İntravenöz Glikoz Tolerans Testi ile insan olmayan primatlarda Metabolik Durumu Karakterizasyonu

Özet

Bu protokolün amacı, insan dışı primatlarda glisemik kontrolü değerlendirmek ve dismetabolik sağlıklı onların metabolik durumunu değerlendirmek için intravenöz glikoz tolerans testi (IVGTT'ler) gerçekleştirmek için standart bir yöntem sunmaktır.

Özet

İntravenöz glikoz tolerans testi (IVGTT) glikoz dengesinin karakterizasyonu önemli bir rol oynar. serum biyokimyasal profilleri, hem beslenen kan glikoz seviyelerinin kapsayıcı ve açlık durumunda, HbA1c, insülin düzeyleri, diyet klinik öykü, vücut kompozisyonu ve vücut ağırlığı durumu, normal ve anormal glisemik kontrolün değerlendirilmesi ile birlikte alındığında yapılabilir . Bir IVGTT'nin yorumlanması dekstroz meydan ilişkin zamanla kan şekeri ve insülin düzeylerinde değişiklikler ölçümü ile yapılır. Dikkate alınması gereken kritik bileşenleri şunlardır: T0 (glikoz infüzyon sonu), ilk 20 dakika içinde hızlı glikoz temizlenmesi eğiminden elde edilen glukoz temizlenme oranı K (T20 T1), zamana göre ulaşılan zirve glikoz ve insülin düzeyleri glikoz taban dönmek için, ve eğri (AUC) altındaki alan. Bu İVGTT önlemler sağlıklı bir t glikoz homeostasis hareket ettikçe karakteristik değişiklikler gösteriroa hastalıklı metabolik durumu ^5. Bu yazıda gelen insanlarda Tip II diyabet (T2D) en alakalı hayvan modeli ve İVGTT ve bu hayvanların klinik profilleri insan dışı primatlarda (Rhesus ve sinomolgus makakları), karakterizasyonu anlatacağım bir obez dismetabolik için, sağlıklı yalın, ve T2D devlet ^{8, 10, 11.}

Giriş

IVGTT ^rutin farklı metabolik Devletleri ^{5 7} insanlarda β-hücresi fonksiyonunu belirlemek için kullanılan uygun bir işlevsel tahlildir. T2D hayvan modellerinde, bu da iyi metabolik hastalık ilerlemesini gösteren hayvanlar karakterize etmek için bir araç olarak kabul edilmektedir bir dismetabolik hiperglisemik hal ^{8, 9} sağlıklı. T2D en yakın hayvan modeli, rhesus ve sinomolgus maymunları önemli örneklerdir olan insan olmayan primatlarda (NHPs), gösterilmektedir. Bu hayvanlar doğal insanlarda ¹⁰ gibi yaş ve sıklığı katkıda obezite aynı risk faktörleri ile T2D gelişir. Ayrıca, orada da benzer bir hastalık ilerlemesi ve dismetabolik hastalığı ¹¹ ilerledikçe pankreas patoloji amiloid birikimi gösteren.

İşte bu hayvanlarda metabolik durumunun bizim koloni karakterizasyonu bir parçası olarak NHPs bir İVGTT gerçekleştirme standart yönteme rapor. Bu yöntem, birtüketen diğer, daha zaman ve pahalı teknikler ² göreli gerçekleştirmek kolay. IVGTT hızlı ve sık sık hayvanların büyük bir koloni karakterize etmek için yararlıdır. Glike hemoglobin (HbA1C) düzeyi ile dikkate alındığında, hayvanın beslenme ve gıda alımı tarih, yanı sıra yüzde yağsız kütle ve vücut yağ, İVGTT normalde aşikar diyabet ⁶ doğru bir hayvanın metabolik durumunu ve ilerlemesini karakterize etmek için yeterlidir ^8.

HbA1C üç ay önceki altı hafta içinde glikoz seviyelerinin güvenilir bir ölçümünü sağlayan bir kırmızı kan hücresinin ömrü boyunca ortalama glisemik düzeyini temsil eder. IVGTT'nin oruç bazal kan örneğinden ölçüldüğünde, bu değer prosedürleri arasında aylarda glisemik kontrol içine bir pencere sağlar. hayvan son IVGTT'nin beri diyabetik için dismetabolik dan geçiş ise, önceki değerinden çok daha yüksek bir HbA1C değeri işaret ederGeçiş yakında başladı son IVGTT'nin sonra ise, yakın önceki değere bir HbA1C değeri sadece son zamanlarda geçişini olduğunu işaret eder. Genel olarak, rhesus makak içinde, HbA1C% 6 kötü glisemik kontrolü ^{10, 23} anormal kabul edilir ve işaret edilir daha fazla değer verir.

