Характеристика метаболического статуса в приматах с тест на толерантность к глюкозе Внутривенное

Резюме

Целью данного протокола является представить стандартный метод для выполнения внутривенных тестов на толерантность к глюкозе (IVGTTs) для оценки гликемического контроля в приматах и ​​оценить их метаболического статуса от здоровых до дисметаболического.

Аннотация

Тест на толерантность к глюкозе для внутривенного введения (ВТТГ) играет ключевую роль в характеристике гомеостаза глюкозы. Когда вместе с сывороточных биохимических профилей, включая уровень глюкозы в крови в обоих кормили и голодном состоянии, HbA1c, уровень инсулина, клинической истории диеты, состава тела и состояния массы тела, оценку нормального и аномального гликемического контроля может быть сделано , Интерпретация ВТТГ осуществляется путем измерения изменений уровня глюкозы и инсулина в течение долгого времени по отношению к декстрозы вызов. Критические компоненты , которые необходимо учитывать , являются: пиковые уровни глюкозы и инсулина достигли по отношению к Т0 (конец глюкозы инфузии), клиренс глюкозы K происходит от наклона быстрый клиренс глюкозы в первые 20 мин ( от Т1 до Т20), время вернуться к глюкозе базовой линии, а площадь под кривой (AUC). Эти меры ВТТГ покажут характерные изменения как гомеостаз глюкозы перемещается от здорового тоа больное метаболическое состояние ^5. Здесь мы опишем характеристику приматах (макак и яванских макак), которые являются наиболее актуальными животной моделью диабета II типа (T2D) в организме человека и ВТТГ и клинические профили этих животных из тощий здоровым, ожирением дисметаболического, и T2D состояние ^{8, 10, 11.}

Введение

ВТТГ является удобным функциональный анализ , который обычно используется для определения функции β-клеток в организме человека при различных метаболических состояниях ^{5, 7.} В экспериментах на животных моделях СД2, она хорошо известна в качестве инструмента для характеристики животных , которые показывают прогрессирование болезни обмена веществ из здоровый к дисметаболического гипергликемии ^{8, 9.} ближайшим животная модель СД2 показана в приматах (NHPs), из которых макаки и циномолгус макаки являются яркими примерами. Эти животные естественным образом развиваются СД2 с теми же факторами риска возраста и ожирения , способствующего его падения , как у людей ^10. Кроме того, существует прогрессию тем же заболеванием и панкреатический патология , показывающая отложения амилоида , как болезнь прогрессирует дисметаболического ^11.

Здесь мы сообщаем о нашем стандартном способе выполнения ВТТГ в NHPs как часть нашей колонии характеристики метаболического статуса у этих животных. Этот методлегко выполнить по отношению к другим, более отнимает много времени и дорогостоящих методов ^2. ВТТГ полезен для характеристики большой колонии животных быстро и часто. Когда принимается во внимание с уровнем гликированного гемоглобина (HbA1c), история диеты и потребление продуктов питания животного, а также их процент мышечной массы и жира тела, то ВТТГ обычно достаточно для характеристики метаболического статуса животного и прогрессии к откровенного диабета ^{6 , 8.}

HbA1C представляет собой средний уровень гликемии в течение жизни красных кровяных клеток, обеспечивая надежное измерение уровня глюкозы в течение предыдущих шести недель до трех месяцев. При измерении от голодном образца базовой линии крови ВТТГ, это значение обеспечивает окно в гликемический контроль в течение месяца между процедурами. Если животное переходил от дисметаболического к диабетическим с момента их последней ВТТГ, значение HbA1C намного выше, чем их предыдущее значение будет указыватьчто переход начался вскоре после их последнего ВТТГ, в то время, значение HbA1C ближе к их предыдущему значению будет означать, что они только недавно перешли. В общем, в макак - резусов, HbA1C значения больше 6% считаются ненормальным, и указывают на бедных гликемический контроль ^{10, 23.}

Гликемический уровни должны интерпретироваться в контексте поведения и общего состояния здоровья животного в целом. Диабетические макаки - как люди - выставочная гиперфагия, полидипсия и полиурия. Группа корпус животных обеспечивает значительные проблемы для измерения этих показателей и индивидуального ухода, необходимых для дисметаболического и диабетических обезьян. Мы рекомендуем одиночно жилье животных в целях , которые могут быть предоставлены более персонализированный уход, и поведенческие маркеры здоровья обезьяны более легко контролировать ^8. Кроме того, диабетические макаки будет проявлять потерю веса, а также повышенный липидный профиль (повышениехолестерина, гипертриглицеридемия) и нарушения минерального обмена в сыворотке крови химии. Важно , чтобы измерить маркеры функции печени и почек в сыворотке крови химии, так как повреждение этих органов часто сопровождаются осложнениями опережения нарушением обмена веществ / сахарный диабет, и могут быть совместно детерминанты гликемии, липидов и минеральных дисбалансов ^{9, 11, 18, 24} ,

