Method Article
Yeşil floresan proteini füzyon göre, Escherichia coli içinde rekombinant zar proteinlerinin ifadesi için tarama için bir aerodinamik bir yaklaşım sunulmuştur.
yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için yeniden birleştirici zar proteinlerinin üretimi nedeniyle düşük seviyeli dışavurumu ve bir kez deterjanlar içinde çözünür bir çok zar proteinlerinin tabiatında bulunan kararsızlık için teknik açıdan zor olmaya devam etmektedir. Bir protokol GFP floresan tespit Escherichia coli ekspresyon GFP füzyonları olarak zar proteinlerinin bağlama bağımsız klonlama birleştiren tarif edilmektedir. Bu çoklu membran proteini inşaat ve ifade tarama / zaman ve çaba daha fazla yatırım için uygun adayları tespit varyantları sağlar. GFP raportör SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), aşağıdaki GFP floresan görselleştirerek ifade primer elemede kullanılır. Serbest GFP yokluğu ile gösterildiği gibi en az bozulma ile yüksek bir ifade seviyesi ortaya koymuştur Zar proteinleri, ikinci bir ekran için seçilir. Bu yapılar ölçekli ve toplam zar fraksiyonu hazırlanır ve çözünür vardırDört farklı deterjan d. Deterjan çözünmeyen malzemenin ayrılması için ultrasantrifüj sonra lizatlar floresans saptama boyut ayrımı kromatografisiyle (FSEC) ile analiz edilmiştir. GFP floresan boyut dışlama profili İzleme farklı deterjanlarda membran proteinlerinin mono-dispersiteleri ve bütünlüğü hakkında bilgi sağlar. Protein ya da çok az serbest GFP ve minimum agregasyonu ile simetrik bir zirve ile elüte deterjan kombinasyonu daha sonra saflaştırma için adaydırlar. Yukarıdaki metodoloji, E. heterolog ifade kullanma SED (şekil, uzama, bölünme ve sporülasyon) bakteri 47 farklı tür proteinlerin coli analiz edildi. Bu proteinler genellikle on transmembran ve hücre bölünmesi için gereklidir. Sonuçlar, E. coli 'de SED'leri ortologlara üretimi coli GFP füzyon proteinlerinin ifade seviyelerine saygı ve dürüstlük son derece değişken. Deney Idaha fazla araştırma için bir alt dentified.
Bu zar proteinleri, insan genomu 2 dahil olmak üzere tüm dizilenmiştir genomları 1, kodlanmış genlerinin yaklaşık% 20-30 sorumlu olduğu tahmin edilmektedir. Ilaç hedefleri metabolitler, enerji üretimi, örneğin ulaşım ve birçok biyolojik süreçlerde kritik rolü göz önüne alındığında, onların üç boyutlu yapısını belirlemek yoğun ilgi var. Bununla birlikte, çözünür proteinler ile karşılaştırıldığında, zar proteinlerinin yüksek derecede yeterince temsil Protein Veri Bankası içindedir. Aslında, PDB (de 99.624 serbest yapıların http://www.rcsb.org/pdb/ ) Sadece 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) zar proteinleri olarak sınıflandırılır. Bu da doğal olarak, nispeten düşük seviyelerde ifade edilmiştir zar proteinleri ile çalışan teknik zorluklar yansıtmaktadır; rodopsin, birkaç istisna dışında 3,4 biridir. Rekombinant sürümü Aşırı ifadesiheterolog hücrelerde ler genellikle üretim genel düzeyini sınırlayan zara hatalı katlanması ve yoksul hedefleme sonuçlanır. Bir kez eksprese eden bir membran proteinin ekstraksiyonu ve çözündürme için en iyi deterjan seçilmesi daha sonraki saflaştırma zorlaştırır ve dikkatli bir optimizasyon gerektirir.