Glisemi düzeyleri bir bütün olarak hayvan davranışı ve genel sağlığı kapsamında değerlendirilmelidir. Diyabetik makakları - sergi hyperphagia, polidipsi, poliüri ve - insanlar gibi. Hayvanların grup konut dismetabolik ve diyabetik maymunlar için gerekli bu göstergeler ve bireysel bakım ölçümü için önemli zorluklar sağlar. Bu, tek başına fazla kişisel bakım sağlanabilir sırayla hayvanları konut tavsiye ve daha kolay bir şekilde maymun sağlığı davranışsal belirteçleri ⁸ izlenmelidir. Buna ek olarak, diyabetik makakları kilo kaybı, yanı sıra artan yüksek bir lipid profili (sergileyecekkolesterol, hipertrigliseridemi) ve serum kimyasında rahatsız mineral metabolizması. Bu organlara zarar metabolik bozukluk / diyabet ilerleyen komplikasyonları genellikle, ve glisemik, lipid ve mineral dengesizlikleri ^{9, 11, 18} ortak belirleyicileri ^{olabilir 24} gibi, karaciğer ve serum kimyasında böbrek fonksiyonunun belirteçleri ölçmek önemlidir .

Bu yöntemi kullanırken bir maymunun hayat belirli değere sahip üzerine, tarihi değerleri çoklu sık karakterizasyonu oluşturulan. Böyle bir glikoz kelepçe veya kademeli glukoz infüzyon (GGI) gibi diğer işlemler, tam bir hayvanın sağlığını değerlendirmek için gerekli olup olmadığını kendi geçmişi kullanılamaz olduğunda, ilk karakterizasyonu üzerine yaygın olduğunu. her üç ayda bir bir sıklıkta bir temel oluşturulmuştur Ancak, bir kez tekrarlanan IVGTT'ler, operasyondan bir hayvanın ilerlemesini takip etmek için, normal olarak yeterlidir. hayvanlar üzerinde birden fazla çalışmalar alındı ​​zaman bu özellikle önemlidirtakvim yılı metabolik durumuna dayalı. sağlık bir seferde yıl nispeten istikrarlı kalabilir sırasında bir hayvanın metabolik durumu kötüleşir zaman, insülin direnci ve glukoz intoleransı dramatik bir artış çok hızlı oluşabilir. HbA1C değerleri üç ay arayla planlanan prosedürleri arasında hayvan sağlık durumunun azalması ya da bazı gelişmeler enterpolasyon için izin verir. Bu nedenle, bu yöntem, doğal ömrü boyunca birden fazla uzunlamasına çalışmalarda kullanılan hayvanların vasıflandırılması için idealdir.

Protokol

Butun hayvan prosedürleri, protokol 14-017 altında, Kuzey Karolina Araştırma Campus (NCRC) üzerinde yer alan David H. Murdock Araştırma Enstitüsü IACUC onaylı edildi, diyabet ve prediyabet / insülin direnci ve terapötik etkinliğinin bir insan olmayan üstün ırk modelinin karakterizasyonu geliştirmek insülin duyarlılığı ve metabolik fonksiyonu.