При использовании этого метода, исторические ценности, полученные от нескольких, часто характеризации над жизнью обезьяны имеют особую ценность. Если другие процедуры, такие как зажим глюкозы или градуированного инфузии глюкозы (ГГИ), которые необходимы для полной оценки здоровья животного, то обычно при первоначальной характеристике, когда их история недоступна. Однако, как только базовая линия была установлена, повторяющиеся IVGTTs от частотой каждые три месяца, как правило, достаточно, чтобы отслеживать прогресс животного. Это особенно важно, когда животные обучаются на несколько исследований по всему объемукалендарный год на основе их метаболического статуса. В то время как их здоровье может оставаться относительно стабильными в течение многих лет в то время, когда метаболический статус животного ухудшается, резкое увеличение резистентности к инсулину и нарушение толерантности к глюкозе может происходить очень быстро. Значения HbA1c позволяют некоторой интерполяции снижения или улучшения состояния здоровья животного между процедурами запланированных трех месяцев друг от друга. По этой причине этот способ идеально подходит для характеристики животных, используемых в нескольких продольных исследованиях в течение их естественной продолжительности жизни.

протокол

Все процедуры на животных были одобрены Дэвид Х. Мердок научно-исследовательский институт IACUC, расположенный на North Carolina Research Campus (НКРС), по протоколу 14-017, характеристика нечеловеческого примата модели диабета и преддиабета / резистентности к инсулину и эффективности терапии для улучшения чувствительность к инсулину и метаболические функции.

1. Отбор животных и исследование Подготовка

1. Выбор диеты и вес стабильных животных на основе ежемесячных потребление пищи и веса тела записей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, которые экспонируются недавнее снижение аппетита не должно быть охарактеризовано, пока их потребление пищи не стабилизируется.
   1. Для взрослых животных (> 5 - 6 лет), не выбирайте животных, чьи тела веса между последовательными месяцев отличаться более чем на 10% без предварительного изучения обезьян и исключения других, чем изменение метаболического статуса для резкого изменения веса причин.
2. Для получения глюкозы, инсулина и С-peptiде аналитов, готовят K ₂ ЭДТА пробирки для взятия проб с ингибитором протеазы (апротинина и DPP4I).
   Примечание: Коктейль DPP4I + Апротинин обеспечивает широкий спектр ингибирования протеазы если это требуется для дополнительных аналитов (глюкагона, GLP-1). В случае, когда дополнительные аналитов не собраны, пробирки крови должны быть подготовлены таким же образом, чтобы поддерживать согласованность сбора проб. Образцы для анализов не утвержденных для этого метода следует собирать отдельно, в соответствии с рекомендациями производителя.
   1. Приготовьте коктейль ингибиторов протеаз путем смешивания 100 мг лиофилизованных Апротинин с 10 мл DPP4I. Добавляют 10 мкл смеси апротинина + DPP4I в каждую пробирку крови для каждого миллилитр крови, собранной.
   2. Добавить еще 10 мкл ингибитора протеаз в каждую пробирку для возможного великовозрастных сбора. Хранить пробирки обрабатывают кровь при -20 ° С до использования. Держите трубки на мокром льду во время процедуры, применяемыевновь и спина при 4 ° С.
   3. Используйте сыворотку разделительную трубку, чтобы собрать пробы крови на исходном уровне для стандартного химического анализа сыворотки. Для полного анализа клеток крови (CBC), используют стандартную K ₂ EDTA без ингибиторов протеазы. Используйте криопробирки к аликвоты плазмы и сыворотки после образцов крови были откручивали.
   4. Пометьте пробирки крови и криопробирки надлежащим образом с идентификацией животных, даты, процедуры временной точки, и объема образца. Этикетка криопробирки с анализируемым веществом (ами) в плазме для соответствующего анализа.
3. Готовят гепаринизированной соленых флеш путем введения 0,15 мл 1000 USP единиц на мл гепарина в 250 мл мешок нормального физиологического раствора с. Получают раствор 0,06 мг / мл гепарина. Draw 40 - 60 мл этого раствора в солевом замком для смыва между образцами. Draw дополнительно 1 мл и 5 мл в отдельные шприцы для промывки декстрозы для инфузии порта до и после инфузии, соответственно.

