Injecções intramusculares Ao longo das placas Motor End: uma abordagem minimamente invasiva para Shuttle Tracers Diretamente em Neurônios Motores

Resumo

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Resumo

Doenças que afetam a integridade da medula espinhal neurônios motores estão entre as doenças neurológicas mais debilitantes. Durante as últimas décadas, o desenvolvimento de vários modelos animais destas doenças neuromusculares forneceu a comunidade científica com cenários terapêuticos diferentes destinadas a retardar ou inverter a progressão destas condições. Tirando partido da maquinaria retrógrada de neurónios, uma destas abordagens tem sido a alvejar os músculos esqueléticos, a fim de genes terapêuticos de transporte em correspondentes neurónios motores da medula espinal. Embora uma vez promissora, o sucesso da abordagem de entrega de tal gene tem sido dificultada pelo número sub-ótimo de neurônios motores transduzidas até agora tem mostrado a ceder. Placas motoras (MPE) são regiões altamente especializados na musculatura esquelética que estão em contato direto sináptica para a medula espinhal α neurônios motores. A este respeito, é importante notar que, até agora, os esforços para retrogradamentegenes transferência para os neurônios motores foram feitas sem referência à localização da região de MEP nos músculos alvo. Aqui, descrevemos um protocolo simples 1) para revelar a localização exata dos deputados na superfície dos músculos esqueléticos e 2) usar esta informação para guiar a entrega intramuscular e transporte retrógrado ideal subsequente de traçadores retrógrados em neurônios motores. Esperamos utilizar os resultados desses experimentos de rastreamentos em novos estudos sobre investigando transporte retrógrado de genes terapêuticos para os neurônios motores da coluna vertebral cabo através da segmentação dos deputados.

Introdução

A perda de controle do movimento voluntário que resulta de condições neurológicas, como a doença do neurônio motor e spinal-, bem como atrofia muscular de Duchenne é uma condição debilitante que tem um impacto elevado e duradouro na vida todos os dias dos indivíduos afetados. Durante a última década, os esforços de pesquisa com o objetivo de parar ou pelo menos retardar os efeitos deletérios dessas doenças neuromusculares tem sido uma prioridade para muitos médicos e cientistas de todo o mundo. A este respeito, a recente geração de modelos animais que imitam estas doenças neuromusculares foi essencial na obtenção de conhecimentos fundamentais sobre os mecanismos fisiológicos subjacentes ao desenvolvimento e à progressão destas condições ^1-13. O tratamento destas doenças neuromusculares requer acesso directo à medula espinal e pode ser conseguida através de injecções na medula espinhal ^14,15. Os recentes avanços na terapia genética também têm como alvo os músculos estriados do superior emembros inferiores a genes terapêuticos de transporte para os neurônios motores α correspondentes que estão localizados dentro do corno anterior da medula espinhal ^1,9-13. No entanto, esta estratégia promissora uma vez não conseguiu melhorar o resultado dessas condições neurológicas. Embora seja justo concluir que estes resultados pobres poderia ser, pelo menos em parte, ser atribuída à baixa eficácia destes genes protetores, não se pode excluir a baixa eficácia destes métodos de entrega de genes.

Placas motoras (MPE) são regiões especializadas das miofibras esqueléticos que são recuados pelos terminais do axônio de grandes fibras motoras periféricas provenientes de α neurônios motores. Em conjunto, as terminações de fibras nervosas periféricas e os eurodeputados formar a junção neuromuscular, ou seja, o local onde os impulsos sinápticos são desencadeadas pela libertação anterógrada do neurotransmissor, acetilcolina. Importante, a relação entre as fibras nervosas periféricas e os eurodeputados é bi-direccional, embora diferentes motores são responsáveis ​​pelo transporte de moléculas e organelas, bem como no sentido para longe do neurónio somata ^16-18. À luz dessas considerações anatômicas, os deputados parecem ser os alvos de escolha para a entrega e transporte retrógrado subsequente de material genético para os neurônios motores correspondentes. Neste contexto, não é surpreendente que o sucesso da transdução de neurónio motor depende muito da distância entre a injecção intramuscular de vectores virais e do PE do músculo ^19-20. Surpreendentemente, no entanto, a localização exacta das zonas de MEP nos miofibras do rato de laboratório e do rato, as duas espécies de escolha para modelar doenças neuromusculares, não estavam disponíveis até recentemente.

Temos produzido mapas detalhados da região do MEP para vários músculos forelimb no rato eo rato ^21-22. Mais recentemente, nós mostramos os detalhes da organização do MEP region por vários músculos do membro posterior do rato ²³ e estamos actualmente a analisar as características dos deputados do Parlamento Europeu sobre o membro posterior de ratos. Em nossas mãos, injeções intramusculares de traçadores retrógrados dirigidos às zonas inteiras MEP nestes músculos deu origem a neurônios motores mais marcadas que estão abrangendo segmentos da medula espinhal mais do que o relatado anteriormente. Aqui apresenta-se o protocolo que tem sido desenvolvida ao longo dos últimos anos a revelar a localização dos eurodeputados na superfície externa, bem como em toda a profundidade do membro posterior e músculos do membro anterior, tanto no rato e na ratazana.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais descritos aqui cumprido o Cuidado e Comitê de Ética da UNSW Austrália Animal e foram realizados de acordo com o Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho da Austrália regulamentos para a experimentação animal. Todos os procedimentos deste protocolo deve ser realizado de acordo com a exigência do Comitê Animal Care and Ethics relevante.

1. Acetylcholinesterase histoquímico Coloração

1. Preparar a mistura de reacção acetilcolinesterase
   1. Adicionar 290 mg de iodeto de acetiltiocolina a 200 ml de tampão 0,1 M de fosfato (PB). Misturar com um agitador magnético a 900 rpm.
   2. Adicionar 600 mg de glicina sob agitação contínua.
   3. Adiciona-se lentamente 420 mg de sulfato de cobre para a mistura reaccional, sob agitação contínua até o produto estar completamente dissolvido.
2. Retirar a pele na parte da carcaça do animal (obtido através de partilha de tecido) fazendo incisõesna pele de um rato ou rato perfundido, agarrando a pele da área de pescoço e puxando-o passado seus pés. Certifique-se de que a fáscia que cobre cada músculo é removido ou perfurado de forma significativa para assegurar exposição suficiente das fibras musculares para a solução reaccional.
3. Imergir todo o corpo ou parte do interesse na mistura de reacção e incuba-O / N a 4 ° C.
4. Lava-se a carcaça durante 2 min em água destilada. Nota: Nesta fase, os músculos exibem uma coloração azul e as placas motoras terminais (MPE) pode ser vista como pontos brancos.
5. Expor a carcaça para uma solução de sulfureto de amónio a 10% durante 3-5 segundos.
   Nota: As fibras musculares vai rapidamente virar marrom e os deputados do Parlamento Europeu será observável como pontos salpicados pretos. Se a reacção ocorre muito rapidamente, e as fibras musculares são coradas muito escuro para distinguir entre os eurodeputados e as fibras musculares tente usar concentrações mais baixas da solução de sulfureto de amónio (por exemplo, 5%). O tempo de reacção para obter oóptimo contraste entre os eurodeputados e as fibras musculares varia de uma amostra para a outra. Por conseguinte, é difícil definir o tempo de exposição exacto com o reagente. A reacção deve ser cuidadosamente monitorizado e parado quando o contraste é considerada adequada.
6. Lave a carcaça duas vezes, com agitação em água destilada e suavemente pat a seca de carcaça.
7. Fotografia tanto os aspectos lateral e medial do membro, garantindo que os deputados do Parlamento Europeu para todos os músculos de interesse são capturados.

2. As injeções intramuscular nas placas Motor End

1. Puxe micropipetas de vidro com um puxador de micropipeta (o uso de micropipetas graduadas com êmbolos é recomendado). Com a ajuda de um microscópio de dissecação, quebrar as pontas das micropipetas com um par de pinças de modo a que o diâmetro interno do lúmen da micropipeta é aproximadamente 0,5 mm.
2. Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos utilizados são recém-autoclavado e thna área cirúrgica é estéril.
3. Encha as micropipetas com Fluoro-Gold (5% em água destilada).
4. Anaesthetise induzir no animal numa câmara de indução com isofluorano (4% em O _2). Verifique se há reflexo de endireitamento e garantir a sua ausência antes de o retirar da câmara de indução. Garantir um cone de nariz através da focinho do rato e entregar isofluorano (2% em O ₂₎ para a manutenção da anestesia. Comprima dedos do animal e gentilmente tocar o olho do animal para garantir que tanto a retirada pedal e os reflexos da córnea estão ausentes. Nota: Uma mistura de cetamina e xylazil também pode ser usada (80 e 10 mg / kg, respectivamente, entregue por via intraperitoneal). A ketamina é um anexo 8 ("Controlada") de drogas e protocolos necessários associados com a compra, uso, armazenamento e eliminação da droga terão de ser respeitados.
5. Aplicar lubrificante olho para evitar a secagem dos olhos durante o decurso do processo.
6. Raspar a tmembro argeted e uso de gaze para limpar a área raspada com três esfrega alternadas de clorexidina e álcool 70%. Transferir o animal à zona cirúrgica.
7. Colocar o animal em um underpad limpo e posicioná-lo de forma adequada para garantir um bom acesso ao músculo alvo (s).
8. Utilizar um par de pinças com dentes apertos para levantar a pele sobre o músculo orientada para longe da musculatura subjacente e fazer uma incisão na pele com tesouras cirúrgicas. Assegure-se que a incisão seja suficientemente grande para expor completamente o músculo (s) de interesse. Certifique-se de que não há o mínimo de interrupção para a fáscia.
9. Use as fotografias de MEP para transpor mentalmente a localização e forma da região de MEP para o músculo (s).
   Nota: Um marcador de feltro fino poderia ajudar a reproduzir a região do MEP da fotografia para o músculo (s) de interesse.
10. Executar múltiplas injecções ao longo do comprimento total da região de MEP (para Fluoro-Gold, 3 a 4 injecções de 1-2 ul cada should ser suficiente). Limpe cuidadosamente o músculo (s) para remover qualquer infiltração.
11. Traga as duas extremidades da pele incisão perto junto com uma pinça sem corte e fechar a ferida com grampos cirúrgicos. Se infiltrar Bupivacaína 0,1 ml (0,5% em água) (ou outros anestésicos locais) ao longo de toda a extensão da ferida.
12. Desligue a máquina anestésico fora e monitorar o animal até que ele tem está totalmente recuperado da anestesia.
13. Esperar durante 14 dias entre a administração de injecções intra-musculares e a perfusão dos animais.

3. As perfusões

1. Administrar uma dose letal de pentobarbitona solução de sódio (por exemplo Lethabarb; 150 mg / kg) ao animal por injecção intraperitoneal.
   1. Acompanhar de perto o animal até um nível profundo de anestesia é alcançado, como foi confirmado pela ausência da retirada pedal e os reflexos da córnea.
2. Posicione o animal à sua volta em uma placa de dissecação colocado sobre um perfusion pia.
3. Utilizar um par de pinças com dentes apertos para levantar a pele que cobre a base do esterno. Faça uma pequena incisão na pele com um par de tesouras cirúrgicas fortes imediatamente abaixo do esterno e em seguida, usar a pinça para agarrar a cartilagem xifóide do esterno. Mantendo a cartilagem xifóide, alargar a incisão em ambos os lados da cavidade torácica, a partir do esterno para as axilas.
4. Cortar o diafragma para expor o coração.
   1. Injectar 0.ml de heparina directamente para o vértice do coração para impedir a coagulação do sangue.
   2. Cortar o vértice para permitir a inserção de uma cânula no ventrículo esquerdo, e, em seguida, apertar rapidamente a cânula no lugar com a ajuda de um hemostático.
   3. Faça uma incisão no átrio direito com um par de tesouras finas e iniciar imediatamente a bomba peristáltica. Perfundir com 0,1 M PB até que o líquido que flui para fora do átrio é quase livre de sangue e a cor do fígado torna-se castanho claro. Em seguida, perfundir com uma solução de paraformaldeído (4% em 0,1 M PB) até que todo o corpo do animal se torna rígida.

4. Cervical Spinal Cord Dissecção e Preparação para Histologia

1. Coloque a carcaça do animal em seu abdômen.
2. Cortar a pele na linha média do corpo com um bisturi e reflectir a partir da base do crânio até ao nível do osso ilíaco.
3. Cortar e refletem os músculos paravertebrais para expor o aspecto dorsal da coluna vertebral.
4. Identificar o processo espinhoso óssea do Atlas, o segundo segmento cervical (ou seja, C2), e removê-lo com um par de fórceps ou pinças cirúrgicas para localizar a raiz dorsal correspondente subjacente.
   1. Identificar a raiz C2 direito colorindo-o com um marcador de feltro permanente.
   2. Remover o próximo vértebras, um por um e marcar as raízes dorsais direito com cores alternadas (ou seja, C2, C4, C6, C8 e pode ser colorido de verde e C3, C5, C7, T1 pode ser colORed em azul).
5. Utilize uma pequena agulha cirúrgica (por exemplo, 30 L agulha de calibre) para suavemente perfure através da dura-máter que cobre a extremidade inferior da medula espinhal. Com o bisel da agulha virada para cima, levantar a dura-máter longe do cabo enquanto move a agulha de rostral para fazer uma fenda longitudinal.
   1. Reflectem a dura.
6. Corte o transversalmente da medula espinhal em blocos de um ou dois segmentos com uma nova lâmina de bisturi.
   1. Deixar os segmentos da medula espinhal in situ e, para cada bloco, cuidadosamente fazer uma pequena marca fiducial no lado esquerdo de cada bloco com a meio caminho entre a lâmina de bisturi duas raízes adjacentes. Certifique-se de que a marca fiducial é suficientemente profundo através do tecido a ser visível a partir do aspecto ventral dos blocos. Adicione a marca fiducial a um ângulo de aproximadamente 45 °, que aponta ou anteriormente ou posteriormente com respeito à anatomia animal, para auxiliar na orientação do segmento de tecido a seguir a dissecção.
7. Recolher os blocos individuais em frascos pequenos, claramente marcado contendo uma solução de paraformaldeído (4% em 0,1 M PB) e deixar à TA S / N.
8. Transferir os blocos em garrafas limpas, claramente marcado contendo uma solução de sacarose (30% em 0,1 M PB) e manter a 4 ° C durante pelo menos dois dias.
9. Coloque os segmentos em crio moldes e os cobriu com meio congelamento do tecido. Para a preparação histológica longitudinal, orientar os blocos com o dorso voltado para cima e usar a marca fiducial para orientar o bloco nos moldes crio.
10. Congelar as crio-moldes à temperatura de -20 ° C e cortado com um crióstato em secções de 50 micrometros de espessura. Nota: As secções podem ser directamente montadas em lâminas de microscópio de adesão e deixa-se secar S / N. Em alternativa, as seções podem ser lançada em placas de 48 poços cheios de 0,1 M PB e posteriormente montado usando a marca fiducial para orientar as secções de tecido sobre os slides.

5. lombar Spinal Cord Dissecção e Preparação para Histologia

1. Coloque a carcaça do animal nela está para trás.
2. Realizar uma incisão na linha média ao longo do abdómen do animal e remover as vísceras. Dissecar os músculos da parede abdominal posterior para expor o aspecto ventral da coluna vertebral.
3. Localize a costela caudal-mais curto e sua adjacente vértebra T13 onde a raiz ventral T13 sai do osso.
   1. Consecutivamente remover um por um a rostral dois ou três vértebras para T13 (isto é, T12, T11 e, se necessário, T10) com fórceps cirúrgicas finas para seguir a raiz ventral T13 até ao seu ponto de entrada na face ventral da medula ventral e marcá-lo com um marcador de feltro permanente.
   2. A partir deste ponto em diante, repetir o mesmo processo para identificar a localização dos pontos de entrada de raiz ventral para L1, L2, L3, L4, L5, L6 e S1, colori-los com cores alternadas.
4. Siga o mesmo procedimento como descrito na Seção 4,5-4,10 para lumbar dissecção da medula espinhal.

Resultados

Coloração histoquímica da acetilcolinesterase revela a localização das placas terminais do motor no sentido da largura dos músculos. A Figura 1 ilustra os resultados de coloração tais realizada em um membro anterior de rato inteiro. Sugere-se para optimizar a concentração da solução de sulfureto de amónio (por ex., 5-7% em vez de 10%), bem como o momento em que o espécimen é imerso na solução se a coloração de fundo não específica sobre as fibras musculares é demasiado exc...

Discussão

Segmentação intramuscular e subsequente transferência de transgenes retrógrada terapêuticas para os correspondentes neurónios motores α para o tratamento experimental da condição neuromuscular não é uma nova estratégia. Por exemplo, este método de entrega tem sido usado para retardar a degenerescência neuromuscular em diferentes fases da progressão de ALS em ratinhos e ratos SOD1 ^1,9-12, bem como em ratinhos com SMA ^13. Embora promissora, a eficácia destes cenários de terapia de ge...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluoro-Gold	Fluorochrome, LLC	Nil	Diluted to 5%
Drummond PCR Micropipets 1-10 µl	Drummond Scientific	5-000-1001-X10	accompanied with plungers
Acetylthiocholine Iodide	Sigma Life Science	A5751-25G
Copper(II) Sulfate Anhydrous	Sigma-Aldrich	61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T Compound	Sakura Finetek	25608-930
Glycine	Ajax Finechem	1083-500G
Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin	Life Technologies	D-3312	Diliuted in distilled water
Isothesia	Provet	ISOF00	1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour
Autoclip 9 mm Wound Clips	Texas Scientific Instruments, LLC	205016
Lethabarb Enthanasia Injection	Virbac (Australia) Pty Ltd.	LETHA450
Formaldehyde Solution	Ajax Finechem	A809-2.5L PL
SuperFrost Plus glass slides	Menzel-Glaser	J1800AMNZ
Ammonium Sulphide	Sigma-Aldrich	A1952	Diluted to 10%
Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)	Astrazenca		Diluted to 0.25%