1. Hayvan Seçimi ve Çalışma Hazırlık

1. aylık gıda alımı ve vücut ağırlığı kayıtlarına dayanarak Seç diyet ve kilo istikrarlı hayvanlar.
   Not: yiyecek alımı stabilize kadar iştah son bir azalma sergiledi hayvanlar, özelliği olmamalıdır.
   1. olgun hayvanlar için (> 5-6 yıl), bedeni ay üst üste arasındaki ağırlıklar ilk maymun incelenmesi ve ağırlık dramatik değişim için metabolik durumunu değiştirmeden başka nedenler ekarte etmeden% 10'dan fazla farklılık hayvanları seçmeyin.
2. glukoz, insülin ve C-peptidleri içinde analitler, proteaz inhibitörü (Aprotinin ve DPP4I) K ₂ EDTA numune toplama tüpleri hazırlayın.
   Not: DPP4I + Aprotinin kokteyli proteaz inhibisyonu geniş spektrumlu bir sağlar, bu ek analitler (glukagon, GLP-1) için gerekli olmalıdır. Ek analitler toplanan olmadığını durumunda, kan tüpleri Numune alımında tutarlılığı korumak için aynı şekilde hazırlanmalıdır. Bu yöntem için doğrulanmamıştır tahliller için alınan örnekler üreticinin önerilerine göre, ayrı ayrı toplanmalıdır.
   1. DPP4I 10 ml Aprotinin, liyofilize 100 mg karıştırılarak proteaz inhibitör kokteyli hazırlanır. Toplanan kan, her mililitre için her kan tüpüne Aprotinin + DPP4I karışımı 10 ul ekle.
   2. olası tahsilat fazlalık her tüpe proteaz inhibitör kokteyli ilave 10 ul ekle. kullanılana kadar -20 ° C'de muamele kan tüpleri saklayın. procedu sırasında ıslak buz üzerinde tüpler tutunyeniden 4 ° C 'de dönel.
   3. Standart serum kimyası analiz için başlangıçta bir kan örneği toplamak için bir serum ayırıcı tüp kullanın. Tam kan sayımı (CBC) için, proteaz inhibitörleri olmadan standart K ₂ EDTA kullanın. kan örnekleri sonrasında kısım plazma ve serum kullanın cryovials aşağı bükülmüş edilmiştir.
   4. hayvan tanımlama, tarih, prosedür, timepoint ve örnek hacmi ile uygun kan tüpleri ve cryovials etiketleyin. Uygun deney için plazmada analiz (ler) ile birlikte cryovials etiketleyin.
3. normal tuzlu su içinde 250 ml'lik bir torbaya ml heparin 1.000 USP birim 0.15 ml enjekte ile heparinize edilmiş tuz akışı hazırlayın. 0.06 mg heparin / ml bir solüsyon elde edilir. örnekler arasında temizlenmesi için bir tuzlu su kilide Bu çözeltiye 60 ml - 40 çizin. sırasıyla infüzyon önce ve sonra dekstroz infüzyonu noktası yıkama için ayrı şırıngalar içine ilave 1 mL ve 5 mL çizin.

2.Hayvan Sedasyon ve Hazırlık

1. hayvanın kafesinden işlem öncesi en az 14 saat ve en fazla 18 saat yiyecek çıkarın.
   NOT: Bu hayvanların glisemik değerleri herhangi bir postprandial varyasyonu önlemek için prosedür için aç olması önemlidir. Ayrıca anestezi sırasında yetersizliği ve mide içeriğinin aspirasyonu önlemek için bir önlemdir.
2. Genel anestezik olarak kas içinden verilen ketamin ile IVGTT prosedür süresince oturaklı hayvanlar, 10 mg / kg. İşlem sırasında, gerektiğinde, 30 dakika ya da 20 - aralıklarla - (10 mg / kg ve 5), ek ketamin yönetme.
   1. sedasyon hayvan tartılır. ısıtılmış bir prosedür masaya yanal yatar pozisyonda hayvan yerleştirin.
   2. Hayvan anestezi istikrarlı bir düzlemde sağlamak için klinik parametrelerin her 15 ila 20 dakika izleyin. Bir pulse oksimetre ile - (200 bpm 100) ve DPT ₂ (>% 92) kalp hızını ölçün. (- 50 nefes / dk 20) ​​w solunum hızını ölçmek Bir kronometre i, görsel ya da on beş saniye boyunca elle solunumda sayarak ve dört ile çarpılarak. Tedbir sıcaklığı (> 97 ° F) rektal. sakız ve dudakların (nemli, pembe) etrafında mukoz membran rengini izleyin.
3. İki kanül siteleri hazırlayın. Kateter eklenecek ilgi alanından saç kesme ve alternatif klorheksidin scrubs ve% 70 alkol ile tüm bölgeyi sterilize etmek için saç makasları kullanın.
   1. Sol veya sağ sefalik veya safen venlerin bölgesinde bir kateter yerleştirilir ve üç yollu ile (mg heparin / ml 0.06) bir heparin tuzlu floş ekleyin. Bu örnekleme kan alımı sitesidir.
   2. Başka bir bacak ikinci kateter yerleştirin veya sefalik veya safen venlerin bölgede kol ve bir bağlantı noktası ekleyin. dekstroz infüzyon için bu siteyi kullanın. önce dekstroz infüzyon için kanül patent tutmak için, küçük heparinize salin 1 ml floş kullanın.

e_title "> 3. İVGTT Prosedürü

Not: IVGTT Prosedür 8 kan alımı numune zaman noktaları (Tablo 1) oluşur.

1. Bazal örneği alın ve açlık kan şekeri düzeyini ölçmek için bir el glukometre kullanın. hayvanın genel sağlığını değerlendirmek için bir CBC standart kimya analizi için bir serum numunesi, aynı zamanda, bütün bir kan örneği alın. Imalatçının talimatlarına ^{8, 9} uyarınca makaklarda kullanılmak için kabul edilmiş bir kit kullanılarak taban numuneden glikoz ve insülin seviyelerini analiz etmek için plazma numuneleri toplamak.
   Not: Bu, önceden kanülün ölü boşluk kalan kan veya heparin çıkarmak için kan toplanması için numune alma kanül alınan 0.5 ml'lik bir ön çekmesi önemlidir.
2. Bazal örnek alınmasını takiben, dekstroz infüzyonu portuna 30 saniye içinde% 50 dekstroz (250 mg / kg) infüzyonu.
   Not: yüksek doz modelleri (500 mg / kg), kullanılabilirgerçi doz uzunlamasına karşılaştırmalar yapmak amacıyla prosedürler arasında sabit olmalıdır.
   1. Limanda kalmadı dekstroz olduğundan emin olmak için heparinli serum fizyolojik 5 ml infüzyon portu yıkayın. infüzyon sonu T0 olduğunu. infüzyon arta kalan dekstroz sonraki kan örnekleri kontamine olabilir teknisyen, eldiven yerine var.
3. sonrası ilk infüzyon örnek zaman noktası T5 dakika T7 dakika, T10 dakika, T15 dakika, T20 min ardından dekstroz infüzyon sonunda, gelen, T3 dk ve son örnek zaman noktası T30 min yer almaktadır. Başlangıç ​​numunesi ile deney glikoz ve insülin düzeyleri her bir zaman noktasında plazmanın kazan (adım 3.1).
   1. zaman noktasında dk T3, bir kez daha kan şekeri seviyesini kontrol etmek için el glukometre kullanın.
      NOT: Başlangıçta Glucometer okumalar ve T3 dekstroz infüzyon onaylamak için sadece. zaman noktasında dk T3 kan glukoz düzeyi ~ 100 mg / dl daha yüksek eş olmalıdıraçlık bazal plazma glukoz düzeyine mpared.

4. Hayvan Kurtarma ve Örnek İşleme

1. kanüller çıkarın ve zaman noktası dk T30 sonra hemostaz için kateterize sitelere basınç uygulayın. o kendine geldi ve oturmuş kadar hayvan izleyin. hayvan kez Teklif besleme tamamen iyileşti edilir.
2. Hemen buz üzerine K _2, EDTA tüpleri içine her bir tam kan örneği yerleştirin. toplama, 10 dakika içinde 4 ° C arasındaki bir sıcaklıkta 3000 rpm'de santrifüj. analize kadar -80 ° C 'de cryovials, dondurulması ve depolanması içine kısım plazma numuneleri.
   1. Standart serum kimyası analizleri için serum tüpü içine, kan az 20 dakika ve oda sıcaklığında 3000 rpm'de santrifüjlemeden önce en fazla 30 dakika süreyle, oda sıcaklığında bekletin. toplama 48 saat içerisinde deneye tabi tutulana kadar, serum örnekleri dondurun.
      NOT: olarak kadar CBC analizi için toplanan buzdolabında tam kan örnekleritoplama 24 saat içinde sayed.

5. Veri Tedavisi

1. Plazma insülin ve glikoz eğrisi oluşturulması başlangıçta, ^{16, 17,} yukarıda glukoz değerleri için doğal log A eğiminden glukoz klirensi oranı K belirler.
   Not: Sağlıklı bir NSP sağlıklı hayvan genellikle 30 dakika içinde, başlangıç glukoz değerlerine geri döner olarak, genellikle daha büyük bir 2 veya daha fazla, iyi 1'in üzerinde bir glükoz klirensi oranı K olması beklenebilir. insülin üretimi devre dışı bırakır gibi, glikoz temizlenme oranı K 1'in altına düşen, daha önemli ölçüde düşecek.
2. T30 ^{16, 17} vasıtasıyla, zaman noktaları arasında, her çizgi parçasının eğri altında kalan alan temsil yamuk alanının toplamları toplamı olarak, bir bütün olarak AUC hesaplayın.
   Not: Geleneksel olarak, işlemin ilk on dakika AUC akut olarak kabul edilirprosedürün son 20 dk AUC geç insülin yanıtı (LIR) kabul edilir ise insülin cevabı e, (AIR) glukoz. Hayvan daha dismetabolik hale geldikçe, insülin AUC insülin duyarsızlığı artırmak için tazminat yansıtan artacaktır. Aşikar diyabet hayvan geçişleri gibi, ancak, AUC AIR tarafından yakalanan, akut insülin aşamasında genellikle başlangıçta, azalacaktır.

Sonuçlar

Şekil 1 'de gösterilen sonuçlar, bir 30 dakika IVGTT'nin boyunca, olgun, sağlıklı ve diyabetik sinomolgus makaklar tipik glükoz ve insülin eğrilerinin gösterim bulunmaktadır. Sağlıklı ve ilerlemiş diyabetik maymunlar elde edilen veriler metabolik karakterizasyonu aralığının her iki uç ucundan hayvanlar arasında belirgin farklılıklar kontrast için gösterilmiştir. Bu İVGTT protokol benzer sonuçlar ile rhesus makak yazarlar tarafından ba...

Tartışmalar

İVGTT tahlil itibaren, açlık kan şekeri ve insülin seviyesinin elde edilir. Vücut ağırlığı ^{5, 12, 13} dayalı tek bir dekstroz infüzyon ile glukoz ile uyarılmış insülin salınımı kapasitesini değerlendirir ve hayvanın kapasitesinin değerlendirilmesini sağlar insülin bırakın ve başlangıca doğru yükselmiş glukoz düzeyi döndürür. Bu normal bir glukoz ve insülin düzeyi, sağlıklı kontrol, Normogliseminin ile hiperinsülinemik dismetabolik hayvan veya bir hiperglisemik insülin...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allegra X-15R Centrifuge			plasma: 4C @3000 rpm for 10 min
Sorvall ST16R Centrifuge			serum: 22C @3000 rpm for 10 min
Thermo Scientific -86C Freezer, Forma 88000 Series		Model: 88500A
Dextrose 50% (D50)	Webster	07-8008986	I.V. glucose infusate
3mL Luer Lock Syringe	Midwest Veterinary Suppy		serial blood draws
5ml Luer Lock Syringe	Midwest Veterinary Suppy		heparinized saline flush
10mL Luer Lock Syringe	Midwest Veterinary Suppy		delivery of I.V. D50
Gauze sponges 2x2	Midwest Veterinary Suppy	366.23000.4	Used Dry, w/ %70 Alcohol, and 2% Chlorohex Solution
4 ml serum separator tubes	Midwest Veterinary Supply	366.45000.4	blood collection tube for superchem panel
K2EDTA, 2mL	VWR	95057-239	blood collection tubes
Aprotinin, 100mg	Sigma	A1153-100MG	blood collection tube protease additive
22g x 1" Catheters	Midwest Veterinary Suppy	193.75250.2	I.V. catheter
Injection Plug W/ Cap	Midwest Veterinary Suppy	001.11500.2	%50 dextrose infusion port
Porus Tape, 1/2" x 10yd	Midwest Veterinary Suppy	001.85000.2	maintain adherance of catheters and hep. Locks
Chlorhexidine Solution 2%	Midwest Veterinary Suppy	193.08855.3	prep catheter site
70% Ethanol	VWR	71001-654	prep catheter site
tourniquet	Webster	07-8003432
3 way stopcock	Midwest Veterinary Supply	366.28510.4	hep. lock
37" extension set	Webster	07-8454200	hep. lock
Exel 50-60cc LL Syringes	Midwest Veterinary Suppy	001.12250.2	Heparinized saline flush
250 ml bag 0.9% saline	Webster	07-8365593	flush
1,000 U Heparin, 10 ml	Webster	07-883-4916
Ketamine, (Ketaset) 100mg/mL	Fort Dodge	(AV ordered)
Precision Xtra glucose test strips 50/bx	Abbott (American Diabetes Wholesale)	9381599728K7	test baseline/ T3 blood glucose levels
Masimo Rad 57	DRE	6052057V	pulse-oximeter
Pavia rectal thermometer	Patterson	07-8391335
Precision Xtra Glucometer	Abbott	9381599728K7	Handheld glucometer