Charakterisierung von metabolischen Status in nicht-menschlichen Primaten mit der intravenösen Glukosetoleranztest

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist ein Standardverfahren zu präsentieren intravenösen Glukosetoleranztests (IVGTTs) zur Durchführung der glykämischen Kontrolle bei nicht-menschlichen Primaten zu bewerten und zu beurteilen, ihre metabolischen Status von gesunden zu dysmetabolische.

Zusammenfassung

Die intravenöse Glukosetoleranztest (IVGTT) spielt eine wichtige Rolle bei der Charakterisierung von Glukose-Homöostase. Zusammengenommen mit Serum biochemische Profile einschließlich der Blutglucosespiegel sowohl im fed und nüchternen Zustand, HbA1c, Insulinspiegel, der klinischen Geschichte der Ernährung, der Körperzusammensetzung und des Körpergewichts-Status, eine Beurteilung normaler und abnormaler glykämische Kontrolle vorgenommen werden können . Interpretation eines IVGTT durch Messung von Veränderungen in Glukose- und Insulinspiegel über die Zeit in Bezug auf die Dextrose Herausforderung getan. Kritische Komponenten berücksichtigt werden , sind: peak Glucose- und Insulinspiegel in Bezug auf T0 (Ende der Glukoseinfusion) erreicht hat , die Glucose - Clearance - Rate K aus der Steigung abgeleitet von schnellen Glukose - Clearance in den ersten 20 min (T1 bis T20), der Zeit , zu Glukose Basis zurückzukehren, und die Fläche unter der Kurve (AUC). Diese werden IVGTT Maßnahmen charakteristische Veränderungen wie Glukose - Homöostase bewegt sich von einem gesunden t zeigenoa erkrankten metabolischen Zustand ^5. Hier werden wir die Charakterisierung von nicht-menschlichen Primaten (Rhesus und Cynomolgus-Makaken) beschreiben, die die relevantesten Tiermodell der Typ-II-Diabetes (T2D) beim Menschen und die IVGTT und klinische Profile dieser Tiere von einem mageren gesund, zu fettleibig dysmetabolische sind, und T2D Zustand ^{8, 10, 11.}

Einleitung

Die IVGTT ist eine bequeme funktionellen Assay, der routinemßig eingesetzt wird , um die β-Zellfunktion beim Menschen bei verschiedenen metabolischen Zuständen ^{5, 7} zu bestimmen. In Tiermodellen von T2D ist es gut als Werkzeug erkannt Tiere zu kennzeichnen , die von metabolischen Krankheitsprogression zeigen eine gesunde zu einem dysmetabolische hyperglykämischen Zustand ^{8, 9.} Das nächstgelegene Tiermodell der T2D ist in nicht - menschlichen Primaten (NHP) gezeigt, von denen Rhesus und Cynomolgus - Makaken bemerkenswerte Beispiele sind. Diese Tiere entwickeln natürlich T2D mit den gleichen Risikofaktoren von Alter und Adipositas beitragen zu seiner Häufigkeit als beim Menschen ^10. Darüber hinaus gibt es eine ähnliche Krankheitsprogression und Bauchspeicheldrüsen Pathologie Amyloidablagerungen zeigt wie die dysmetabolischen Krankheit ¹¹ fortschreitet.

Wir berichten hier über unsere Standard-Verfahren zur Herstellung eines IVGTT in NHPs als Teil unserer Kolonie Charakterisierung von metabolischen Status bei diesen Tieren durchführen. Diese Methode istleicht im Vergleich zu anderen, mehr Zeit auszuführen raubend und kostspielig Techniken ^2. Die IVGTT ist nützlich für eine große Kolonie von Tieren schnell und häufig zu charakterisieren. Wenn in Betracht mit dem Niveau von glykiertem Hämoglobin (HbA1C) genommen, der Nahrung des Tieres und die Nahrungsaufnahme Geschichte, sowie deren Prozent Muskelmasse und Körperfett ist die IVGTT normalerweise ausreichend für die Charakterisierung von ⁶ eines Tieres metabolischen Status und Fortschritt zu manifester Diabetes ^8.

