Motor End Plates boyunca İntramüsküler Enjeksiyonlar: Doğrudan Motor Nöronlar içine Servis Tarayıcıları Bir Minimal İnvaziv Yaklaşım

Özet

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Özet

Omurilik motor nöron bütünlüğünü etkileyen hastalıklar en zayıflatıcı nörolojik durumlar arasında yer almaktadır. Son on yıl içinde, bu nöromüsküler bozuklukların çeşitli hayvan modellerinin geliştirilmesi geciktirmek veya bu şartların ilerlemesini tersine çevirmeyi amaçlayan farklı tedavi senaryolar bilimsel topluluk sağlamıştır. Nöronların retrograd makine yararlanarak, bu yaklaşımlardan birisi omurilik motor nöronlarını karşılık gelen mekik terapötik genlerin amacıyla iskelet kasları hedef olmuştur. Bir kez umut verici olmasına rağmen, bu tür gen verici bir yaklaşım başarılı bugüne kadar elde etmek göstermiştir kalıt motor nöronların alt optimal sayısı engel olmuştur. Motor uç plakaları (MEP) motor nöronların α omuriliğe doğrudan sinaptik temas halindedir iskelet kas üzerinde son derece uzman bölgelerdir. Bu bağlamda, dikkat etmek önemlidir, şimdiye kadar, çabalar retrograd içinMotor nöron içine transfer genlerinin hedeflenen kaslarında MEP bölgenin konumu referans olmadan yapılmıştır. Burada basit bir protokol 1) iskelet kaslarında yüzeyinde milletvekillerinin tam yerini ortaya çıkarmak için ve 2), motor nöronların içine intramüsküler teslimat ve retrograd izleyiciler sonraki optimum retrograd taşıma yönlendirmek için bu bilgileri kullanarak açıklar. Biz Avrupa Parlamentosu üyelerinin hedefleme üzerinden omurilik motor nöronlar terapötik genlerin retrograd taşıma araştıran içine ileri çalışmalar bu izleme deneylerin sonuçlarını yararlanmak istiyoruz.

Giriş

Böyle motor nöron hastalığı gibi nörolojik koşullar kaynaklanan ve spinal- istemli hareket yanı sıra Duchenne müsküler atrofi kontrolünün kaybı, etkilenen bireylerin günlük yaşamda yüksek ve uzun ömürlü bir etkiye sahip bir zayıflatıcı bir durumdur. Son on yılda, durdurmak ya da en azından bu nöromusküler hastalıkların zararlı etkilerini geciktirmek amacıyla araştırma çabalarının dünyadaki birçok klinisyen ve bilim adamı için bir öncelik olmuştur. Bu bağlamda, bu nöromüsküler hastalığı taklit hayvan modellerinin son nesil bu koşullar ^1-13 gelişimi ve ilerlemesini altında yatan fizyolojik mekanizmaları temel anlayışlar elde vesile olmuştur. Bu nöromüsküler hastalığın tedavisi omurilik doğrudan erişim gerektirir ve omurilik enjeksiyonlar ^14,15 ile elde edilebilir. Gen terapisinde son gelişmeler de üst ve çizgili kaslar hedef aldılar veomurilik ^1,9-13 ventral boynuz içinde yer almaktadır karşılık gelen α motor nöronlar servis terapötik genlere alt ekstremite. Ancak, bu kez umut verici bir strateji bu nörolojik durumların sonuçlarını iyileştirmek için başarısız oldu. Bu kötü sonuçların olabileceği sonucuna adil olsa da, en azından kısmen, bu koruyucu genlerin düşük etkinliğine bağlı olduğu, kimse bu gen aktarım yöntemleri, düşük etkinliğini gözardı edilemez.

