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緑色蛍光タンパク質の融合に基づく大腸菌における組換え膜タンパク質の発現についてスクリーニングする効率的なアプローチが提示される。
構造的および機能的研究のための組換え膜タンパク質の生産が低レベルの発現一度洗浄剤中で可溶化し、多くの膜タンパク質の固有の不安定性のために技術的に困難なままである。プロトコルは、GFP蛍光によって検出された大腸菌で発現GFP融合体などの膜タンパク質のライゲーション非依存性クローニングを組み合わせることが記載されている。これは、時間と労力のさらなる投資に適した候補を同定するために、複数の膜タンパク質/バリアントの構築および発現のスクリーニングを可能にする。 GFPレポーターは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)は、次のGFP蛍光を可視化することにより式の一次スクリーニングに使用される。自由GFPの不在によって示されるように、最小の劣化で高い発現レベルの両方を示す膜タンパク質は、二次スクリーニングのために選択される。これらの構築物は、スケーリングされ、総膜画分を調製し、可溶化されている4異なる界面活性剤の研究開発。界面活性剤不溶性の物質を除去するために超遠心分離に続いて、溶解物を、蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー(FSEC)によって分析される。 GFP蛍光によってサイズ排除プロフィールを監視することは別の洗剤中の膜タンパク質の単分散性と完全性についての情報を提供します。タンパク質:ほとんど、あるいはまったく自由GFPと最小集約対称のピークで溶出洗剤の組み合わせは、その後の精製のための候補である。上記の方法論を用いて、E。で異種発現SED(形状、伸長、除算、および胞子)菌の47の異なる種からのタンパク質の大腸菌を分析した。これらのタンパク質は、典型的には10の膜貫通ドメインを有し、細胞分裂に必須である。結果は、EにSEDのオルソログの生産大腸菌は、発現レベルおよびGFP融合タンパク質の完全性に関して非常に可変であった。実験Iさらなる調査のためのサブセットをdentified。
これは、膜タンパク質は、ヒトゲノム2を含むすべての配列決定されたゲノム1で符号化された遺伝子の約20~30%を占めると推定されている。多くの生物学的プロセスにおけるその重要な役割を考慮すると、代謝産物、エネルギー生成および薬物標的としての、例えば輸送のために、それらの三次元構造の決定に強い関心がある。しかし、可溶性タンパク質と比較して、膜タンパク質は、タンパク質データバンクで表さアンダー高度である。実際には、PDB(で99624リリース構造からhttp://www.rcsb.org/pdb/ )のみ471( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ )膜タンパク質に分類される。これは、自然に、比較的低レベルで発現される膜タンパク質での作業の技術的な問題を反映しロドプシンは、いくつかの例外を除き3,4の一つです。組換えバージョンの過剰発現異種細胞中のSは、多くの場合、生産の全体的なレベルを制限し、膜にミスフォールディングと貧しいターゲティングになる。一旦発現膜タンパク質の抽出および可溶化のための最高の洗剤を選択すると、その後の精製が困難になると慎重な最適化を必要とする。
大腸菌は、72%(占め膜タンパク質のための最も一般的に使用される発現宿主ままhttp://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/細菌源からほぼ排他的であり、今日まで解 析された構造の)。具体的なE.大腸菌株C41(DE3)およびC43(DE3)は、膜タンパク質の過剰発現をもたらし、したがって、他のBL21のために観察された毒性は5,6株の影響を回避しない単離されている。組換え膜タンパク質の発現のレベルを調整すると、生産6,7のレベルを最適化するために重要であると思われる。
多くの場合、構造決定のための膜タンパク質の正常な産生は、天然の配列変異と異なる融合タンパク質6-8を利用するためにアミノ末端およびカルボキシ末端欠失、複数のオーソログを含む、複数のバージョンの評価を必要としてきた。したがって、並列に複数の膜タンパク質の発現をスクリーニングするための方法が不可欠である。 1つの一般的に使用されるアプローチは、タンパク質を精製することなく、追跡される緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を可能にするタンパク質を融合することである。このように、異なる洗剤中の発現レベル、安定性、および動作に関する情報は、未精製物質9-12少量で評価することができる。
この記事では、Eにおける膜タンパク質のクローニングおよび発現スクリーニングのための合理化されたプロトコルを記述洗剤の生産とその後の特性化のレポーターとしてGFPとの融合を使用して大腸菌 :タンパク質COMPlexes( 図1)。
発現ベクターの1の構築
E. 2.変容大腸菌のE XPRESSION株
注:前にこのプロトコルを実行するには、E。大腸菌コンピテント細胞を作製等分し、以前に記載13のように-80℃で凍結保存される。膜タンパク質の発現は、日常的に二つの株、Lemo21(DE3)およびC41(DE3)pLysS中でスクリーニングされる。結果の解釈を支援するためには、陽性対照、 例えば 、GFPを発現するプラスミドまたは発現することが知られているGFPに融合した膜タンパク質と空のベクターネガティブコントロールを含むように役立ちます。
一晩スターター培養物の調製
注:常に古い形質転換プレートから変換後に一日一晩培養を決して準備していない。
4.成長と文化の誘導
ゲル内蛍光によって発現の5.分析
細胞培養の6スケールアップ
膜の7。準備
膜画分の8溶化および分析