Escherichia coli% 72 (muhasebe zar proteinleri için en yaygın olarak kullanılan ekspresyon konak kalır http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ bakteriyel kaynaklardan neredeyse sadece güncel çözülmüş yapılar). Belirli E. E. coli suşu C41 (DE3) ve C43 (DE3), zar proteinlerinin aşırı ifadesine neden olur ve bu nedenle, diğer BL21 için gözlenen toksiklik 5,6 suşları etkilerini önlemek etmeyen izole edilmiştir. Rekombinant zar proteini ekspresyonu seviyesini ayarlama üretimi 6,7 kalitesini optimize etmek için kritik olduğu görülmektedir.
yapı tayini için membran proteinlerinin başarılı üretim, amino-ve karboksi-ucu silme, doğal sekans varyasyonu ve farklı füzyon proteinleri 6-8 yararlanmak için birden ortologlara de dahil olmak üzere birden çok alternatifler değerlendirilmesini gerektirmiştir. Bu nedenle, paralel bir çok zar proteinlerinin sentezlenmesi taranması için bir yöntem gereklidir. Bir yaygın kullanılan yaklaşım protein arındırmak gerek kalmadan izlenebilir yeşil floresan protein (GFP) sağlayan ifadeye protein kaynaştırmak için. Bu şekilde, farklı deterjanlarda ekspresyon düzeyi, kararlılık ve davranış hakkında bilgiler un saf malzeme 9-12 küçük miktarları ile değerlendirilebilir.
Bu yazıda E. membran proteinlerinin klonlanması ve ifade taraması için bir aerodinamik protokol açıklar coli, üretim ve deterjan sonraki karakterizasyonu bir muhabir olarak GFP için füzyon kullanarak: Protein complexes (Şekil 1).
İfade Vektörler 1. İnşaatı
E. 2. Dönüşüm coli E XPression suşlar
Not: Bundan önce protokolü, E. gerçekleştirmeden E. coli yetkin hücreleri yapılan bölündü ve daha önce tarif edildiği gibi, 13 -80 ° C'de donmuş olarak saklanır. Membran protein ifadesi rutin iki suşları taranır, Lemo21 (DE3) ve C41 (DE3) pLysS. Sonuçların yorumlanması yardımcı olmak için bu gibi bir pozitif kontrol, bir plasmid GFP veya eksprese etmesi için bilinen bir GFP ile kaynaşmış bir zar proteini ve boş vektör negatif kontrol dahil etmek yararlı olabilir.
Gece Starter Kültürlerin 3. Hazırlık
Not: Her zaman eski bir dönüşüm plakasından asla dönüşüm sonra gecede Kültürlerin gün hazırlar.
4. Büyüme ve Kültürlerin İndüksiyon
In-jel Floresan tarafından İfade 5. Analizi
Hücre Kültürleri 6. Ölçek-up
Membranların 7. Hazırlık
Membran Fraksiyon 8. Çözündürme ve Analizi
Proteinlerin (şekil, uzama, bölünme ve sporülasyon) olarak SEDS ailesi bakteriyel hücre bölünmesi için gereklidir. Bu tamamlayıcı proteinler tipik olarak hücre içinde hem de amino ve karboksi sonlarını on transmembran etki vardır. Yukarıda tarif edilen protokol örneklemek amacıyla, 47 SED'leri ortologlara vektör pOPINE-3C-EGFP klonlanmıştır. Konstruktlarının bir küçük ölçekli ekspresyon ekranı iki D .coli suşları gerçekleştirildiği, 0.25 mM mevcudiyetinde büyütülen Lemo21 (DE3) rutin membran ekspresyonu için kullanılan sızan ifade ve C41 (DE3) pLysS, bloke etme ramnoz proteinler 5-8.
İndüklenmiş kültürlerin deterjan çözünebilir lisatları, SDS-poliakrilamid elektroforez ile analiz edilmiştir. -Jel floresan kullanılarak ifade GFP füzyon proteinleri 47 SED'ler yapıları üzerinden iki suşları arasında 38 üretilmiş olduğunu gösterdi görselleştirmek için. İlginçtir iki ifade suşları arasındaki farklar vardı. 38 yapıları ifade edilen, sadece 18, her iki soy, yalnızca C41 (DE3) pLysS içinde Lemo21 (DE3) 'e ve 6'da ifade edilen, 14 üretildi. Genel olarak, C41 (DE3) pLysS (24 vs 38) ile karşılaştırıldığında Lemo21 (DE3) için daha yüksek bir başarı oranı oldu. Ancak, bazı proteinler, soy spesifik olduğu ortaya çıktı gözlem hem de tarama yararlı olduğu anlamına gelir.
