JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Pek çok farklı yöntem akış sitometrik (FCM) ile hücre dışı veziküller (EVS) ölçülmesi için vardır. Kullanmak için en uygun yöntemi belirlerken çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Ölçüm EVs için iki protokoller bireysel algılama veya boncuk esaslı yaklaşım kullanılarak sunulmuştur.

Özet

Hücre dışı veziküller (EVS) hücre-hücre iletişimine yüksek ilgili olan ve biyolojik süreçler çok çeşitli düzenlemeye yardımcı vücut sıvılarında bulunan küçük, zar-türevi veziküllerdir. Akış sitometrik (FCM) ile AGH analizi nedeniyle küçük boyutu ve ilgi belirteçleri için pozitif ayrık nüfus eksikliği bildiği zor olmuştur. Oldukça son on yılda geliştirilmiş EV analiz yöntemleri, hala devam eden bir çalışma vardır. Ne yazık ki, orada hiç kimse-boyut-uyan tüm protokol ve kullanmak için en uygun yöntemi belirlerken çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Birkaç farklı işleme AGH için teknikler ve bireysel algılama veya boncuk-tabanlı bir yaklaşım kullanarak AGH analiz için iki protokol burada sundu. rasyonel f yaygın ticari preparatlarda bulunan antikor agregatları bertaraf yardımcı olacaktır Burada tarif edilen yöntemler, artan bir sinyal-gürültü oranı ve ayar kapılarıeşiğe tespitini en aza indirir ashion. İkinci protokol yakalamak ve küçük AGH ve eksozomlar tespit etmek için bir boncuk tabanlı bir yaklaşım kullanır iken ilk protokol, klinik örneklerin yüksek hacimli analiz etmek için özellikle uygundur bireysel algılama yöntemi kullanır.

Giriş

Hücre dışı veziküller (EVS) hücre-hücre iletişimine yüksek ilgili olan ve biyolojik süreçler çok çeşitli düzenlemeye yardımcı vücut sıvılarında bulunan küçük, zar-türevi veziküllerdir. Akış sitometrik (FCM) ile AGH analizi nedeniyle küçük boyutu ve ilgi belirteçleri için pozitif ayrık nüfus eksikliği bildiği zor olmuştur. Oldukça son on yılda geliştirilmiş EV analiz yöntemleri, hala devam eden bir çalışma vardır. Ne yazık ki, orada hiç kimse-boyut-uyan tüm protokol ve kullanmak için en uygun yöntemi belirlerken çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Birkaç farklı işleme AGH için teknikler ve bireysel algılama veya boncuk-tabanlı bir yaklaşım kullanarak AGH analiz için iki protokol burada sundu. rasyonel f yaygın ticari preparatlarda bulunan antikor agregatları bertaraf yardımcı olacaktır Burada tarif edilen yöntemler, artan bir sinyal-gürültü oranı ve ayar kapılarıeşiğe tespitini en aza indirir ashion. İkinci protokol yakalamak ve küçük AGH ve eksozomlar tespit etmek için bir boncuk tabanlı bir yaklaşım kullanır iken ilk protokol, klinik örneklerin yüksek hacimli analiz etmek için özellikle uygundur bireysel algılama yöntemi kullanır.