タンパク質のSEDSファミリー(形状、伸び、部門、および胞子形成)は、細菌の細胞分裂に不可欠である。これらの一体型のタンパク質は通常、細胞内のアミノ末端およびカルボキシ末端の両方を持つ10の膜貫通領域を持っている。上述のプロトコールを例示するために、47 SEDのオルソログは、ベクターpOPINE-3C-eGFPの中にクローニングした。構築物の小規模発現画面は2つのE .coli株で実施した、0.25ミリモルの存在下で増殖させLemo21(DE3)は、日常的に、膜の発現のために使用されるリーキーな発現およびC41(DE3)pLysS株を、ブロックするラムノースタンパク質5-8。
誘導培養の洗剤可溶化した溶解物をSDSポリアクリルアミド電気泳動により分析した。ゲル内蛍光を使用することで発現GFP融合タンパク質は、47 SEDの構築物のうちの2株の間38が生成されることが示された可視化する。興味深いことに2発現株との間に差はなかった。 38構築物を発現し、わずか18は14だけLemo21(DE3)および6のみC41で(DE3)pLysS中で発現し、両系統を作製した。の全体的に、C41(DE3)pLysS株(24対38)に比べLemo21(DE3)のためのより高い成功率があった。しかし、いくつかのタンパク質は、株特異的であるように思われた観察は、両方のスクリーニングで有用であることを意味する。
47のSEDの24のための代表的なデータは、構築物は、図1に示されている。バンドの強度は、しかし、両方の株でよく、追加の表現、例えば 、図1A及び図1BのウェルC4における融合タンパク質の発現のレベルの指標を与える低分子量のバンドは、タンパク質が部分的に分解されることを示唆している。多くのレーンにGFP単独のサイズに対応するバンドが存在する。タンパク質の完全性の定性的評価は、自由GFPの融合タンパク質の相対的強度を調べることによって行うことができる。Lemo21(DE3)にいくつかの完全なタンパク質( 図1A)があるのに対し、 例えば G4およびH4は完全にC41でのフリーGFP(DE3)pLysSを( 図1B)に分解される。 38発現されたタンパク質のうち14の空きGFPバンドの強度は、(遊離GFPバンドの強度は、融合タンパク質および融合タンパク質の少数のそれよりも大きい21のために、3融合タンパク質と同様である/ 38は、 図1Aに) 例えば F6及びG6を発現した融合タンパク質と比較して比較的少ない自由GFPを有する。
一次スクリーニングのB5(遊離GFP融合タンパク質のための高強度バンド)及びG6(少し自由GFP)で十分に発現構築物のうちの2つが発現し、総膜画分を500mlの細胞培養物から調製した。再懸濁した膜は、アリコートに分割し、蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー(FSEC)により分析した。 FSECプロファイルはFIGURに提示されているE 2Aおよび2Bそれぞれと2 SEDのタンパク質が試験した4つの洗剤に異なる挙動を示すことを示している。 1ケース( 図2A:サンプルB5)において、タンパク質は、したがって、その後の精製の ための選択の洗剤だろうDDMに少し凝集対称ピークを与えた。対照的に、他の融合タンパク質( 図2B:サンプルG6)は、試験した全ての界面活性剤で同様のプロフィールを示した。
図1:E.、膜タンパク質の発現をスクリーニングするためのワークフローの図GFPレポーターを使用して大腸菌 。
図2:ゲル内蛍光を用いた膜タンパク質の発現の主画面。 Eの>洗剤溶解物大腸菌細胞はブルー落射照明と28分の530フィルターを使用して画像化SDS-PAGEおよびゲルで分析した。結果は、(96ウェルプレート内の位置に基づいて、A4-H6ラベル)24の構築物について示されている。自由GFPおよびGFP融合タンパク質のためのバンドの位置が示されている。Lemo21(DE3)(B)C41(DE3)pLysS中で発現されたタンパク質で発現(A)タンパク質である。
図3:膜タンパク質の発現の二次スクリーン蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー(FSEC)を使用して、合計の膜画分は、4つの異なる界面活性剤で抽出し、可溶化した膜タンパク質は、蛍光検出器に結合されたFPLCシステムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。 (A)膜タンパク質B5および(B)はFSECプロファイル膜タンパク質G6。凝集したタンパク質、可溶化されたGFP融合タンパク質および遊離GFPに対応するピークの位置が示されている。テスト洗剤は、プロファイルの下に示されている。
この資料に記載されたプロトコルでは、GFPレポーターベクターにライゲーション非依存性クローニングが急速E.で複数の膜タンパク質の相対発現をスクリーニングする蛍光検出と組み合わされ大腸菌 。ベクターは、第一の発現スクリーニングは、さらに週取ると4営業日で行うことができます。全細胞の洗浄剤溶解物のゲル内蛍光は、二次スクリーニングにおいて、さらなる分析のための発現ヒットをランク付けするために使用される。提示される一次式スクリーンが離れてディープウェルブロックで細胞を成長させるのに適しシェーカーインキュベーターからの専門家装置を必要としない。 96ウェルSBSプレートを含む他の全ての液体の取り扱いは、マルチチャンネルピペットを用いて行うことができる。プロトコルは容易に異なる発現条件( 例えばより低い温度)の下で成長させ、他の大腸菌株を含むように修飾することができる。ラムノースのレベルを滴定LEMO21(DE3)の場合には(0から2.0 mMまで)いくつかの膜タンパク質7の発現レベルを増加させることができる転写速度を調節するために添加した。過酷な洗剤は、封入体からタンパク質を可溶化し、従って偽陽性を与えるかもしれないがDDM以外の界面活性剤は、一次スクリーニングで抽出のために使用することができる。明らかに、より多くの初期画面になる手の込んだ、より多くの時間のかかる実験を。