Motor uç plakaları (MEP) motor nöronların α kaynaklanan büyük periferik motorlu liflerin akson terminalleri girintilendirildiği iskelet myofibres uzman bölgeleridir. Birlikte, periferik sinir lifi uçları ve Parlamento üyeleri, yani nöromüsküler kavşak, sinaptik darbeleri nörotransmiterin ileriye salınımı, asetilkolin tarafından tetiklenen bölgesini oluşturur. Önemlisi, periferik sinir lifleri ve milletvekillerinin arasındaki ilişki iki Direc olduğunuarası, farklı motorlar yanı sıra uzak nörondan doğru moleküllerin ve organellerin taşınmasından sorumlu olmasına rağmen ^16-18 somata. Bu anatomik düşüncelerin ışığında, AP üyeleri ilgili motor nöronlara teslimat ve genetik malzeme daha sonra geriye doğru taşınması için tercih edilen hedefler olarak görünmektedir. Bu bağlamda, bu motor nöron iletimi başarısı büyük ölçüde viral vektörler ve kasın AP üyeleri ^19-20 intramüsküler enjeksiyon arasındaki mesafeye bağlı olması şaşırtıcı değildir. Ancak şaşırtıcı bir şekilde, laboratuar sıçan ve fare myofibres ilgili MEP bölgelerinin kesin konumu, seçim iki tür kas hastalıkları modellemek için, yakın zamana kadar mevcut değildi.

Biz sıçan ve fare ^21-22 çeşitli ön ayakları kaslar için MEP bölgenin kapsamlı haritalar üretmişlerdir. Daha yakın zamanlarda, biz MEP r organizasyonu detaylarını göstermiştirFare hindlimb ²³ çeşitli kaslar için egion ve şu anda sıçan hindlimb milletvekilleri özelliklerini analiz ediyoruz. Bizim ellerde, bu kasların bütün MEP bölgelerine yönelik retrograd izleyiciler kas içine enjeksiyonlar önceden bildirilen daha omurilik segmentleri kapsayan vardır daha etiketli motor nöronlar doğurdu. Burada dış yüzeyinde yanı sıra hindlimb derinliği boyunca Avrupa Parlamentosu üyelerinin yerini ortaya koymak ve fare ve sıçan hem de kasları ön ayakları son birkaç yıldır geliştirilmiştir protokol mevcut.

Protokol

Burada açıklanan tüm deneysel prosedürleri UNSW Avustralya Hayvan Bakım ve Etik Kurulu uyulması ve Ulusal Sağlık ve hayvan deney için Tıbbi Araştırma Konseyi Avustralya yönetmeliklere uygun olarak yapıldı. Bu protokolde tüm işlemler, ilgili Hayvan Bakım ve Etik Kurulu gereklerine uygun olarak yapılmalıdır.

1. Asetilkolinesteraz Histokimyasal Boyama

1. Asetilkolinesteraz Reaksiyon karışımı hazırlayın
   1. 0.1 M fosfat tamponu (PB) 200 ml asetiltiyoklolin iyodür 290 mg ekleyin. 900 rpm'de bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın.
   2. Sürekli karıştırma altında, glisin, 600 mg ekleyin.
   3. Ürün tamamen çözünene kadar yavaş yavaş sürekli karıştırma altında, reaksiyon karışımına bakır sülfat ve 420 mg ekleyin.
2. Hayvan karkas deriyi kaldır kesiler yaparak (doku paylaşımı yoluyla elde edilen)Bir perfüze sıçan veya fare derisi, boyun bölgesinde cildi tutup ayağa geçmiş çekerek içine. Her kas kapsayan fasya kaldırıldı veya önemli ölçüde reaksiyon çözeltisine kas liflerinin bol pozlama sağlamak için delikli ya olduğundan emin olun.
3. Reaksiyon karışımına tüm vücudu veya ilgi bacak daldırın ve 4 ° C de O / N inkübe edin.
4. Damıtılmış su içinde 2 dakika boyunca karkas yıkayın. Not: Bu aşamada, kaslar mavi bir renk ve motor uç plakaları (MEP) beyaz noktalar olarak görülebilir sergiler.
5. 3-5 saniye için% 10 amonyum sülfit çözeltisine karkas Açığa.
   Not: kas lifleri hızla kahverengi dönecek ve Parlamento üyeleri siyah benekli noktalar olarak gözlemlenebilir olacak. Reaksiyon çok hızlı oluşur ve kas lifleri amonyum sülfit çözeltisi (örneğin,% 5) daha düşük konsantrasyonlarını kullanmayı deneyin milletvekilleri ve kas lifleri ayırt etmek çok koyu lekeli ise. Tepkime süresi almak içinAP üyeleri ve kas lifleri arasında iyi kontrast bir örnekten diğerine değişir. Bu nedenle ayıracı kesin pozlama süresini tanımlamak zordur. Reaksiyon yakından izlenmeli ve kontrast yeterli görüldüğünde durdurulmalıdır.
6. Distile su içinde çalkalanarak karkas iki kez yıkayın ve yavaşça kurulayın karkas.
7. Fotoğraf ilgi tüm kaslar için milletvekilleri yakalanır sağlamak ekstremitenin lateral ve medial yönleri, hem de.

2. İntramüsküler Enjeksiyonlar Motor Sonu Plakalar de

1. Mikropipet çektirmesi ile cam mikropipetler çekin (pistonları ile kademeli mikropipetlerin kullanılması tavsiye edilir). Inceleyici bir mikroskobun yardımıyla, mikropipet lümenin iç çapı yaklaşık olarak 0.5 mm, öyle ki bir çift forseps ile mikropipetler ipuçlarını bölünürler.
2. Kullanılan tüm cerrahi aletler taze otoklava ve inci emin olunCerrahi alanda sterildir.
3. Floro-Gold (distile su içinde% 5) ile mikropipetler doldurun.
4. Izofloran (O _2% 4) ile bir indüksiyon odasında hayvan anastetize neden olur. Refleksi kontrol edin ve indüksiyon odasından çıkarmadan önce onun yokluğunda sağlamak. Sıçan burun üzerinde bir burun konisi Güvenli ve anestezi bakımı için isofluorane (O _2% 2) teslim. Hayvanın ayak parmakları Pinch ve yavaşça pedal çekilmesi ve kornea refleksleri hem bulunmadığına emin olmak için hayvanın gözü dokunun. Not: ketamin ve xylazil bir karışımı da kullanılabilir (80 ve 10 mg / kg, intraperitonal olarak verilen). Ketamin bir zamanlama 8 ("Kontrollü") ilaç ve uyulması gerekecektir ilacın satın alınması, kullanılması, depolanması ve bertaraf ile ilgili gerekli protokoller olduğunu.
5. Prosedürü sırasında gözlerin kurumasını önlemek için göz yağlayıcı.
6. T Tıraşargeted bacak ve kullanım gazlı bez, üç klorheksidin alternatif scrubs ve% 70 alkol ile traş bölgeyi silin. Cerrahi alana hayvan aktarın.
7. Temiz bir underpad hayvan koyun ve hedeflenen kas (lar) iyi erişim sağlamak için uygun bir şekilde yerleştirin.
8. Uzakta yatan kas hedeflenen kas üzerindeki deriyi kaldırın ve cerrahi makas ile deride bir kesi yapmak için diş kılıf ile forseps bir çift kullanın. Kesi tamamen ilgi kas (lar) maruz yeterince büyük olduğundan emin olun. Fasya minimal bozulma olduğundan emin olun.
9. Zihinsel kas (lar) üzerine MEP bölgenin konumunu ve şeklini devrik MEP fotoğrafları kullanın.
   Not: Bir ince keçe işaretleyici ilgi kas (lar) üzerine fotoğraftan MEP bölgesini çoğaltmak yardımcı olabilir.
10. Her bir s 1-2 ul 3-4 enjeksiyonlar, Flor-Gold için (MEP bölgenin tüm uzunluğu boyunca çok sayıda enjeksiyon gerçekleştirmehould) yeterli olabilir. Yavaşça herhangi sızıntıyı gidermek için kas (lar) silin.
11. Birbirine yakın künt forseps ile kazıma cilt iki ucunu getirin ve cerrahi klipler ile yarayı kapatmak. Yaranın tüm açıklık boyunca 0.1 mi bupivakainin (su içinde% 0.5) (ya da başka lokal anestezikler) sızın.
12. Kapalı anestezi Makineyi açın ve tamamen anestezi kurtarılır kadar hayvan izleyin.
13. Kas içi enjeksiyonların uygulanmasından ve hayvanların perfüzyon arasında 14 gün boyunca bekleyin.

3. Perfüzyonları

1. Periton içine enjeksiyon yoluyla bir hayvana (150 mg / kg, örneğin Lethabarb) pentobarbiton sodyum çözeltisi öldürücü doz uygulayın.
   1. Pedal çekilmesi yokluğunda ve kornea refleksleri tarafından onaylandıktan anestezi derin bir düzeyde, ulaşılana kadar yakından hayvan izlemek.
2. Bir perfusio üzerine yerleştirilen bir diseksiyon gemide sırtında hayvan yerleştirinn lavabo.
3. Sternum tabanını kaplayan derinin kaldırılması için diş kılıf ile forseps bir çift kullanın. Hemen sternum altında güçlü cerrahi bir makasla küçük bir cilt kesisi yapın ve daha sonra kavrama sternum kılıç şeklinde kıkırdak forseps kullanabilir. Kılıç şeklinde kıkırdak tutarken, koltukaltı için sternum, göğüs boşluğunun her iki tarafında kesi büyütmek.
4. Kalp maruz diyaframı kesin.
   1. Kan pıhtılaşmasını önlemek için doğrudan kalp apeksine heparin 0.ml enjekte edilir.
   2. Sol ventrikül içine bir kanül yerleştirilmesine imkan vermek için tepe kesin ve daha sonra hızlı bir şekilde Hemostatik yardımı ile yerine kanül kelepçe.
   3. İnce bir makas ile sağ atrium bir kesi yapmak ve hemen peristaltik pompa başlar. Atrium dışarı akan sıvının kan neredeyse ücretsiz ve karaciğer rengi açık kahverengi oluncaya kadar 0.1 M PB ile serpmek. Daha sonra, Solu serpmekhayvanın tüm vücut kadar paraformaldehid (0.1 M PB% 4) tion sertleşmektedir.

4. Servikal Spinal Kord Diseksiyon ve Histoloji Hazırlık

1. Kendi karın hayvan karkas yatırın.
2. Bir neşter ile vücudun orta hatta cilt kesin ve iliak kemik seviyesine kafatası tabanından yansıtmak.
3. Kesmek ve omurganın dorsal yönünü ortaya çıkarmak için paravertebral kaslar yansıtmaktadır.
4. Atlas, ikinci servikal segmentte (yani, C2) kemik spinoz sürecini tanımlayın ve ilgili temel dorsal kök bulmak için cerrahi rongeurs veya forseps bir çift ile çıkarın.
   1. Kalıcı keçe işaretleyici ile boyama sağ C2 kök tanımlayın.
   2. Bir sonraki vertebra tek çıkarın ve alternatif renkler (yani, C2, C4, C6 ve C8 yeşil ve C3 renkli olabilir sağ dorsal kökleri işaretlemek, C5, C7, T1 col olabilirORed mavi).
5. Küçük bir cerrahi iğne kullanın (örneğin, 30 G iğne) hafifçe delmek omuriliğin alt ucunu kaplayan dura aracılığıyla. Uzunlamasına yarık yapmak için rostrally iğne taşırken yukarı bakacak şekilde iğne eğim sayesinde, kordon uzak dura kaldırın.
   1. Dura Reflect.
6. Yeni bir neşter bıçağı ile bir veya iki kademeli bloklar halinde omurilik enine doğru kesin.
   1. Dikkatlice iki komşu kökleri arasındaki neşter bıçağı yarım her bloğun sol tarafında küçük bir referans işareti yapmak, her blok için, in situ omurilik segmentleri bırakın ve. Blokların ventral görünür olması için referans işareti dokusu sayesinde yeterince derin olduğundan emin olun. Diseksiyon sonra doku parçasının oryantasyon yardımcı olmak için, hayvan anatomisi ile ilgili olarak, ya öne ya da arkaya doğru işaret eden, yaklaşık 45 ° 'lik bir açı ile referans işareti sağlayın.
7. Paraformaldehitten (0.1 M PB% 4) çözeltisi içeren küçük, açıkça etiketlenmiş şişeler içine bireysel blokları toplayın ve RT O / N bırakın.
8. Sukroz (0.1 M PB% 30) ihtiva eden bir çözelti ihtiva eden, temiz, açık bir şekilde etiketlenmiş şişelerde blokları aktarın ve en az iki gün boyunca 4 ° C'de tutun.
9. Cryo-kalıplar kesimleri yerleştirin ve doku dondurma ortamı ile onları kaplı. Boyuna histolojik hazırlanması için, yukarı bakacak şekilde dorsal bloklar yönlendirmek ve cryo-kalıplarda blok yönlendirmek için referans işareti kullanın.
10. -20 ° C'de krio-kalıpları dondurun ve 50 um kalınlığında kesitler bir kriyostat ile kesilmiş. Not: bölümler doğrudan yapışma mikroskop slaytlar üzerine monte ve / N O kurumaya bırakılabilir. Seçenek olarak ise, bölümler 0.1 M PB ile doldurulmuş 48 oyuklu plakalar içinde yüzen edilebilir ve daha sonra, slaytlar üzerinde doku bölümleri yönlendirmek için referans işareti kullanılarak monte edilebilir.

5. Lomber Spinal Cord Diseksiyon ve Histoloji Hazırlık

1. Geri geldi hayvan karkas yatırın.
2. Hayvanın karın boyunca bir orta hat kesi gerçekleştirin ve iç organları çıkarın. Vertebral kolonun ventral maruz arka karın duvarı kasları parçalara ayır.
3. T13 ventral kök kemiği çıkar kısa kuyruk-en kaburga ve onun bitişiğindeki T13 omur bulun.
   1. Ardışık T13 teker, iki veya üç omur rostral birini çıkarın (örneğin, T12, T11 ve gerekirse, T10) ince cerrahi rongeurs ile ventral kord ventral yönünde giriş noktası kadar T13 ventral kök takip etmek ve Kalıcı keçe işaretleyici ile işaretleyin.
   2. Bu noktadan itibaren, alternatif renkler ile boyama, L1, L2, L3, L4, L5, L6 ve S1 için ventral kök giriş noktaları yerini belirlemek için aynı işlemi tekrarlayın.
4. Lum için Bölüm 4,5-4,10 açıklandığı gibi aynı prosedürü uygulayınOmurilik diseksiyonu bar.

Sonuçlar

Asetilkolinesteraz histokimyasal boyama kaslarının genişliği boyunca motor uç plakaları yerini ortaya koymaktadır. 1 bütün sıçan ön ayakları üzerinde gerçekleştirilen bu tür boyama sonuçlarını gösterir Şekil. Bu, amonyum sülfit çözeltisinin konsantrasyonu optimize etmek için önerilmektedir (örn.,% 5-7 yerine% 10) da bir örnek çözelti içine daldırılmaktadır zaman olarak kas lifleri üzerinde spesifik olmayan arka plan boyaması çok ise, Aşır...

Tartışmalar

İntramüsküler hedefleme ve nöromüsküler durumun deneysel tedavi için gelen α motor nöronlar terapötik transgenlerin sonraki retrograd transferi, yeni bir strateji değildir. Örneğin, bu dağıtım yöntemi SOD1 fareler ve sıçanlar ^1,9-12 ALS ilerlemesi farklı aşamalarında olarak SMA ¹³ olan farelerde kas dejenerasyonu geciktirmek için kullanılmaktadır. Umut verici iken, bu gen terapisi senaryoları etkinliği sınırlı kalmıştır. Bu bağlamda, belkemiği ipliği motor nöron...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluoro-Gold	Fluorochrome, LLC	Nil	Diluted to 5%
Drummond PCR Micropipets 1-10 µl	Drummond Scientific	5-000-1001-X10	accompanied with plungers
Acetylthiocholine Iodide	Sigma Life Science	A5751-25G
Copper(II) Sulfate Anhydrous	Sigma-Aldrich	61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T Compound	Sakura Finetek	25608-930
Glycine	Ajax Finechem	1083-500G
Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin	Life Technologies	D-3312	Diliuted in distilled water
Isothesia	Provet	ISOF00	1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour
Autoclip 9 mm Wound Clips	Texas Scientific Instruments, LLC	205016
Lethabarb Enthanasia Injection	Virbac (Australia) Pty Ltd.	LETHA450
Formaldehyde Solution	Ajax Finechem	A809-2.5L PL
SuperFrost Plus glass slides	Menzel-Glaser	J1800AMNZ
Ammonium Sulphide	Sigma-Aldrich	A1952	Diluted to 10%
Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)	Astrazenca		Diluted to 0.25%