirilir coli. Vektörler birincil ifade tarama bir hafta daha alarak dört iş günü içinde yapılabilir. Gelen jel bütün hücrelerin deterjan lizatlarının floresan ifadesi ikinci bir ekranda daha fazla analiz için tatmin edecek sıralamak için kullanılmaktadır. olduğu gibi primer sentezleme ekran dışında derin gözlü bloklara hücrelerin çoğaltılması için uygun olan bir sallanan kuluçka makinesi herhangi bir uzman ekipman gerektirmez. 96 oyuklu plakalar, SBS içeren tüm diğer sıvı taşıma çok kanallı pipet kullanılarak gerçekleştirilebilir. Protokol maddeler, farklı sentezleme koşulları (örneğin, daha düşük sıcaklık) altında yetiştirilir başka E. coli türleri içerecek şekilde modifiye edilebilir. Ramnoz seviyesini titre LEMO21 (DE3) durumunda (0 2.0 mM)Bazı membran proteinleri ⁷ ekspresyon seviyesini arttırabilir transkripsiyon hızını modüle etmek için ilave edildi. Sert deterjanlar, enklüzyon gövdelerinden elde proteinlerin çözündürülmesi ve bu yüzden yanlış pozitif vermesine rağmen DDM başka deterjanlar primer elemede çıkarılması için kullanılabilir. Açıkçası, daha ilk ekran haline ayrıntılı, daha zaman alıcı bir deney.

İkincil ekran birincil ekranda tanımlanan ifade hit gelen toplam membran fraksiyonu hazırlanması içerir. Bu E. zara füzyon proteinlerinin lokalizasyonu doğrular olarak da önemli bir adımdır E. coli hücreleri. Değişik deterjanlar GFP füzyon proteininin sonraki ekstraksiyon deterjan-protein kompleksleri mono- dağıtma özelliği değerlendirmek için çözündürülmüş malzeme floresans tespit boyut dışlama kromatografi ile izlenir. Ne için en uygun deterjan tanımlar çünkü bu başka bir kritik adımsonraki sonraki işlemlerde membran proteini çözünürleşme. Bununla birlikte, deneyim deterjan (lar) ın seçimi daha fazla optimizasyon hala saflaştırma ve kristalleşme sırasında gerekli olabileceğini göstermektedir. Nispeten küçük bir misel boyutu (örneğin, LDAO) ile olanlar dahil olmak üzere çeşitli deterjanlar içinde homojen davranış kanıtlar en az prokaryotik membran proteinleri ¹⁴ kristaller kırılma de oluşturulması için bir eğilimi iyi bir göstergesi olduğu görülmektedir. Bu bağlamda, Şekil 2B'de zar proteini için gösterilen profil son derece elverişli görünmektedir.

GFP muhabiri kullanmanın ana avantajı un-saflaştırılmış örneklerde ifade hızlı okuma-out vermesidir. Bir dezavantajı, GFP füzyon proteini kristalizasyon için proteinin saflaştırılması sırasında kaldırılacak olmasıdır. Burada kullanılan vektörler durumunda, bir rinovirüs 3C proteaz bölgesi GFP bölünmesini sağlar. Seçenek olarak ise, bu basittirancak daha sonra saflaştırma için bir polihistidine veya başka bir afinite etiketi eklemek vektörlerine olarak belirlenen aday proteinleri,-klon yeniden. Bu GFP füzyon ekspresyonu için gerekli olduğunu varsayar. zar proteini ekspresyonu ve çözündürme tespiti için GFP füzyonu kullanılarak ana alternatif sadece bir histidin etiketi eklemektir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, tipik olarak çok sayıda varyant değerlendirilmesi için çok zaman alan bir hale olan bir membran fraksiyonunun ¹⁵ ile başlayan gerektirir.

Özet olarak, bu makalede tarif edilen protokol ana amacı, membran proteini dizisinin büyük bir sayısı hızla ifade ve deterjan çözünme açısından değerlendirildi ve daha derin bir analiz için öncelik varyantlarının sağlamaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
pOPIN-N-GFP	addgene (www.addgene.org)
pOPINE-3C-GFP	addgene (www.addgene.org)
C41(DE3)pLysS	Lucigen (http://lucigen.com/)	60444-1
LEMO21(DE3)	New England Biolabs	C2528H
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns	Clontech/Takara	639688
Power broth	Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/)	MD12-106-1
Protease Inhibitor tablets	Roche	11697498001
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836170001
L-Rhamnose monohydrate	Sigma-Aldrich	83650
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8849
DNAse 1	Sigma-Aldrich	DN25
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L7651
Cholesterol hemisuccinate	Sigma-Aldrich	C6512
CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside)	Anatrace	C326
DDM (n-Dodecyl β-maltoside)	Generon	D97002
DM (n-Decyl β-maltoside)	Generon	D99003
LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide)	Generon	D71111
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl	Thermo Scientific	4672030
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer	Anachem	LA6-300XLS
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS	Anachem	L8-20XLSPLUS
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip	Anachem	L8-1200XLS
24 well V bottom deep well blocks	Porvair sciences	360115
BenchMark Fluorescent Protein Standard	Life Technologies	LC5928
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well	Life Technologies	WG1203BOX
XCell4 SureLock Midi-Cell	Life Technologies	WR0100
Vibramax 100	Heidolph	544-21200-00
Tension rollers attachment	Heidolph	549-81000-00
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor	Beckman Coulter	393253
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor	Beckman Coulter	393315
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors	Beckman Coulter	B14535
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector	Shimadzu
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column	GE Healthcare	17-5172-01
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm	Shel Lab	SSI5R-HS
Innova44R incubator	New Brunswick /Eppendorf	Innova44R
TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi)	Constant systems	PL083016
L-Rhamnose monohydrate	Sigma	83650