47 SED'ler ve 24 için temsili veri yapıları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bantların yoğunluğu, ancak her iki soy iyi ilave olarak ifade edilir, örneğin Şekil 1A ve 1 B' de de C4 füzyon proteini ekspresyon seviyesinin bir göstergesini verir, düşük molekül ağırlıklı bant, protein olarak kısmen indirgenen olduğunu göstermektedir. Birçok şerit tek başına GFP boyutundaki gelen bir grup var. Protein bütünlüğünün kalite değerlendirmesi serbest GFP füzyon proteini nisbetle yoğunluğu bakarak gerçekleştirilebilir;Örneğin G4 ve H4 tamamen bazı Sağlam protein (Şekil 1A) bulunmaktadır Lemo21 (DE3'ün) oysa C41 (DE3) pLysS (Şekil 1B) ücretsiz GFP aşağı kırılmış. 38 olarak ifade edilen proteinleri üzerinden 14 için serbest GFP bandının yoğunluğu (serbest GFP bir bandın şiddeti, füzyon proteini ve füzyon proteinlerinin bir kısmında daha büyük olan 21 için, 3 füzyon proteininin benzerdir / 38) ifade örneğin F6 ve Şekil 1A G6 füzyon proteinine kıyasla nispeten az serbest GFP var.
Ve G6 (küçük ücretsiz GFP) ifade edildi ve 500 ml hücre kültüründen hazırlanan toplam membran fraksiyonunun (ücretsiz GFP ve füzyon proteinleri için yüksek yoğunluklu bantları) birincil ekran B5 iyi ifade yapıları iki. Tekrar süspansiyon haline getirilen zarlar kısma bölünmüştür ve floresan ile saptanan boyut ayrımı kromatografisiyle (FSEC) ile analiz edilmiştir. FSEC profilleri Figür sunulmuşture 2A ve 2B sırasıyla iki SED'ler proteinler test dört deterjanlarda farklı davrandığını göstermektedir. Bir durumda (Şekil 2A: Örnek B5) proteini sadece bu nedenle daha sonraki saflaştırma için tercih edilen bir deterjan olacaktır DDM az agregasyonu ile simetrik bir tepe verdi. Aksine diğer füzyon proteini tarafından (Şekil 2B: Örnek G6) test edilen tüm deterjanlarda benzer bir profil verdi.
Şekil 1: E. membran proteini ifade taranması için iş akışı şeması coli GFP muhabiri kullanarak.
Şekil 2:-jel floresan kullanılarak zar proteini ifade birincil ekranı. E.> Deterjan lizatları E. coli, SDS-PAGE ile analiz edildi hücreleri ve jeller Mavi Epi aydınlatma ve 530/28 filtre kullanılarak görüntülenmiştir. Sonuçlar (96 oyuklu bir plaka içerisinde pozisyonlarına göre A4 H6 etiketli) 24 yapıları için gösterilmiştir. serbest GFP ve GFP füzyon proteinleri için bantlarının pozisyonları gösterilir. Lemo21 (DE3). (B), C41 (DE3) pLysS ifade Proteinlerin ifade (A), proteinler.
Şekil 3:. Zar proteini ifade ikincil ekran Floresan tespit boyut dışlama kromatografisi (FSEC) kullanılarak toplam membran fraksiyonları dört farklı deterjanlarda ekstre edilmiş ve çözündürülmüş membran proteinleri bir floresan detektörüne bağlanmış bir FPLC sistemi kullanılarak boyut dışlama kromatografisi ile analiz edilmiştir. Için FSEC profiller (A), membran proteini B5 ve (B) zar proteini G6. birleştirilmiş protein, çözündürülmüş, GFP füzyon proteini ve serbest GFP'ye karşı gelen bir zirve konumu belirtilmiştir. Test deterjanlar profilleri aşağıda belirtilmiştir.