HbA1C stellt den durchschnittlichen glykämischen Ebene über die Lebensdauer der roten Blutkörperchen, eine zuverlässige Messung der Glucosespiegel im Laufe der letzten sechs Wochen bis drei Monate bietet. Wenn von der nüchternen Basis Blutprobe des IVGTT gemessen, stellt dieser Wert ein Fenster in die glykämische Kontrolle in den Monaten zwischen Prozeduren. Wenn das Tier von dysmetabolische transitioned hat seit ihrem letzten IVGTT, ein HbA1c-Wert viel höher als ihre vorherigen Wert diabetischen würde bedeuten,dass der Übergang bald nach ihrem letzten IVGTT begann, während ein HbA1c-Wert näher an ihren bisherigen Wert anzeigen würde, dass sie erst vor kurzem umgestellt haben. In der Regel in Rhesus - Makaken, Werte HbA1C von mehr als 6% anormal sind, und deuten auf eine schlechte Blutzuckerkontrolle ^{10, 23.}

Glykämischen Niveaus sollten im Rahmen des Verhaltens und der allgemeinen Gesundheit des Tieres als Ganzes interpretiert werden. Diabetische Makaken - wie Menschen - Ausstellung hyperphagia, Polydipsie und Polyurie. Gruppenhaltung der Tiere bietet erhebliche Herausforderungen für die Messung dieser Indikatoren und die individuelle Betreuung, die für dysmetabolische und diabetischen Affen. Wir empfehlen , das Gehäuse einzeln die Tiere , damit mehr persönliche Betreuung zur Verfügung gestellt werden können, und Verhaltensmarker für die Gesundheit des Affen leichter ⁸ überwacht werden. Darüber hinaus wird diabetischen Makaken Gewichtsverlust aufweisen, sowie eine erhöhte Lipidprofil (erhöhteCholesterin, Hypertriglyceridämie) und gestörten Mineralstoffwechsel in Serumchemie. Es ist wichtig , Marker der Leber- und Nierenfunktion in Serumchemie zu messen, wie Schädigung dieser Organe sind oft von Komplikationen Stoffwechselstörung / Diabetes Vorschieben und kann zusammen Determinanten von glykämischen, Lipid- und Mineral Unwuchten ^{9, 11, 18, 24} sein , .

Bei Verwendung dieser Methode, erzeugt die historischen Werte aus mehreren, häufige Charakterisierungen über das Leben eines Affen von besonderem Wert sind. Wenn andere Verfahren, wie zum Beispiel eine Glucose-Clamp oder abgestuft Glukoseinfusion (GGI), werden benötigt, um vollständig ein Tiergesundheit beurteilen zu können, ist es häufig bei der anfänglichen Charakterisierung, wenn ihre Geschichte nicht verfügbar ist. Sobald jedoch eine Basislinie, wiederholt IVGTTs einer Frequenz alle drei Monate festgestellt worden sind normalerweise ausreichend, eines Tieres Fortschritt zu verfolgen. Dies ist besonders wichtig, wenn die Tiere in mehreren Studien über einen eingeschrieben sindKalenderjahr auf der Grundlage ihrer metabolischen Status. Während ihre Gesundheit seit Jahren zu einer Zeit relativ stabil bleiben, wenn die Stoffwechsellage eines Tieres verschlechtert, kann eine drastische Zunahme der Insulinresistenz und Glukoseintoleranz sehr schnell erfolgen. HbA1c-Werte ermöglichen eine gewisse Interpolation des Rückgangs oder Verbesserung des Gesundheitszustandes des Tieres zwischen Prozeduren Abstand von drei Monaten geplant. Aus diesem Grund ist dieses Verfahren ideal für Tiere verwendet in mehrfachen, longitudinalen Studien über den Verlauf ihrer natürlichen Lebensdauer charakterisieren.

Protokoll

Alle Tierverfahren des David H. Murdock Research Institute IACUC auf dem North Carolina Research Campus (NCRC) gelegen genehmigt wurden, unter Protokoll 14-017, Charakterisierung eines nicht-menschlichen Primatenmodell von Diabetes und Prädiabetes / Insulin-Resistenz und Wirksamkeit von Therapeutika zu verbessern Insulinempfindlichkeit und metabolischen Funktion.

1. Tierauswahl und Studienvorbereitung

1. Wählen Sie Ernährung und Gewicht stabil Tiere auf Basis von monatlichen Nahrungsaufnahme und das Körpergewicht Aufzeichnungen.
   HINWEIS: Tiere, die eine jüngste Rückgang der Appetit gezeigt haben, sollte nicht gekennzeichnet werden, bis ihre Nahrungsaufnahme stabilisiert hat.
   1. Für die reife Tiere (> 5 - 6 Jahre), wählen Sie nicht Tiere, deren Körpergewicht zwischen aufeinander folgenden Monaten um mehr als 10%, ohne zuerst den Affen untersuchen und Ausschluss anderer Ursachen als eine Änderung metabolischen Status für die dramatische Gewichtsänderung.
2. Für Glukose, Insulin und C-Peptide Analyten, bereiten K ₂ EDTA Probenröhrchen mit Protease - Inhibitor (Aprotinin und DPP4I).
   HINWEIS: Die DPP4I + Aprotinin Cocktail bietet ein breites Spektrum an Proteaseinhibition sollte diese zusätzliche Analyten (Glucagon, GLP-1) erforderlich. In dem Fall, dass zusätzliche Analyten nicht gesammelt werden, sollten die Blutröhrchen in der gleichen Weise hergestellt werden Konsistenz in Probensammlung zu halten. Die Proben für die Tests nicht für diese Methode validiert werden separat gesammelt werden, entsprechend den Empfehlungen des Herstellers.
   1. Bereiten Sie die Protease-Inhibitor-Cocktail durch Mischen von 100 mg lyophilisiertes Aprotinin mit 10 ml DPP4I. Fügen Sie 10 & mgr; l des Aprotinin + DPP4I Mischung auf jedem Blutröhrchen für jeden Milliliter Blut gesammelt.
   2. Fügen Sie weitere 10 & mgr; l der Protease-Inhibitor-Cocktail in jedes Röhrchen für mögliche Sammlung overage. Lagern Sie die behandelten Blutröhrchen bei -20 ° C bis zur Verwendung. Halten Sie die Rohre auf nassem Eis während der procedure und Spin bei 4 ° C.
   3. Verwenden Sie ein Serumtrennrohr eine Blutprobe zu Beginn der Studie für Standard-Serumchemie-Analyse zu sammeln. Für die Blutbild (CBC), mit einem Standard - K ₂ EDTA ohne Proteaseinhibitoren. Verwenden Kryovials zu aliquoten Plasma und Serum nach den Blutproben wurden zentrifugiert.
   4. Beschriften Sie die Blutröhrchen und die Kryovials geeigneter Weise mit dem Tieridentifikation, Datum, Verfahren, Zeitpunkt und Probenvolumen. Beschriften Sie die Kryoröhrchen mit dem Analyten (s) im Plasma nach geeigneten Assays.
3. Bereiten Sie die heparinisierte Kochsalzspülung von 0,15 ml von 1.000 USP-Einheiten pro ml Heparin in einen 250 ml Beutel mit physiologischer Kochsalzlösung injiziert wird. Besorgen Sie sich eine Lösung von 0,06 mg Heparin / ml. Zeichne 40-60 ml dieser Lösung in einer Salzsperre für zwischen den Proben zu spülen. Zeichne eine zusätzliche 1 ml und 5 ml in separate Spritzen zur Spülung des Dextrose-Infusionsöffnung vor und nach der Infusion auf.