二次スクリーニングは、一次スクリーニングで同定された表現のヒットから全膜画分を調製することを含む。これは、Eの膜への融合タンパク質の局在を確認するように重要なステップであるcoli細胞 。異なる洗剤中のGFP融合タンパク質のその後の抽出は、界面活性剤 - タンパク質複合体の単分散性を評価するために、可溶化物質の蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィーによって監視される。それが最も適切な洗剤を識別するので、これはもう一つの重要なステップである後続の下流の処理のための膜タンパク質の可溶化。しかしながら、経験は、界面活性剤(単数または複数)の選択のさらなる最適化がまだ精製および結晶化の間に必要とされ得ることを示している。比較的小さなミセルのサイズ( 例えば LDAO)を持つものを含む、様々な界面活性剤が均一動作の証拠は、原核生物の膜タンパク質14、少なくともよく回折する結晶を形成する傾向の良好な指標であると思われる。この点において、 図2Bの膜タンパク質について示されたプロファイルは非常に良好な表示。
GFPレポーターを使用することの主な利点は、未精製の試料における発現の迅速な読み出しを与えることである。欠点は、GFP融合タンパク質は、結晶化のためのタンパク質の精製中に除去しなければならないことである。ここで使用されるベクターの場合には、ライノウイルス3Cプロテアーゼ部位はGFPの切断を可能にする。あるいは、それは簡単である唯一のその後の精製のためにポリヒスチジンまたは他の親和性タグを追加するベクターへのスクリーニングで同定された再クローン候補タンパク質は、である。これは、GFPの融合が発現に必要ではないことを前提としています。膜タンパク質の発現および可溶化を検出するためのGFPへの融合を使用する主な代替案は、ヒスチジンタグを付加することである。しかし、このアプローチは、典型的には、多くの変形を評価するために非常に時間がかかるとなる膜画分15で始まる必要とする。
要約すると、この資料に記載されたプロトコルの主な目的は、膜タンパク質配列の多数の急速な発現および界面活性剤可溶化の点で評価され、より深い分析のために優先される変異を可能にすることである。
The authors have nothing to disclose.
The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | ||
pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | ||
C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/) | 60444-1 | |
LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H | |
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 | |
Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 | |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 | |
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 | |
CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 | |
DDM (n-Dodecyl β-maltoside) | Generon | D97002 | |
DM (n-Decyl β-maltoside) | Generon | D99003 | |
LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 | |
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl | Thermo Scientific | 4672030 | |
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS | |
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS | |
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS | |
24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 | |
BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 | |
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX | |
XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 | |
Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 | |
Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 | |
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 | |
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 | |
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 | |
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | ||
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm | Shel Lab | SSI5R-HS | |
Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R | |
TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi) | Constant systems | PL083016 | |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |
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