Ayrıca mikro şekilde bilinmektedir EVs, hücre-hücre iletişimine katılan ve biyolojik süreçler 1 çok çeşitli düzenlemeye yardımcı olan vücut sıvılarında bulunan küçük, zar-türevi veziküllerdir. 4 - Çeşitli yüzey belirteçleri ve / veya biyolojik maddenin doğrudan aktarımı ifadesi sayesinde, AGH aktive veya hücreler arası iletişimin 2 rol bastırmak ya oynamak için alıcı hücrelerin fonksiyonunu değiştirmek edebiliyoruz. Diğer tümör Metasta teşvik gelen, geniş bir şartlar aralığında katkıda gösterilmiştir ve Klinik, trombosit türevli EVs kuvvetli pıhtılaşmaya karşı etkinliğe 5 sahip olduğu bilinmektedirHastalığın 7 karşı korumaya sis 6. AGH boyutu ve kuşak 8 mekanizmaya bağlı olarak, bu tür bir eksozom ve microvesicles (MVs) gibi hücre-türevi veziküllerin küçük kategoriye ayrılabilir. MVs 100 1,000 kadar büyük ise hücre kökenli kese alt popülasyonlarının isimlendirme devam eden tartışmanın 8,9 bir konu olmaya devam ediyor, ancak, eksozomlar genellikle, küçük plazma zarı ile endosome füzyon elde edilen 40 ila 100 nm parçacıklar açıklanmıştır nm partiküller, plazma zarının 10 dökülme ile temsil edilmektedir. Burada, genel terim "EV bize" hücreleri tarafından salınan hücre dışı biyolojik veziküllerinin her türlü ifade etmek için kullanılacaktır.

Bütün kandan EV'lerin izolasyonu çok aşamalı bir işlemdir ve bir çok farklı işlem değişkenlerinin, depolama sıcaklığı ve süresi 11,12, antikoagülan / koruyucu 13 kullanılır ve de dahil olmak üzere, EV içeriği etkilediği gösterilmiştirsantrifüj yöntemi 14 kullanılır. Bu değişkenlerin standardizasyonu için bir ihtiyaç Tromboz ve Hemostaz Bilimsel ve uygun Standardizasyon Komitesi (ISTH SSC), kan işleme ve EV izolasyon prosedürleri 15,16 Uluslararası Derneği tarafından önerilerine yol açtı, ancak optimum protokolü araştırmacılar arasında fikir birliği hiçbir vardır etti 12 kullanmak için. En sıkı kontrollü ön-analitik değişkenler doğru ve tekrarlanabilir veriler için çok önemli olduğunu, ancak, kabul ediyorum.

AGH analiz etmek için, araştırmacılar 20,21 ve 22,23 lekeleme batı saçılma transmisyon elektron mikroskobu 17, taramalı elektron mikroskobu 18,19, atomik kuvvet mikroskobu, dinamik ışık da dahil olmak üzere, çeşitli yöntemler kullanmışlardır. FCM birçok araştırmacı 9,24 için seçim yöntemi iken - nedeniyle yüksek verim yetenekleri 26, FCM kullanarak EVs analizi olmuştur32 - nedeniyle boyutu ve ayrık olumlu nüfus 27 eksikliği oldukça zordur. Hücrelerin analizi ile karşılaştırıldığında, gerekli parçacık başına antijenlerin az sayıda nedeniyle yayılan 1) daha az floresans AGH sonuçların küçük boyutu ve post-leke yıkama 2) sınırlı fizibilite, arka plan floresan azaltmak için. Araştırmacılar arasında ortak zorluklar immunglobulin agrega 27,28 ve antikorların 29 kendini toplama kaynaklanan sinyalleri içerir. Ayrıca, uzun işlem süreleri ve mevcut protokollerin 33,34 birçok kişi tarafından kullanılan uzun yıkama / izolasyon prosedürleri onlara yüksek hacimli uygulamalar için idealdir daha az hale numunelerin az sayıda analiz etmek çok günlük zaman taahhütlerini gerektirir. Bazı araştırmacılar doğru bac değerlendirmek için böyle bir floresan eksi bir (FMO) ve izotiplerle yararsız olarak geleneksel olarak kullanılan FCM negatif kontroller render, tamamen bir yıkama adımı bırakmakkground floresan 30.

Antikor agrega ve diğer non-kesecikler, bağlanmamış antikor giderilmesinde zorluk ve farkedilebilir olumlu nüfus eksikliğinden kaynaklanan sinyaller: Bizim protokolleri AGH uygun FCM analizi engelleyebilir üç ortak sorunları çözmek. Burada tarif edilen teknikler, genel olarak ticari preparatlarda bulunan antikor toplulukları ortadan sinyal-gürültü oranını artırmak ve eşiğe tespitini en aza indirir rasyonel bir şekilde kapı ayarlama yardımcı olacaktır. İki farklı algılama yöntemleri burada sunulmuştur: İkinci protokol yakalamak ve küçük AGH ve eksozomlar tespit etmek için bir boncuk-tabanlı bir yaklaşım kullanır iken ilk protokol, klinik örneklerin yüksek hacimli analiz etmek için özellikle uygundur bireysel algılama yöntemi kullanır.