2.Tier Sedation und Vorbereitung

1. Entfernen Sie Lebensmittel aus dem Käfig des Tieres nicht weniger als 14 Stunden vor dem Eingriff, und nicht mehr als 18 Stunden.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Tiere für das Verfahren jede postprandialen Variation der glykämischen Werte zu vermeiden gefastet werden. Es ist auch eine Vorkehrung Regurgitation und Aspiration von Mageninhalt zu vermeiden, während anästhesiert.
2. Sedate Tiere für die Dauer des Verfahrens IVGTT mit Ketamin intramuskulär als allgemeine Betäubung gegeben, bei 10 mg / kg. Administrieren zusätzliche Ketamin (5-10 mg / kg) im Abstand von 20 - 30 min, oder nach Bedarf, während des Verfahrens.
   1. Wiegen Sie die sedierten Tier. Legen Sie das Tier in eine seitlich liegende Position auf einem beheizten Verfahren Tisch.
   2. Überwachen der klinischen Parameter alle 15 bis 20 Minuten das Tier, um sicherzustellen, in einer stabilen Ebene der Anästhesie ist. Messen Sie die Herzfrequenz (100-200 bpm) und SPO ₂ (> 92%) mit einem Pulsoximeter. Messen Sie die Atemfrequenz (20 bis 50 Atemzüge / min) w ith einer Stoppuhr, Zählen respirations visuell oder mit der Hand über 15 Sekunden multipliziert mit vier. Temperatur messen (> 97 ° F) rektal. Überwachen Sie die Farbe der Schleimhaut um das Zahnfleisch und Lippen (feucht, pink).
3. Bereiten Sie zwei Kanüle Standorten. Verwenden Sie Haarschneider die Haare aus dem Bereich von Interesse zu trimmen, wo der Katheter eingeführt wird, und zu sterilisieren, die gesamte Region mit abwechselnden scheuert von Chlorhexidin und 70% Alkohol.
   1. Setzen Sie einen Katheter in den Bereich der linken oder rechten cephalica oder Saphenavenen und verbinden Sie es mit einer Heparin Kochsalzlçsung (0,06 mg Heparin / ml) mit einem Dreiwegehahn. Dies ist die Probenahme Blutentnahme Ort.
   2. Legen Sie die zweite Katheter in einem anderen Bein oder Arm im Bereich der cephalica oder Saphenavenen und einen Port anschließen. Verwenden Sie diese Seite für die Dextrose-Infusion. Verwenden Sie einen kleinen, 1 ml Spülung von heparinisierter Kochsalzlösung, die Kanüle Patent vor Dextrose Infusion zu halten.

e_title "> 3. IVGTT Verfahren

HINWEIS: Die IVGTT Prozedur besteht aus 8 Blutentnahme Abtast - Zeitpunkte (Tabelle 1).