2.Седативный животных и подготовка

1. Удалите пищу из клетки животного не менее 14 часов перед процедурой и не более 18 часов.
   Примечание: Важно, чтобы животные быть голодали в течение процедуры, чтобы избежать каких-либо постпрандиальной вариации гликемии значений. Он также является мерой предосторожности, чтобы избежать регургитации и аспирации содержимого желудка в то время как под наркозом.
2. Уравновешенных животных во время процедуры ВТТГ с кетамина внутримышечно в качестве общего наркоза, в дозе 10 мг / кг. Администрировать дополнительные кетамин (5 - 10 мг / кг) с интервалом 20 - 30 мин, или по мере необходимости, во время процедуры.
   1. Взвесьте успокоительное животное. Поместите животное в лежачем положении в боковом направлении на процедуре стол с подогревом.
   2. Монитор клинических параметров каждые 15 до 20 минут, чтобы убедиться, что животное находится в стабильной плоскости анестезии. Измерьте частоту сердечных сокращений (100 - 200 уд) и SPO ₂ (> 92%) с пульсоксиметр. Измерьте частоту дыхания (20 - 50 вдохов / мин) W Ith секундомером, отсчитывая дыханий визуально или вручную в течение пятнадцати секунд и умножить на четыре. Измерение температуры (> 97 ° F) ректально. Монитор цвет слизистой оболочки вокруг десен и губ (влажная, розовая).
3. Приготовьте два канюли сайтов. Используйте машинки для стрижки волос, чтобы обрезать волосы из интересующей области, где будет вставлен катетер, и стерилизовать весь регион с чередующимися скрабы хлоргексидина и 70% спирта.
   1. Поместите один катетер в области левого или правого головное или подкожных вен и прикрепить его к гепарин соленых флеш (0,06 мг гепарина / мл) с трехходовым запорным краном. Это забор крови сайт выборки.
   2. Поместите второй катетер в другой ноге или руке в области головных или подкожных вен и прикрепить порт. Используйте этот сайт для декстрозы инфузии. Используйте небольшой, 1 мл вровень гепаринизированной физиологического раствора, чтобы держать патент канюли до декстрозы инфузии.

e_title "> 3. Процедура ВТТГ

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура ВТТГ состоит из 8 взятия проб крови Жеребьевка моменты времени (таблица 1).

1. Возьмите базовый образец и использовать ручные глюкометр для измерения уровня глюкозы в крови натощак. Получить образец сыворотки для стандартного химического анализа, а также пробы цельной крови для анализа крови для оценки общего состояния здоровья животного. Сбор образцов плазмы для анализа глюкозы и инсулина в крови от базового образца с использованием набора проверенную для использования с макак в соответствии с инструкциями изготовителя ^{8, 9.}
   Примечание: Важно иметь заранее жеребьевку 0,5 мл, взятых из канюли до принятия любого образца для сбора крови, чтобы удалить остатки крови или гепарином в мертвом пространстве канюли.
2. После получения базового образца, влить в дозе 50% раствора декстрозы (250 мг / кг) в течение 30 сек в декстроза инфузионной порт.
   Примечание: модели с более высокой дозе (500 мг / кг) может быть использован,хотя доза должна быть исправлена ​​через процедуры, чтобы сделать продольные сравнения.
   1. Промыть инфузионной порт с 5 мл гепаринизированной физиологического раствора, чтобы убедиться, что не осталось в порту декстрозы. Конец инфузии является Т0. Есть техник заменить перчатки, так как остаточная декстрозы из настоя может загрязнить последующие образцы крови.
3. Первый пост-инфузионный момент времени выборки в T3 мин, с конца декстрозы инфузии, а затем T5 мин, T7 мин, T10 мин, мин Т15, Т20 мин, а последний образец момент времени находится в T30 мин. Собирают плазму от каждой временной точки до уровней анализа глюкозы и инсулина с исходным образцом (см шаг 3.1).
   1. В T3 мин момент времени, используйте Ручной глюкометр, чтобы еще раз проверить уровень глюкозы в крови.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глюкометр показания на базовом и T3 только для подтверждения вливания декстрозы. Уровень глюкозы в крови в T3 мин момент времени должна быть ~ 100 мг / дл выше, COmpared до уровня глюкозы в плазме натощак базового уровня.

4. Восстановление и обработки образцов животных

1. Удалите канюль и оказать давление на катетеризированных участков для гемостаза после Т30 мин временной точке. Монитор животное, пока она не очнулась и сидит. корма Предложение, как только животное полностью выздоровел.
2. Немедленно поместите каждый пробы цельной крови в K ₂ EDTA пробирки на льду. Центрифуга при 3000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 10 мин после сбора. Образцы Алиготе плазмы в криопробирок, замораживании и хранят при -80 ° С до анализа.
   1. Дайте крови в сыворотке крови пробирку для стандартного химического анализа сыворотки постоять при комнатной температуре в течение не менее 20 мин и не более чем за 30 минут до центрифугирования при 3000 оборотов в минуту при комнатной температуре. Замораживание образцов сыворотки до проведения анализа в течение 48 часов сбора.
      Примечание: хранить в холодильнике образцы цельной крови не собираемые для анализа CBC до техСайед в течение 24 часов сбора.