Protokol

Not: Aşağıdaki protokoller, insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallara uygun olarak yapılmıştır. Bütün insan konu örnekleri kurumsal inceleme kurulu (KİK) -onaylı protokol kapsamında ve konuların bilgilendirilmiş rızası ile test edildi.

1. YÖNTEM A: Bireysel Algılama Yöntemi

AGH Kan Örneği / İzolasyon 1.1) İşleme

  1. Aşağıdaki 2 adımlı diferansiyel santrifüj protokolü kullanılarak ACD-Solüsyon A ya da diğer halinde, uygun bir antikoagülan ve proses (30 dakika içinde max), 1.5 ml ihtiva eden iki adet 10 ml'lik cam tüplere verici / hastadan alınan kan alımı.
    NOT: Bu protokol, çekilen kan Birleştirilen ~ 17 ml den yaklaşık 10 ml trombosit bakımından yoksul plazma (PPP), bir yol açacaktır. Daha fazla veya daha az, PPP gerekirse, toplanan kan tüplerin sayısı uygun şekilde ayarlanabilir.
  2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj örnekleribuffy coat ve kırmızı hücrelerin plazma ayırmak için. Buffy coat ve kırmızı hücreleri içeren alt katmanları rahatsız etmemek için dikkatli olmak, 1.5 ml santrifüj tüplerine plazma süpernatant 1.2 ml hacimde aktarın.
  3. Trombosit ve büyük hücre parçalarını almak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 13,000 x g'de dönerler. Dikkatle pelet bozulmasını önleyen ve yeni bir tüpe PPP eklemek için 200 ul geride bırakarak PPP aktarın.
  4. Bu noktada, daha sonra analiz için iki yıla kadar (bir genel bakış için 1A bakınız Şekil) -80 ° C de analiz veya yeni bir 1.5 ml'lik santrifüj tüplerine 1.0 mi alikotlar içinde transfer ve mağaza hemen PPP kullanın.
  5. Saflaştınldı AGH bir ultra santrifüj tüpüne fonksiyonel deneylerde, transferi PPP 6 mi için gerekli ve 0.2 um filtreden fosfat tamponlu tuzlu su içinde 28 ml (PBS) ekleyin ise. Bir sallanan kepçeli rotor ile donatılmış bir ultrasantrifüj kullanarak, oda sıcaklığında 100,000 x g'de 60 dakika süre ile spin. Aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon EV pel1.5 ml medyada bildirin.
    NOT: En yüksek tekrarlanabilirlik için, kan örnekleri vericiden itibaren sürekli sürede işleme alınmalıdır. EV izolasyon yönteminin herhangi bir varyasyon ölçüde tespit AGH sayısını ve türünü etkileyebilir.

1.2) Analiz için Örnekleri Hazırlama

NOT: Bu noktadan itibaren, adım 3 panellerde 14 belirteçleri için 12 numune analiz için yüksek verimlilik protokolü açıklar. Ancak, antikorların ve diğer kombinasyonları burada kullanılabilir; Protokol ilgilenilenlerdir için önerilen belirteçler ile ikame diğer EV popülasyonları çalışma için adapte edilebilir.

  1. 37 ° C'de ve çözülme (-80 ° C 'de depolandığı takdirde) dondurucu 12 örnek çıkarın.
  2. Pipet içeriği yukarı ve aşağı birkaç kez karıştırın. Her bir örnekten 320 ul çıkarın ve 96 gözlü bir levhanın üst üste ekleyin.
    NOT: Bir genişlik ayarlanabilir çok iyi pipetlemeyin bu ve eşek boyunca birçok diğer adımlar için son derece yararlı olanay, bir kerede birden fazla örnekleri analiz özellikle.

1.3) Boyama EV Örnekleri

  1. Boyamadan önce, olumlu sinyaller neden olabilir, agrega kaldırmak için tüm antikorları (Abs) filtre.
    1. Ab karışımın tümü filtreden geçtikten Kombine antikorlar 2 dakika boyunca oda sıcaklığında sabit bir açı tek hızlı santrifüj (~ 750 xg) ile ayrı bir 0.22 um santrifüj filtre tüpleri ve santrifüj içine 3 panellerin her kullanılacak kadar veya ve herhangi bir antikorun sıvı filtre yüzeyi üzerinde kalır. Mağaza Ab iki hafta buzdolabında kokteyller ama tekrar filtre kullanmadan önce her zaman.
  2. Iyi aralıksız 2'de her süzüldü antikor karışımının uygun miktarda (ör Her Ab 2 ul ile boyanır masasında örnekler, bu yüzden, süzüldü antikor kokteyli 12 ul'lik toplam 2 satır için her bir oyuğa ilave edilir). Önerilen plaka haritanın bir anahat için 1B Bakınız Şekil. Bu ek tekrarlayınDaha fazla paneller çalıştırmak eğer altındaki satırlara s (burada, iyi 4 satır için Panel III kokteyli 3 ve 11 ul / satır 8 ul / kuyu Panel II kokteyl ekleyin; özel paneli bilgileri için malzemeler Listesi'ne bakınız).
  3. Çok kanallı pipet kullanarak, yukarı ve aşağı satır 1 PPP örnekleri karıştırın ve 2. karıştırın yukarı ve aşağı satır kuyulara satır 1 kuyulardan 100 ul aktarın. 30 dakika boyunca 4 ° C 'de satır 3 ve 4 inkübasyona sıra 1 den 100 ul transfer değiştirme uçları ve tekrar.

1.4) Yıkama OG Örnekleri

  1. Biyolojik güvenlik kabini 96-kuyu 4 ° C plaka ve transferi çıkarın. / Oyuk satır 6-8 PBS 220 ul, bir çok kanallı pipet kullanarak (/ durulama lekeli PPP içeren kuyu yıkanması için kullanılmak üzere).
  2. Antikorların 3 panel, 12 x 3 = 36 filtre tüpleri ile, 12 numuneler için genişlik ayarlı çok kanallı pipet (kullanarak ön-etiketli santrifüj filtre tüpleri iyi her içeriğini aktarmak olacak) gerekli. Aynı ipuçları kullanarak, yıkama satırlardan PBS 200 ul kaldırmak ve PPP sadece çıkarıldığı gelen kuyulara ekleyin.
  3. Kuyu durulayın ve PPP önce ilave edildiği için aynı filtreler durulama çözüm aktarmak için aşağı yukarı karıştırın ve. Santrifüj filtre yakın üstleri. Değişim ipuçları.
  4. Tüm lekeli PPP örnekleri santrifüj filtre kendi durulama çözümleri ile birlikte devredilmiştir kadar kalan lekeli örnekleri ile bu işlemi tekrarlayın.
  5. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 850 xg'de sabit rotor santrifüj ve spin santrifüj filtre aktarın.
    NOT: Hiçbir sıvı filtre üstleri kalır emin olun. Santrifüj işleminden sonra, filtre, görünür sıvı tabaka üstünde kalan "kuru" olarak görünmelidir. Olası iken, bazı PPP örnekleri etkin bir filtre aracılığıyla taşımak için daha uzun bir santrifüj süresi gerekebilir.
  6. Santrifüj filtre tüpleri çıkarın ve biyolojik güvenlik kabini dönmek.Çok kanallı bir pipet kullanılarak, PBS, 300 ul filtre tepelerini yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse içerikler derhal FCM analizi için tüpler etiketli önceden transfer.
    NOT: Bu örnek-örnek varyasyon önlemek için numuneler arasında tutarlı pipet piston çöküntü kuvvet ve sayısını tutmak çok önemlidir. Bu ideal yukarı ve belirli bir hacme aşağı pipetlemeyin için programlanmış bir elektronik pipet kullanılarak yapılmalıdır (örn, 280 ul), her numune için zaman (örneğin, 8 kez) bir tam sayısı.

1.5) Sitometresi Kur

  1. FCM yazılımını açın. Kurulumu deneme (üreticinin talimatlarına) enstrüman kurulum boncuklar kullanarak günlük alet kalibrasyon ve kurulumu gerçekleştirmek için önce.
  2. EV örnekleri birden fazla antikor ile boyandı ve olan varsa birden fluorochromes aşağıdaki gibi tazminat değerlerini hesaplamak, bir kerede ölçülecek gibidir:
    1. Ön tazminat boncuk 2 damla ekleyin-etiketli borular (her bir florokrom-eşlenik antikor için 1 tüp) ve antikorun önerilen miktarını ekleyin. Lekesiz kompanzasyon kontrolü olarak kullanmak için başka bir tüp negatif tazminat boncuk 2 damla ekleyin.
    2. 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin PBS içinde 400 ul PBS ve tekrar süspansiyon ile yıkayın.
    3. Cihaz ile birlikte yazılım sitometrede akışını kullanarak, her tazminat tüpü çalıştırmak ve 5-on günlük bir ölçekte yaklaşık 10 4 her zirveye yerleştirmek için floresan gerilimler ayarlayın. Floresan tepe diğer tüm kanallara kıyasla kendi floresan kanalda yüksek (parlak) olduğundan emin olun ve gerekirse tekrar floresan parametrelerin gerilimleri ayarlayın. Her biri ayrı ayrı boyanmış abone ol tüp çalıştırın ve tüp başına en az 5.000 olayları yakalamak.
    4. Sonra seçin "Deney" sekmesini seçin "Telafisi," daha sonra tüm örnekler için tazminat değerlerini uygulamak için "Hesapla Telafisi" seçeneğini seçin.
  3. Ölçek log ve her biri için sitometresindeki (FSC = 200 ve SSC = 200) tarafından izin verilen en düşük eşik seçmek için ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) gerilim parametrelerini ayarlayın.
  4. 0.22 mikron filtreli PBS bir tüp çalışırken, (yani, sadece olay hızı 5 olayları / sn aşan hangi gerilim eşiğinin altında) arka plan gürültüsü çoğunluğunu dışlamak en yüksek değerlere FSC & SSC gerilimleri ayarlayın.
  5. Gerekirse, PBS içinde seyreltilmiş 1.0 um boncuklar, - Daha sonra, 0.2 mikron ihtiva eden bir tüp çalıştırın. FCS SSC vs arsa, um 0.2 ila 1.0 olayları yakalamak için boncuk nüfus etrafında bir kapı çizin. Alternatif olarak, bir SSC-H histogramda, 1.0 mikron boncuk daha küçük tüm olayları kapsar bir kapı çizin.
  6. "Lo" (yaklaşık 8-12 ul / dk) sitometresinin akış hızını ayarlayın. Boncuk tüp kullanarak (ya da boncuk bilinen bir konsantrasyonu içeren diğer tüp) arifesinde kadar sitometresindeki akış hızı kadranını ayarlayınnt oranı yaklaşık 200 olay / sn ulaşır. Aynı akış hızında tüm numune tüpleri okuyun ve bu akım hızları koşular arasında tutarlı kalmasını sağlamak için gelecek deneylerde aynı boncuk konsantrasyonunu kullanın.
  7. PBS içinde seyreltilmiş gökkuşağı floresan parçacıkların bir tüp çalıştırın. 5.000 olayları Edinme. FSC, SSC, ve her renk kanalı için ortalama yoğunluk değerleri kaydedin. Bu floresan yoğunlukları deneyler arasında tutarlı kalmasını sağlamak için gelecek deneylerde gerilimleri ayarlamak için bu değerleri kullanın.