1. Nehmen Sie die Basisprobe und die Verwendung einer Hand gehalten glucometer die Nüchtern-Blutzuckerspiegel zu messen. Besorgen Sie sich eine Serumprobe für Standard-Chemie-Analyse, sowie eine Vollblutprobe für eine CBC, um die allgemeine Gesundheit des Tieres zu beurteilen. Sammeln Plasmaproben Glucose- und Insulinspiegel zu testen , von der Basisprobe ein Kit zur Verwendung mit Makaken gemäß den Anweisungen des Herstellers ^{8, 9} validiert werden.
   HINWEIS: Es ist wichtig, eine Pre-Unentschieden von 0,5 ml aus der Kanüle zu vor genommen zu haben, jede Probe für die Blutentnahme unter Restblut oder Heparin in den Totraum der Kanüle zu entfernen.
2. Nachdem die Basisprobe zu erhalten, die Dosis von 50% Dextrose (250 mg / kg) über 30 sec in die Dextrose Infusionsöffnung infundieren.
   HINWEIS: Die höhere Dosis Modelle (500 mg / kg) verwendet werden,obwohl die Dosis sollte über Verfahren zu machen, um Längsvergleiche fixiert werden.
   1. Spülen Sie den Infusionsanschluss mit 5 ml heparinisierter Kochsalzlösung, um sicherzustellen, dass es keine Dextrose im Hafen links ist. Das Ende der Infusion ist die T0. Haben die Techniker die Handschuhe zu ersetzen, als Rest Traubenzucker aus der Infusions nachfolgende Blutproben verunreinigen können.
3. Die erste nach der Infusion Abtastzeit Punkt bei T3 min, von dem Ende des Dextrose-Infusion, gefolgt von T5 min, T7 min, T10 min, T15 min, T20 min, und der letzte Abtastwert Zeitpunkt ist bei T30 min. Sammeln von Plasma aus jedem Zeitpunkt zu Test Glukose und Insulinspiegel mit der Basisprobe (siehe Schritt 3.1).
   1. Am T3 min Zeitpunkt, verwenden Sie die Hand glucometer erneut, um den Blutzuckerspiegel überprüfen.
      HINWEIS: Die glucometer Lesungen zu Beginn der Studie und T3 sind nur die Infusion der Dextrose zu bestätigen. Der Blutzuckerspiegel an der T3 min Zeitpunkt sollte ~ 100 mg / dl höher co seinzum Fasten Basisplasmaglukosespiegel mpared.

4. Tierrettung und Probenbearbeitung

1. Entfernen Sie die Kanülen und Druck auf die katheterisierte Stellen für Hämostase nach dem T30 min Zeitpunkt. Überwachen Sie das Tier, bis er das Bewusstsein wiedererlangt hat und sitzt. Angebot Futtermittel, sobald das Tier vollständig erholt.
2. Unmittelbar danach ist jede Vollblutprobe in K ₂ EDTA - Röhrchen auf Eis. Zentrifuge bei 3000 Umdrehungen pro Minute bei einer Temperatur von 4 ° C innerhalb von 10 Minuten der Sammlung. Aliquotieren Plasmaproben in Kryoröhrchen, einfrieren und bei -80 ° C bis zur Analyse.
   1. Ermöglichen es dem Blut in das Serum Rohr für Standardserumchemie-Analyse bei Raumtemperatur für nicht weniger als 20 min und nicht mehr als 30 min vor der Zentrifugation bei 3000 Upm bei RT zu sitzen. Frieren Sie die Serumproben, bis innerhalb von 48 Stunden der Entnahme untersucht.
      HINWEIS: Gekühlt Vollblut für CBC-Analyse gesammelt, bis alsinnerhalb von 24 Stunden von Sammlung Sayed.

5. Datenbehandlung

1. Die Plasmainsulin und Glukosekurven Nach dem Aufbau, bestimmen die Glukose - Clearance - Rate K aus der Steigung des natürlichen Logarithmus der Glukosewerte über die Basislinie ^{16, 17.}
   HINWEIS: Eine gesunde NHP kann über 1 eine Glukose - Clearance - Rate K gut zu haben , erwarten, oft größer als 2 oder mehr, als ein gesundes Tier oft auf ihre Basisglukosewerte innerhalb von 30 Minuten zurück. Als Insulinproduktion abfällt, wird die Glukose-Clearance-Rate K mehr drastisch sinken, unter 1 fallen.
2. Berechne die AUC als Ganzes, als die Summe der Summen der Fläche der Trapeze die Fläche unter der Kurve jedes Liniensegments zwischen den Zeitpunkten repräsentiert, durch T30 ^{16, 17.}
   HINWEIS: Traditionell ist die AUC von den ersten zehn Minuten des Verfahrens gilt die acute Insulinantwort auf Glucose (AIR), während die AUC von den letzten 20 min des Verfahrens der späte Insulinreaktion angesehen wird (LIR). Da das Tier mehr dysmetabolische wird, wird das Insulin AUC erhöhen, Kompensation reflektieren Insulinunempfindlichkeit zu erhöhen. Da die Tierübergänge zu manifester Diabetes, jedoch nimmt die AUC, die oft zunächst in der akuten Phase Insulin durch die AIR erfasst.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt sind demonstrative typischer Glukose und Insulin - Kurven aus reifen, gesunden und diabetischen Cynomolgus - Makaken im Laufe von 30 min IVGTT. Daten von gesunden und fortgeschrittener diabetischer Affen gezeigt, um die offensichtlichen Unterschiede zwischen den Tieren aus den beiden äußersten Enden des Bereichs der metabolischen Charakterisierung zu kontrastieren. Dieses IVGTT Protokoll wurde in Rhesus-Makaken mit ähnlic...

Diskussion

Die IVGTT bewertet die Fähigkeit von Glukose-stimulierte Freisetzung von Insulin durch eine einzige Dextrose Infusion basierend auf dem Körpergewicht ^{5, 12, 13.} Aus dem Test, der Nüchternblutzucker und Insulinspiegel erreicht wird , und es ermöglicht eine Beurteilung der Fähigkeit des Tieres Release Insulin und gibt die erhöhte Glukosespiegel zu den Ausgangswerten. Dies bietet dem Benutzer Informationen das Tier als eine normale Glucose und Insulinspiegel gesunden Kontrolle wurde ein hyperinsulinemic dy...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allegra X-15R Centrifuge			plasma: 4C @3000 rpm for 10 min
Sorvall ST16R Centrifuge			serum: 22C @3000 rpm for 10 min
Thermo Scientific -86C Freezer, Forma 88000 Series		Model: 88500A
Dextrose 50% (D50)	Webster	07-8008986	I.V. glucose infusate
3mL Luer Lock Syringe	Midwest Veterinary Suppy		serial blood draws
5ml Luer Lock Syringe	Midwest Veterinary Suppy		heparinized saline flush
10mL Luer Lock Syringe	Midwest Veterinary Suppy		delivery of I.V. D50
Gauze sponges 2x2	Midwest Veterinary Suppy	366.23000.4	Used Dry, w/ %70 Alcohol, and 2% Chlorohex Solution
4 ml serum separator tubes	Midwest Veterinary Supply	366.45000.4	blood collection tube for superchem panel
K2EDTA, 2mL	VWR	95057-239	blood collection tubes
Aprotinin, 100mg	Sigma	A1153-100MG	blood collection tube protease additive
22g x 1" Catheters	Midwest Veterinary Suppy	193.75250.2	I.V. catheter
Injection Plug W/ Cap	Midwest Veterinary Suppy	001.11500.2	%50 dextrose infusion port
Porus Tape, 1/2" x 10yd	Midwest Veterinary Suppy	001.85000.2	maintain adherance of catheters and hep. Locks
Chlorhexidine Solution 2%	Midwest Veterinary Suppy	193.08855.3	prep catheter site
70% Ethanol	VWR	71001-654	prep catheter site
tourniquet	Webster	07-8003432
3 way stopcock	Midwest Veterinary Supply	366.28510.4	hep. lock
37" extension set	Webster	07-8454200	hep. lock
Exel 50-60cc LL Syringes	Midwest Veterinary Suppy	001.12250.2	Heparinized saline flush
250 ml bag 0.9% saline	Webster	07-8365593	flush
1,000 U Heparin, 10 ml	Webster	07-883-4916
Ketamine, (Ketaset) 100mg/mL	Fort Dodge	(AV ordered)
Precision Xtra glucose test strips 50/bx	Abbott (American Diabetes Wholesale)	9381599728K7	test baseline/ T3 blood glucose levels
Masimo Rad 57	DRE	6052057V	pulse-oximeter
Pavia rectal thermometer	Patterson	07-8391335
Precision Xtra Glucometer	Abbott	9381599728K7	Handheld glucometer