5. Лечение данных

1. После установления кривых инсулина в плазме и глюкозы, определяют скорость клиренса глюкозы K из наклона натуральный логарифм значений глюкозы выше базовой линии ^{16, 17.}
   Примечание: Здоровый NHP можно ожидать, имеют скорость клиренса глюкозы K значительно выше 1, часто больше , чем 2 или более, в качестве здорового животного часто возвращаются к значениям глюкозы базовой линии в течение 30 мин. Поскольку производство инсулина падает, клиренс глюкозы K будет падать более резко, упав ниже 1.
2. Вычислить АУК в целом, как сумма итогов площади трапеций , представляющих собой площадь под кривой каждого отрезка между временных точках, через Т30 ^{16, 17.}
   ПРИМЕЧАНИЕ: Традиционно, АУК первых десяти минут процедуры считается acutе инсулиновый ответ на глюкозу (воздух), в то время как ППК от последнего 20 мин процедуры считается ответ поздно инсулина (LIR). По мере того как животное становится более дисметаболического, АУК инсулина будет увеличиваться, что отражает компенсацию за бесчувственность увеличении чувствительности к инсулину. Когда животное переходы к откровенного диабета, однако, AUC будет уменьшаться, часто сначала в острой фазе инсулина, захваченный воздух.

Результаты

Результаты , показанные на рисунке 1 , являются наглядными типичных глюкозы и инсулина кривых из зрелых, здоровых и диабетических яванских макак в течение 30 мин ВТТГ а. Данные из здоровых и продвинутых диабетических обезьян приведены для того, чтобы противопо?...

Обсуждение

ВТТГ оценивает способность глюкозы-стимулированной секреции инсулина с помощью одной декстрозы инфузии в зависимости от веса тела ^{5, 12, 13.} Из анализа, глюкозы в крови натощак и уровень инсулина достигается, и это позволяет оценить способности животного к освобождение инсулина и в...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allegra X-15R Centrifuge			plasma: 4C @3000 rpm for 10 min
Sorvall ST16R Centrifuge			serum: 22C @3000 rpm for 10 min
Thermo Scientific -86C Freezer, Forma 88000 Series		Model: 88500A
Dextrose 50% (D50)	Webster	07-8008986	I.V. glucose infusate
3mL Luer Lock Syringe	Midwest Veterinary Suppy		serial blood draws
5ml Luer Lock Syringe	Midwest Veterinary Suppy		heparinized saline flush
10mL Luer Lock Syringe	Midwest Veterinary Suppy		delivery of I.V. D50
Gauze sponges 2x2	Midwest Veterinary Suppy	366.23000.4	Used Dry, w/ %70 Alcohol, and 2% Chlorohex Solution
4 ml serum separator tubes	Midwest Veterinary Supply	366.45000.4	blood collection tube for superchem panel
K2EDTA, 2mL	VWR	95057-239	blood collection tubes
Aprotinin, 100mg	Sigma	A1153-100MG	blood collection tube protease additive
22g x 1" Catheters	Midwest Veterinary Suppy	193.75250.2	I.V. catheter
Injection Plug W/ Cap	Midwest Veterinary Suppy	001.11500.2	%50 dextrose infusion port
Porus Tape, 1/2" x 10yd	Midwest Veterinary Suppy	001.85000.2	maintain adherance of catheters and hep. Locks
Chlorhexidine Solution 2%	Midwest Veterinary Suppy	193.08855.3	prep catheter site
70% Ethanol	VWR	71001-654	prep catheter site
tourniquet	Webster	07-8003432
3 way stopcock	Midwest Veterinary Supply	366.28510.4	hep. lock
37" extension set	Webster	07-8454200	hep. lock
Exel 50-60cc LL Syringes	Midwest Veterinary Suppy	001.12250.2	Heparinized saline flush
250 ml bag 0.9% saline	Webster	07-8365593	flush
1,000 U Heparin, 10 ml	Webster	07-883-4916
Ketamine, (Ketaset) 100mg/mL	Fort Dodge	(AV ordered)
Precision Xtra glucose test strips 50/bx	Abbott (American Diabetes Wholesale)	9381599728K7	test baseline/ T3 blood glucose levels
Masimo Rad 57	DRE	6052057V	pulse-oximeter
Pavia rectal thermometer	Patterson	07-8391335
Precision Xtra Glucometer	Abbott	9381599728K7	Handheld glucometer