Bu makalede anlatılan protokolde, bir GFP raportör vektörü içine ligasyon bağımsız klonlama hızla E. birden fazla zar proteinlerinin nispi ifade taranması için floresan ile birleştirilir coli. Vektörler birincil ifade tarama bir hafta daha alarak dört iş günü içinde yapılabilir. Gelen jel bütün hücrelerin deterjan lizatlarının floresan ifadesi ikinci bir ekranda daha fazla analiz için tatmin edecek sıralamak için kullanılmaktadır. olduğu gibi primer sentezleme ekran dışında derin gözlü bloklara hücrelerin çoğaltılması için uygun olan bir sallanan kuluçka makinesi herhangi bir uzman ekipman gerektirmez. 96 oyuklu plakalar, SBS içeren tüm diğer sıvı taşıma çok kanallı pipet kullanılarak gerçekleştirilebilir. Protokol maddeler, farklı sentezleme koşulları (örneğin, daha düşük sıcaklık) altında yetiştirilir başka E. coli türleri içerecek şekilde modifiye edilebilir. Ramnoz seviyesini titre LEMO21 (DE3) durumunda (0 2.0 mM)Bazı membran proteinleri 7 ekspresyon seviyesini arttırabilir transkripsiyon hızını modüle etmek için ilave edildi. Sert deterjanlar, enklüzyon gövdelerinden elde proteinlerin çözündürülmesi ve bu yüzden yanlış pozitif vermesine rağmen DDM başka deterjanlar primer elemede çıkarılması için kullanılabilir. Açıkçası, daha ilk ekran haline ayrıntılı, daha zaman alıcı bir deney.
İkincil ekran birincil ekranda tanımlanan ifade hit gelen toplam membran fraksiyonu hazırlanması içerir. Bu E. zara füzyon proteinlerinin lokalizasyonu doğrular olarak da önemli bir adımdır E. coli hücreleri. Değişik deterjanlar GFP füzyon proteininin sonraki ekstraksiyon deterjan-protein kompleksleri mono- dağıtma özelliği değerlendirmek için çözündürülmüş malzeme floresans tespit boyut dışlama kromatografi ile izlenir. Ne için en uygun deterjan tanımlar çünkü bu başka bir kritik adımsonraki sonraki işlemlerde membran proteini çözünürleşme. Bununla birlikte, deneyim deterjan (lar) ın seçimi daha fazla optimizasyon hala saflaştırma ve kristalleşme sırasında gerekli olabileceğini göstermektedir. Nispeten küçük bir misel boyutu (örneğin, LDAO) ile olanlar dahil olmak üzere çeşitli deterjanlar içinde homojen davranış kanıtlar en az prokaryotik membran proteinleri 14 kristaller kırılma de oluşturulması için bir eğilimi iyi bir göstergesi olduğu görülmektedir. Bu bağlamda, Şekil 2B'de zar proteini için gösterilen profil son derece elverişli görünmektedir.
GFP muhabiri kullanmanın ana avantajı un-saflaştırılmış örneklerde ifade hızlı okuma-out vermesidir. Bir dezavantajı, GFP füzyon proteini kristalizasyon için proteinin saflaştırılması sırasında kaldırılacak olmasıdır. Burada kullanılan vektörler durumunda, bir rinovirüs 3C proteaz bölgesi GFP bölünmesini sağlar. Seçenek olarak ise, bu basittirancak daha sonra saflaştırma için bir polihistidine veya başka bir afinite etiketi eklemek vektörlerine olarak belirlenen aday proteinleri,-klon yeniden. Bu GFP füzyon ekspresyonu için gerekli olduğunu varsayar. zar proteini ekspresyonu ve çözündürme tespiti için GFP füzyonu kullanılarak ana alternatif sadece bir histidin etiketi eklemektir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, tipik olarak çok sayıda varyant değerlendirilmesi için çok zaman alan bir hale olan bir membran fraksiyonunun 15 ile başlayan gerektirir.
Özet olarak, bu makalede tarif edilen protokol ana amacı, membran proteini dizisinin büyük bir sayısı hızla ifade ve deterjan çözünme açısından değerlendirildi ve daha derin bir analiz için öncelik varyantlarının sağlamaktır.
The authors have nothing to disclose.
The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | ||
pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | ||
C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/) | 60444-1 | |
LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H | |
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 | |
Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 | |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 | |
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 | |
CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 | |
DDM (n-Dodecyl β-maltoside) | Generon | D97002 | |
DM (n-Decyl β-maltoside) | Generon | D99003 | |
LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 | |
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl | Thermo Scientific | 4672030 | |
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS | |
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS | |
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS | |
24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 | |
BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 | |
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX | |
XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 | |
Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 | |
Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 | |
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 | |
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 | |
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 | |
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | ||
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm | Shel Lab | SSI5R-HS | |
Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R | |
TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi) | Constant systems | PL083016 | |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır