Методы анализа внеклеточной везикул с использованием проточной цитометрии

Резюме

Существует много различных методов для измерения внеклеточной пузырьков (EVS) с помощью проточной цитометрии (FCM). Некоторые аспекты должны быть учтены при определении наиболее подходящего метода для использования. Два протокола для измерения электромобилей представлены, используя либо отдельные обнаружения или подход шарик на основе.

Аннотация

Внеклеточной Пузырьки (EVS) малы, мембранные, полученных пузырьки, найденные в жидкостях организма, что активно вовлечены в межклеточной коммуникации и помогают регулировать широкий спектр биологических процессов. Анализ электромобилей с помощью проточной цитометрии (FCM) был крайне сложно из-за их небольшого размера и отсутствия дискретных групп населения положительных маркеров, представляющих интерес. Методы EV анализа, в то время как значительно улучшилось за последнее десятилетие, по-прежнему в стадии разработки. К сожалению, нет один-размер-подходит-всем протокол, и некоторые аспекты должны быть учтены при определении наиболее подходящего метода для использования. Здесь представлены несколько различных методов для обработки электромобилей и два протокола для анализа электромобилей с использованием либо индивидуального обнаружения или подход шарик на основе. Методы, описанные здесь, поможет с устранением агрегаты антител обычно встречаются в коммерческих препаратов, увеличение отношения сигнал-шум и настройки ворота в рациональном FАшион, что сводит к минимуму обнаружение фоновой флуоресценции. Первый протокол использует индивидуальный метод обнаружения, который особенно хорошо подходит для анализа большого объема клинических образцов, в то время как второй протокол использует подход шарик на основе захватить и обнаружить более мелкие электромобилей и экзосомы.

Введение

Внеклеточной Пузырьки (EVS) малы, мембранные, полученных пузырьки, найденные в жидкостях организма, что активно вовлечены в межклеточной коммуникации и помогают регулировать широкий спектр биологических процессов. Анализ электромобилей с помощью проточной цитометрии (FCM) был крайне сложно из-за их небольшого размера и отсутствия дискретных групп населения положительных маркеров, представляющих интерес. Методы EV анализа, в то время как значительно улучшилось за последнее десятилетие, по-прежнему в стадии разработки. К сожалению, нет один-размер-подходит-всем протокол, и некоторые аспекты должны быть учтены при определении наиболее подходящего метода для использования. Здесь представлены несколько различных методов для обработки электромобилей и два протокола для анализа электромобилей с использованием либо индивидуального обнаружения или подход шарик на основе. Методы, описанные здесь, поможет с устранением агрегаты антител обычно встречаются в коммерческих препаратов, увеличение отношения сигнал-шум и настройки ворота в рациональном FАшион, что сводит к минимуму обнаружение фоновой флуоресценции. Первый протокол использует индивидуальный метод обнаружения, который особенно хорошо подходит для анализа большого объема клинических образцов, в то время как второй протокол использует подход шарик на основе захватить и обнаружить более мелкие электромобилей и экзосомы.

Электромобили, также известный как микрочастиц, небольшие, мембранные, полученных пузырьки, найденные в жидкостях организма, которые участвуют в межклеточной коммуникации и помогают регулировать широкий спектр биологических процессов ^1. Через экспрессии различных поверхностных маркеров и / или прямой передачи биологического материала, электромобили способны изменить функцию клеток-реципиентов играть либо активации или подавления роль в межклеточной коммуникации ^{2 - 4.} Клинически, тромбоцитарный электромобилей, как известно, имеют сильную антикоагулянтной активностью ^5, в то время как другие, как было показано, чтобы способствовать в широком диапазоне условий, от продвижения опухоли metastaSIS ⁶ к защите от болезней ^7. Электромобилей могут быть разделены на более мелкие категории клеток, полученных везикул, такие как экзосом и микропузырьки (MVS), в зависимости от их размера и механизма генерации ^8. Номенклатура клеток, полученных субпопуляций пузырьков продолжает оставаться темой продолжающейся дискуссии ^8,9, однако, экзосомы как правило, описываются как маленькие, от 40 до 100 нм частицы, полученные из эндосомный слияния с плазматической мембраной, в то время как MVs больше, от 100 до 1000 нм частицы формируется пролития мембраны плазмы ^10. Здесь общий термин "электромобилей" будет использоваться для обозначения всех типов внеклеточных биологических везикул, опубликованным клеток.

Выделение электромобилей из цельной крови является многоступенчатой ​​процедуры и многие различные переменные обработки было показано, что повлияет EV содержание, в том числе температуры и продолжительности хранения ^11,12, антикоагулянта / консерванта, используемого ¹³ иМетод центрифугирования используется ^14. Необходимость в стандартизации этих переменных привело к рекомендациям Международного общества по изучению тромбозов и обработки крови и выделения EV процедур гемостаза научных и комитет по стандартизации (ISTH SSC) для правильного ^15,16, но не существует консенсуса среди исследователей по оптимальной протокола использовать ^12. Большинство согласится с тем, однако, что жестким контролем преаналитического переменные имеют решающее значение для точных и воспроизводимых данных.

Для того чтобы проанализировать электромобилей, исследователи использовали различные методы, в том числе просвечивающей электронной микроскопии ^17, сканирующей электронной микроскопии ^18,19, атомно-силовой микроскопии, динамического рассеяния света ^20,21 и Вестерн-блоттинга ^22,23. В то время как FCM является методом выбора для многих исследователей ^{9,24 - 26} из-за его высоких возможностей пропускной способности, анализ электромобилей с использованием ТСМ былкак известно, трудно из-за их размера и отсутствия дискретных положительных населения ^{27 - 32.} По сравнению с анализом клеток, небольшой размер EVs приводит 1) меньше флуоресценции, испускаемой из-за меньшего числа антигенов на частицу, и 2) ограничено осуществимость после промывки пятен, которые необходимо уменьшить фоновой флуоресценции. Общие проблемы среди исследователей относятся сигналы, возникающие в связи с иммуноглобулина агрегатов ^27,28 и самоагрегации антител ^29. Кроме того, длительное время обработки и длительные процедуры стирки / изоляции, используемый многими из нынешних протоколов ^33,34 требуют обязательства времени многодневные анализировать небольшое количество образцов, что делает их менее идеально подходит для применения при высоких пропускную способность. Некоторые исследователи отказаться шаг стирки в целом, оказание традиционно используются ТСМ негативные элементы управления, такие как флуоресценция минус один (FMO) и изотипов антител бесполезной для точной оценки концентрации алкоголя в кровиkground флуоресценции ^30.

Наши протоколы решить три общие проблемы, которые могут препятствовать надлежащего анализа ТСМ электромобилей: Сигналы, возникающие на основе агрегатов антител и других не-пузырьков, трудности при удалении несвязанного антитела и отсутствия заметных положительных населения. Методы, описанные здесь, поможет с устранением агрегаты антител обычно встречаются в коммерческих препаратов, увеличение отношения сигнал-шум и настройки ворота в рациональным образом, чтобы минимизировать обнаружение фоновой флуоресценции. Два разных методов обнаружения представлены здесь: Первый протокол использует индивидуальный метод обнаружения, который особенно хорошо подходит для анализа большого объема клинических образцов, в то время как второй протокол использует подход шарики на основе, чтобы захватить и обнаружить более мелкие электромобилей и экзосомы.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие протоколы были выполнены в соответствии со всеми институциональном, национальном и международных руководящих принципов для благосостояния человека. Все образцы человеческого субъекта были протестированы в соответствии с этическим комитетом (IRB) -approved протокола и информированного согласия субъектов.

1. МЕТОД: Индивидуальное Метод обнаружения

1.1) переработки крови образца / Изоляция электромобилей

1. Нарисуйте кровь из донорской / пациента в двух 10 мл стеклянных пробирок, содержащих 1,5 мл ACD-раствора А или другой подходящий антикоагулянт и процесс немедленно (в течение 30 мин макс), используя следующий протокол дифференциального центрифугирования 2 этапов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол даст примерно 10 мл обедненной тромбоцитами плазмы (РРР) из объединенных ~ 17 мл крови, отобранной. Если более или менее ППС необходимо, количество трубок в крови, собранной может быть соответствующим образом скорректированы.
2. Центрифуга образцов при 1500 х г в течение 10 мин при комнатной температуреотделить плазму от светлого сгустка крови и эритроцитах. Перевести 1,2 мл аликвоты плазмы супернатанта 1,5 мл центрифужные пробирки, стараясь не потревожить нижние слои, содержащие Баффи пальто и красные клетки.
3. Спин при 13000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы удалить тромбоцитов и большие фрагменты клеток. Тщательно передачи PPP, оставив 200 мкл, чтобы не мешать осадок и добавить PPP в новую пробирку.
4. На данный момент, используйте PPP немедленно для анализа или передачи в 1,0 мл аликвоты к новым 1,5 мл центрифужные пробирки и хранят при -80 ° С в течение до двух лет для последующего анализа (обратитесь к рисунку 1А для обзора).
5. Если очищенные электромобилей необходимы для функциональных экспериментов, передача 6 мл ППС по ультрацентрифужную пробирку и добавить 28 мл 0,2 мкм фильтрованной фосфатно-солевом буфере (PBS). Спин в течение 60 мин при 100000 х г при комнатной температуре с использованием ультрацентрифуги оборудованной ротором Бакет. Отберите супернатант и ресуспендируют EV пикселпусть в 1,5 мл среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения воспроизводимости, образцы крови должны быть обработаны как последовательно, как можно дальше от донора к донору. Любое изменение в методе изоляции EV может существенно повлиять на количество и тип электромобилей обнаружены.

1.2) Подготовка образцов для анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: С этой точки зрения, шаги объясняют высокую протокол пропускную способность для анализа 12 образцов для 14 маркеров в 3-панелей. Тем не менее, другие комбинации антител могут быть использованы здесь; Протокол может быть адаптирован для изучения других групп EV путем замены предлагаемые маркеров для тех интерес.

1. Удалить 12 образцов из морозильной камеры (при хранении при -80 ° С) и оттаивания при 37 ° С.
2. Пипеток содержание вверх и вниз несколько раз перемешать. Удалить 320 мкл из каждого образца и добавить в верхнем ряду 96-луночного планшета.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Регулируемый по ширине многоскважинных пипетки является чрезвычайно полезным для этого и многих других шагов по всей задницеай, особенно при анализе нескольких образцов сразу.

1,3) Образцы Окрашивание EV

1. Перед окрашиванием, фильтровать все антитела (ABS), чтобы удалить агрегаты, которые могут вызвать положительные сигналы.
   1. Комбинирование антитела, которые будут использоваться в каждом из 3 панелей на отдельные 0,22 мкм центробежных труб фильтров и центрифуг с использованием фиксированным углом одной скорости центрифуги (~ 750 мкг) при КТ в течение 2 мин, или пока все смеси AB не прошел через фильтр и ни антитела жидкость не остается на поверхности фильтра. Магазин Ab коктейли в холодильнике до двух недель, но повторно фильтр каждый раз перед использованием.
2. Добавить соответствующее количество отфильтрованной Ab смеси в каждую лунку в строке 2 (например, образцы в панели ввода окрашивают 2 мкл каждого AB, так в общей сложности 12 мкл фильтрованного Ab коктейль добавляют в каждую лунку к строке 2). Обратитесь к рисунку 1В для контура предложенной пластины карте. Повторите эти дополненияс к строкам расположенной ниже, если больше панели запуска (здесь, добавьте 8 мкл / лунку коктейля Группа II к строке 3 и 11 мкл / лунку коктейля Группа III в строке 4, см список материалов для конкретной информации панели).
3. Использование многоканального пипетки, перемешать образцы ГЧП в строке 1 вверх и вниз и передать 100 мкл из скважин в строке 1 в лунки ряда 2. Смешайте вверх и вниз. Изменить советы и повторяю, передача 100 мкл из ряда 1 к строкам 3 и 4. инкубировать при 4 ° С в течение 30 мин.

1,4) Стиральная М.В. Образцы

1. Удалить 96-луночного планшета от 4 ° C и трансфер в кабинете биологической безопасности. Используя многоканальную пипетку, добавьте 220 мкл PBS / лунку в строках 6-8 (который будет использоваться для промывки / промывки лунок, содержащих окрашенных PPP).
2. Передача содержимого каждой лунки с заранее помечены центробежных труб фильтра с использованием ширины регулируемой многоканального пипетки (для 12 образцов с 3 панелей антител, 12 х 3 = 36 фильтр трубы будутпотребуется). Использование одних и тех же советов, удалить 200 мкл PBS от стирки строк и добавить к соответствующим скважин, из которых PPP был только что удалили.
3. Смешайте вверх и вниз, чтобы ополоснуть скважин и передать промывочный раствор тех же фильтров, которые РРР ранее добавленных. Закрыть вершины центробежных фильтров. Изменить советы.
4. Повторите этот процесс с остальными окрашенных образцов, пока все окрашенные образцы ППС не были переданы вместе с их промывки решений центробежных фильтров.
5. Передача центробежные фильтры с фиксированной ротора центрифуги и спина при 850 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что жидкость не остается на вершинах фильтра. После центрифугирования, фильтр должен оказаться "сухой" без видимых слой жидкости оставаясь на вершине. Хотя это маловероятно, некоторые образцы ГЧП может потребоваться больше времени, центрифугирования эффективно двигаться через фильтр.
6. Удалить центробежные трубы фильтра и вернуться к бокса биологической безопасности.Использование многоканального пипетки, ресуспендируют вершины фильтров в 300 мкл PBS. Трансфер ресуспендированные содержимое, предварительно промаркированные пробирки для немедленного анализа ТСМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень важно сохранить силы и количества пипетки плунжерных депрессий в соответствии среди образцов, чтобы избежать образца к образцу изменения. Это должно быть сделано в идеале с использованием электронной пипетки, который был запрограммирован, чтобы пипетки вверх и вниз определенного объема (например, 280 мкл) точное число раз (например, в 8 раз) в течение каждого образца.

1.5) Цитометр Setup

1. Откройте программное обеспечение ТСМ. До экспериментировать установки, выполнять ежедневную калибровку прибора и настройки с помощью установки прибора бусы (следуя инструкциям изготовителя).
2. Если образцы EV были окрашены более чем одного антитела и несколько флуорохромы, измеряются одновременно, вычисление значений компенсаций следующим образом:
   1. Добавить 2 капли компенсации бисером предварительномеченных трубы (1 пробирку для каждого флюорохром-конъюгированных антител) и добавить рекомендуемое количество антител. Добавить 2 капли негативных бисером компенсации в другую пробирку, чтобы использовать в качестве неокрашенных контроля компенсации.
   2. Выдержите при 4 ° С в течение 30 мин, смойте PBS и ресуспендируют в 400 мкл PBS.
   3. Использование цитометра Программное обеспечение в комплекте с прибором, запустить каждый компенсации трубку и настроить люминесцентные напряжения поместить каждую вершину примерно в 10 ⁴ на логарифмической шкале 5 десятилетия. Убедитесь, что пик флуоресценции высокий (яркие) в своем собственном флуоресцентного канала по сравнению со всеми другими каналами и регулировки напряжения флуоресцентных параметров снова, если это необходимо. Запустите каждую отдельно окрашенных комп трубку и захватить по крайней мере 5000 событий в трубке.
   4. Выберите вкладку "Эксперимент", затем выберите "Компенсация", затем выберите "Рассчитать Компенсация", чтобы применить значения коррекции для всех образцов.
3. Установите вперед рассеяния (FSC) и боковое рассеивание (SSC) параметры напряжения для входа масштаб и выбрать самые низкие пороговые значения, разрешенные цитометром (FSC = 200 и SSC = 200) для каждого.
4. Во время работы трубку 0,22 мкм фильтрованной PBS, отрегулируйте напряжение FSC и SSC к высшим ценностям, которые исключают большинство фонового шума (т.е., чуть ниже порога напряжения, при котором частота событий превосходит 5 события / с).
5. Далее, запустите в пробирку, содержащую 0,2 мкм - 1,0 мкм бусы, разбавленные в PBS в случае необходимости. В ФТС против SSC участка, нарисуйте ворота вокруг населения борта для захвата событий от 0,2 мкм и 1,0 мкм. Кроме того, в гистограмме SSC-H, нарисуйте ворота относятся все события меньше, чем бисера 1,0 мкм.
6. Указан расход цитометр на "Lo" (примерно 8-12 мкл / мин). Использование шариков трубки (или другой трубки, содержащей известную концентрацию шариков) не регулировать расход диск на цитометр до наканунеNT ставка достигает примерно 200 мероприятий / сек. Read все образцы трубки с той же скоростью потока и использовать такую ​​же концентрацию шарик в будущих экспериментов обеспечить, чтобы скорость потока остаются неизменными между запусками.
7. Запустите трубку радужных частиц люминесцентных разводят в PBS. Приобретать 5000 событий. Запишите средние значения интенсивности для ФСБ, SSC, и каждый цветовой канал. Используйте эти значения для регулировки напряжения в будущих экспериментах чтобы гарантировать, что интенсивность флуоресценции остаются неизменными от эксперимента к эксперименту.

1.6) чтение образца

1. Указан расход цитометр на "Lo" (примерно 8-12 мкл / мин) и запустить каждый образец для точности 1 или 2 мин.
2. После первого чтения, добавить 20 мкл 10% NP-40 для каждого образца, пипетки вверх и вниз, и перечитал за тот же промежуток времени (1 или 2 мин), чтобы обеспечить вычитания положительных событий, обнаруженных в лизируют отбора проб в течение равного времени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это очень импortant, что образцы будут смешаны с помощью пипетки, а не вихрь. По нашему опыту, вихревание может привести к самоагрегации некоторых антител, что приводит к EV, имитирующие позитивных событий.
3. После того, как все образцы были прочитаны, экспорт все .fcs файлов в отдельном файле, которые будут использоваться для дальнейшего анализа с помощью программного обеспечения FCM анализа.

1.7) Анализ данных

1. Откройте программное обеспечение ТСМ анализа. Импорт всех файлов .fcs в новый файл эксперимента.
2. Откройте бусы только трубки. В FSC-A против SSC-сюжет, нарисовать ворота вокруг все шарики размером от 0,2 мкм и 1,0 мкм. Это EV ворота. Перетащите, чтобы добавить ко всем пробам.
3. Использование лизированных образцов в качестве отрицательного контроля, сделать ворота на краю фоновой флуоресценции в каждом канале флуоресценции, используемой. Перетащите люминесцентные ворота в EV ворот каждого соответствующего не-лизируют образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе также полезно изучить двойные люминесцентные участки би-параметров. Ракетные формы вдважды положительном квадранте (рисунок 8), особенно, если маркеры, как известно, находятся на неродственных типов клеток, может свидетельствовать о артефакта от агрегации или других пузырьков имитирующие событий.
4. Для каждого флуоресцентным маркером, вычесть количество событий в лизированных образца из числа событий в не-лизируют образца. Возможно, разделить это число на общее количество электромобилей в не-лизируют EV ворот, чтобы получить% положительных значений.

2. Способ B: шарики Способ

2.1) переработки крови образца / Изоляция электромобилей

1. См способа обработки крови, описанной в способе А (раздел 1.1).

2.2) Подготовка образцов для анализа

1. При желании, фракционирования PPP или ультрацентрифугируют электромобилей в экзосом и микровезикул. Добавить 250 мкл PPP или ультрацентрифугируют электромобилей 0,22 мкм центробежных фильтров и трансфер в фиксированной ротора центрифуги и спина в 750 хг в течение 2 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что жидкость не остается на вершинах фильтра. После центрифугирования, фильтр должен оказаться "сухой" без видимых слой жидкости оставаясь на вершине. Хотя это маловероятно, некоторые образцы могут потребовать несколько больше времени центрифугирования для жидкости для эффективного перемещения через фильтр.
2. Вымойте без покрытия 6 мкм шариков из пенополистирола (например, отрицательные бисер ABC) 2x с RPMI СМИ и ресуспендируют в 2 мл. Добавить 6000 бусы к каждому FACS трубы. К отрицательным трубки управления, добавить 400 мкл RPMI СМИ одиночку бисера. Для всех других труб, добавить 200 мкл PPP или ультрацентрифугируют электромобилей (или их фракций) и 200 мкл RPMI СМИ.
3. Регулировка конечного объема всех труб в 400 мкл со средствами массовой информации и инкубировать в течение ночи при 4 ° С на качалке.
4. Следующим утром, вымойте бусы с 2 мл среды. Аспирируйте надосадочную.
5. Блок 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в средствах массовой информации (400 мкл) в течение 3 ч при 4 &# 176; С на качалке.
6. Вымойте бисер с 2 мл среды. Отберите и ресуспендируют осадок в 100 мкл среды.

2,3) Окрашивание EV Образцы

1. Фильтровать все антитела. Использовать одни и те же антитела панелей, используемых в способе A, или, если желательно, создавать различные комбинации антител тех пор, пока их флуорохромы совместимы друг с другом.
2. Сочетают в себе все антитела, которые будут использоваться в одной панели в центробежным фильтром трубы 0,22 мкм. Центрифуга с использованием фиксированным углом одного скорости центрифуги в течение 2 мин, или пока все смеси Ab прошло через фильтр и не антитела жидкость не остается на поверхности фильтра.
3. Добавить соответствующий объем отфильтрованной коктейль антитела во все пробирки и инкубируют в течение 30 мин при 4 ° С.
4. Вымойте бисер с 2 мл среды, ресуспендируют в 400 мкл среды и запустить сразу (или в тот же день) на проточной цитометрии.

2.4) Цитометр настройки и чтение образца

1. Откройте программное обеспечение ТСМ. До экспериментировать установки, выполнять ежедневную калибровку прибора и настройки с помощью установки прибора бусы (следуя инструкциям изготовителя).
2. Если образцы EV были окрашены более чем одного антитела и несколько флуорохромы, измеряются одновременно, вычисление значений компенсаций следующим образом:
   1. Добавить 2 капли компенсации бисером предварительно промаркированные пробирки (1 пробирку для каждого флюорохром-конъюгированных антител) и добавьте рекомендованное количество антител. Добавить 2 капли негативных бисером компенсации в другую пробирку, чтобы использовать в качестве неокрашенных контроля компенсации. Выдержите при 4 ° С в течение 30 мин, смойте PBS и ресуспендируют в 400 мкл PBS.
   2. Использование программного обеспечения FCM, запустить каждый компенсации трубку и регулировки напряжения флуоресцентные разместить каждый пик приблизительно при 10 ⁴ в логарифмическом масштабе 5-лет. Убедитесь, что пик флуоресценции высокий (яркие) в своем собственном флуоресцентного канала по сравнению со всеми другими каналами инастроить напряжения флуоресцентных параметров снова, если это необходимо. Запустите каждую отдельно окрашенных комп трубку и захватить по крайней мере 5000 событий в трубке.
   3. Выберите вкладку "Эксперимент", затем "возмещение", затем "Рассчитать Компенсация", чтобы применить значения коррекции для всех образцов.
3. Изменение FSC и параметры SSC напряжения для входа масштаб и выбрать самые низкие пороговые значения, разрешенные цитометром (FSC = 200 и SSC = 200) для каждого.
4. Запуск образцы, ворота на население синглетного бисером и приобрести 2000 событий в эти ворота. Экспорт .fcs файлы.
5. Использование программного обеспечения FCM анализа для анализа .fcs файлов. Ворота на синглетными бисером. Вычислить среднее геометрическое интенсивность флуоресценции (MFI) для каждого флуорохромом и сравнить с MFI отрицательного контроля.

Результаты

Рисунок 1 описывает общую схему обработки для выделения и обнаружения электромобилей, используя либо метод шарик на основе или индивидуальный метод обнаружения. Индивидуальный обнаружения электромобилей с использованием FCM работает хорошо для анализа больших электромоб...

Обсуждение

Были представлены два различных протокола для выделения, обработки и анализа электромобилей, используя какой-либо отдельный обнаружения или бисером подход. Выбор наиболее подходящего метода для использования не всегда проста и требует понимания тестируемому образцу, а также отдельн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
LSR II benchtop flow cytometer	BD Biosciences		3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red)
FACS Diva software	BD Biosciences		PC version 6.0
FlowJo software	Treestar US		Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5
Sphero Rainbow fluorescent particles	BD Biosciences	556298	used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency
Ultra Rainbow fluorescent particles	Spherotech	URFP-10-5	used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch
Megmix-Plus SSC beads	Biocytex	7803	used to adjust FSC and SSC  voltages to maintain  consistency  between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs
AbC Anti-Mouse Bead Kit	Life Technologies	A-10344	used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)	Santa Cruz	sc-281108	used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.
BD TruCOUNT Tubes	BD Biosciences	340334	used whenver absolute EV concentrations are needed
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units	Millipore	UFC30GVNB	used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A	BD Biosciences	364606
Facs tubes 12x75 polystrene	BD Biosciences	352058
50 ml Reservoirs individually wrapped	Phenix	RR-50-1s
Green-Pak pipet tips - 10 µl	Rainin	GP-L10S
Green-Pak pipet tips -200 µl	Rainin	GP-L250S
Green -Pak pipet tips - 1,000 µl	Rainin	GP-L1000S
Stable Stack L300 tips presterilized	Rainin	SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer	Rainin	LA8-300XLS
96 well tissue culture plates	E&K Scientific	EK-20180
RPMI 1640 Media (without Hepes)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAE001	media used for bead-based detection method
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear	BECKMAN COULTER INC	344058
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5	Biolegend	344808	2 µl
CD14 APC-Cy7	Biolegend	301820	2 µl
CD16 V450	BD Biosciences	560474	2 µl
CD28 FITC	biolegend	302906	2 µl
CD152 APC	BD Biosciences	555855	2 µl
CD19 A700	Biolegend	302226	2 µl
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	340930	2 µl
CD62L APC	Biolegend	304810	2 µl
CD108 PE	BD Biosciences	552830	2 µl
CD235a FITC	biolegend	349104	2 µl
PANEL III
CD11b PE-Cy7	Biolegend	301322	2 µl
CD62p APC	Biolegend	304910	2 µl
CD66b PE	Biolegend	305106	2 µl
CD15 FITC	exalpha	X1496M	5 µl
CD9 PE	Biolegend	555372
CD63 APC	Biolegend	353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ	Biolegend	400230