1.6) Örnek Okuma

  1. "Lo" (yaklaşık 8-12 ul / dk) sitometresinin akış hızını ayarlayın ve tam olarak 1 veya 2 dakika boyunca her örnek çalıştırın.
  2. Ilk okuma sonra, NP-40 aşağı her numune, pipet yukarı ve% 10 20 ul ekleyin ve tespit pozitif olayların çıkarma izin zaman aynı miktarda (1 ya da 2 dk) için yeniden okumak eşit bir zaman dilimi içinde lize örnek.
    NOT: Bu son derece impNumuneler pipet yerine bir vorteks ile karıştırılabilir ki ortant. Bizim tecrübelerimize göre, vorteksleme EV-taklit olumlu olaylara yol açan, bazı antikorların kendine gelmesine neden olabilir.
  3. Bir kez tüm örnekler verme ayrı bir dosya içine tüm dosyaları .fcs FCM analizi yazılımı kullanılarak ileri analiz için kullanılacak, okundu.

1.7) Veri Analizi

  1. FCM analiz yazılımı açın. Yeni bir deneme dosyası içine .fcs tüm dosyaları içe.
  2. Boncuklar sadece tüp açın. SSC-A arsa vs FSC-A'da, etrafında 0.2 mikron ile 1.0 mikron arasında büyüklükte tüm boncuklar bir kapı çizin. Bu EV kapısıdır. Sürükle tüm numunelerin eklemek için.
  3. Negatif kontrol olarak lize örnekleri kullanarak, kullanılan Her florasan kanalına eşiğe kenarında kapıları çizin. Her gelen olmayan lize numunenin EV kapısı içine floresan kapıları sürükleyin.
    NOT: Bu noktada da ikili floresan iki parametre araziler incelemek yararlı olacaktır. Roket şekilleri içindebelirteçler alakasız hücre tipleri üzerinde ikamet bilinmektedir özellikle çift pozitif kadran toplama veya diğer kabarcık taklit olaylardan eserin göstergesi olabilir (Şekil 8).
  4. Her bir floresan markör için, sigara lize numunede olay sayısı ile ilgili lize numunede olay sayısını çıkarılır. İsteğe bağlı olarak,% pozitif değerleri almak için olmayan lize EV kapısının içindeki EVs toplam sayısına göre bu sayı bölün.

2. YÖNTEM B: Boncuk Yöntemi

AGH Kan Örneği / İzolasyon 2.1) İşleme

  1. (Bölüm 1.1) Yöntem A'da tarif edilen kan işleme yöntemine bakınız.

2.2) Analiz için Örnekleri Hazırlama

  1. İstenirse, eksozom ve microvesicles içine PPP veya ultrasantifrüjlenmiş AGH damıtmak. 0.22 mikron santrifüj filtreler PPP veya ultrasantifrüjlenmiş AGH 250 ul ekleyin ve 750 x sabit rotor santrifüj ve spin aktarmakoda sıcaklığında 2 dakika boyunca örn.
    NOT: Hiçbir sıvı filtre üstleri kalır emin olun. Santrifüj işleminden sonra, filtre, görünür sıvı tabaka üstünde kalan "kuru" olarak görünmelidir. Olası iken, bazı örnekler sıvı etkili bir filtre üzerinden hareket etmek için biraz daha uzun santrifüj süresi gerekebilir.
  2. 2 ml kaplanmamış 6 mikron polistiren boncuklar (örneğin, negatif ABC boncuk) RPMI medya ile 2x ve tekrar süspansiyon yıkayın. Her bir FACS tüpü 6,000 boncuk ekleyin. Negatif kontrol tüpüne, boncuk tek başına RPMI medya 400 ul ekleyin. Diğer tüm tüpler için, PPP veya ultrasantifrüjlenmiş AGH (veya fraksiyonları) 200 ul ve RPMI medya 200 ul ekleyin.
  3. Ortam ile 400 ul bütün tüpler son hacim ayarlama ve bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
  4. Ertesi sabah, ortam, 2 ml ile boncuk yıkayın. Süpernatant aspire.
  5. 4 ve 3 saat boyunca ortam (400 ul) içinde% 5 sığır serum albumin (BSA) ile bloke# 176, bir çalkalayıcı üzerinde ° C.
  6. Ortam, 2 ml ile boncuk yıkayın. Ortam 100 ul aspire ve tekrar süspansiyon pelet.

2.3) Boyama EV Örnekleri

  1. Tüm antikorları Filtre. Yöntem A'da kullanılan aynı antikor panelleri kullanarak ya da eğer arzu edilirse, sürece kendi fluorokromun birbirleriyle uyumlu olarak antikorlar, farklı bir kombinasyon yaratmak.
  2. Kombine Tüm antikorlar, bir 0.22 um filtre santrifüj tüpüne tek bir panelde kullanılır. 2 dakika boyunca ya da Ab karışımın tümü kadar sabit açılı tek hızlı santrifüj kullanılarak santrifüj filtreden geçirilir ve hiçbir antikor sıvı filtre yüzeyi üzerinde kalır.
  3. Tüm tüplere süzüldü antikor kokteylinin uygun hacimde ilave edin ve 4 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
  4. Sitometrede akış medya 400 ul medya, tekrar süspansiyon 2 ml boncuk yıkayın ve hemen çalıştırın (ya da aynı gün içinde).

2.4) Kurulum ve Numune Okuma Sitometrenin

  1. FCM yazılımını açın. Kurulumu deneme (üreticinin talimatlarına) enstrüman kurulum boncuklar kullanarak günlük alet kalibrasyon ve kurulumu gerçekleştirmek için önce.
  2. EV örnekleri birden fazla antikor ile boyandı ve olan varsa birden fluorochromes aşağıdaki gibi tazminat değerlerini hesaplamak, bir kerede ölçülecek gibidir:
    1. Tüpler etiketlenmiş önceden tazminat boncuk 2 damla (her florokrom-eşlenik antikor için 1 tüp) ekleyin ve antikorun önerilen miktarını ekleyin. Lekesiz kompanzasyon kontrolü olarak kullanmak için başka bir tüp negatif tazminat boncuk 2 damla ekleyin. 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin PBS içinde 400 ul PBS ve tekrar süspansiyon ile yıkayın.
    2. FCM yazılımı kullanarak, her tazminat tüpü çalıştırmak ve 5-on günlük bir ölçekte yaklaşık 10 4 her zirveye yerleştirmek için floresan gerilimler ayarlayın. Floresan tepe diğer tüm kanallara kıyasla kendi floresan kanalda (parlak) yüksek olduğundan emin olun veGerekirse tekrar floresan parametrelerin gerilimleri ayarlayın. Her biri ayrı ayrı boyanmış abone ol tüp çalıştırın ve tüp başına en az 5.000 olayları yakalamak.
    3. Sekmesini seçin "Deney," sonra "Tazminat," sonra "Hesapla Tazminat" tüm örnekler için tazminat değerlerini uygulamak için.
  3. Ölçek log ve her biri için sitometresindeki (FSC = 200 ve SSC = 200) tarafından izin verilen en düşük eşik seçmek için FSC ve SSC gerilim parametrelerini değiştirin.
  4. Tekli boncuk nüfus Run örnekleri, kapı ve bu kapıdan 2.000 olayları kazanır. Export .fcs dosyaları.
  5. Dosyaları .fcs analiz FCM analiz yazılımı kullanın. Tekli boncuklar üzerinde Kapısı. Her florokrom için geometrik ortalama floresan yoğunluğu (MFI) hesaplayın ve negatif kontrol MFI ile karşılaştırın.

Sonuçlar

Şekil 1, izolasyon ve boncuk esaslı yöntemi veya tek tek tespit metodu kullanarak EV'lerin tespiti için genel işlem şemasını açıklar. FCM büyük AGH analiz için iyi çalışır ama çoğu sitometrelerinde bireysel eksozom gibi parçacıkları kadar küçük tespit yeteneğine sahip değildir kullanarak EVs Bireysel algılama. Bir tane bazlı yaklaşım, Tablo 1 'de belirtildiği gibi küçük EVs, ancak, bu yöntem kullanılarak ilişkili dezavantajları vardı...

Tartışmalar

İzolasyon, tedavi ve EVs analizi için iki farklı protokol tek bir algılama veya boncuk esaslı yaklaşım kullanılarak sunulmuştur. Kullanmak için en uygun yöntemi seçerek her zaman kolay değildir ve faiz bireysel alt popülasyonlar yanı sıra test edilen numunenin bir anlayış gerektirir. En uygun yöntemi tercih Bundan başka, satın alma için kullanılan sitometresinde duyarlılığı göz önünde bulundurulmalıdır. Çoğu zaman doğrusu yöntemlerin bir kombinasyonu, tek başına herhangi bir yöntem...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Yazarlar enstrüman ayarları sitometrede akışı ile yaptığı yardım için kan Sistemler Araştırma Enstitüsü'nden Dale Hirschkorn teşekkür etmek istiyorum. NIH tarafından desteklenen bu çalışma HL095470 ve U01 HL072268 ve DoD sözleşmeleri W81XWH-10-1-0023 ve W81XWH-2-0028 verir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
LSR II benchtop flow cytometerBD Biosciences3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red)
FACS Diva software BD BiosciencesPC version 6.0
FlowJo software Treestar USMac version 9.6.1 or PC version 7.6.5
Sphero Rainbow fluorescent particlesBD Biosciences556298used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency 
Ultra Rainbow fluorescent particles SpherotechURFP-10-5used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch
Megmix-Plus SSC beadsBiocytex7803used to adjust FSC and SSC  voltages to maintain  consistency  between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs
AbC Anti-Mouse Bead KitLife TechnologiesA-10344used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)Santa Cruz sc-281108used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.
BD TruCOUNT TubesBD Biosciences340334used whenver absolute EV concentrations are needed
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter UnitsMillipore UFC30GVNBused to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-ABD Biosciences364606
Facs tubes 12x75 polystreneBD Biosciences352058
50 ml Reservoirs individually wrapped PhenixRR-50-1s
Green-Pak pipet tips - 10 µlRaininGP-L10S
Green-Pak pipet tips -200 µl RaininGP-L250S
Green -Pak pipet tips - 1,000 µl RaininGP-L1000S
Stable Stack L300 tips presterilizedRaininSS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer RaininLA8-300XLS
96 well tissue culture platesE&K ScientificEK-20180
RPMI 1640 Media (without Hepes)UCSF Cell Culture FacilityCCFAE001media used for bead-based detection method
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filteredUCSF Cell Culture FacilityCCFAL003
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-ClearBECKMAN COULTER INC344058
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5Biolegend3448082 µl
CD14 APC-Cy7Biolegend3018202 µl
CD16 V450BD Biosciences5604742 µl
CD28 FITCbiolegend3029062 µl
CD152 APCBD Biosciences5558552 µl
CD19 A700Biolegend3022262 µl
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5BD Biosciences3409302 µl
CD62L APCBiolegend3048102 µl
CD108 PE BD Biosciences5528302 µl
CD235a FITCbiolegend3491042 µl
PANEL III
CD11b PE-Cy7Biolegend3013222 µl
CD62p APCBiolegend3049102 µl
CD66b PE Biolegend3051062 µl
CD15 FITCexalphaX1496M5 µl
CD9 PEBiolegend555372
CD63 APCBiolegend353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κBiolegend400230

Referanslar

  1. Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  2. Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
  3. Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
  5. Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -. M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  6. Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
  7. Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  8. Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biology. 14 (1), 23 (2013).
  9. Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
  10. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  11. Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
  12. Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  13. Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -. F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
  14. Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
  15. Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
  16. Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -. M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
  17. Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
  18. Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
  19. Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
  20. Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
  21. György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  22. Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
  23. Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
  24. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
  25. Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
  26. Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
  27. György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).
  28. György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
  29. György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
  30. Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
  31. Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
  32. Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
  33. Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
  34. Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  35. Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

H cresel BiyolojiSay 97microvesiclesak sitometrieksozomlarh cre d vezik llery ksek verimlilikmikrotanecikler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır