Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

Özet

Bu videonun amacı klinik ortamda nadir mutasyonları tespit etmek formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) referans standart hücre hatları ve dijital damlacık PCR (ddPCR) analizden otomatik DNA ekstraksiyon gerçekleştirmek için nasıl göstermektir. FFPE örneklerde mutasyonları tespit edilmesi FFPE örneklerinde ddPCR klinik faydasını ortaya koyar.

Özet

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

Giriş

Kilit düzenleyici genlerde genetik mutasyon birikimi kanseri ¹ giden, hücre proliferasyonu, farklılaşması ve hayatta kalma gibi normal hücre programlamayı değiştirir. RAS-RAF-MAP kinaz yolu, büyüme sinyallerine hücresel tepkileri aracılık eder. Onkogenik BRAF mutasyonlar ² aşırı aktif olma onkoprotein BRAF neden olabilir BRAF genindeki mutasyonlar sürücüsü, kaynaklanabilir. BRAF genindeki mutasyonlar da sırayla, büyüme faktörü aracılığında düzenlenmesinin ^4-6 bağımsız aşırı hücre büyümesi ve çoğalmasına neden, MEK ve ERK ³ aracılığıyla aşırı akış aşağı sinyal ile sonuçlanır.

Bazı araçlar örneğin ddPCR tarafından formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) referans standardı hücre hatlarında kantitatif gerçek zamanlı BRAF V600E mutasyonlar gibi DNA mutasyonu profil mevcuttur. ddPCR mutlak ölçümü için bir PCR bazlı yöntemGeleneksel kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) ^7,8 oranla daha yüksek doğruluk sunar. ddPCR aynı zamanda daha detaylı kanser araştırma ve tanı ⁹ sağlayan DNA şablonları nadir mutasyonların saptanması için güç ve doğruluk çözme daha içerir. Düşük şablon kopya sayıları ^10-12 okuyan zaman geleneksel qPCR üzerinde ddPCR ek avantajları geliştirilmiş hassasiyet ve doğruluk içerir. Burada, otomatik ddPCR tarafından BRAF V600E mutasyonların varlığını veya yokluğunu tespit ederek, ardından FFPE referans standardı hücre çizgileri, DNA ekstre için bir protokol olduğunu göstermiştir. Veri analizi ve sonuçlarının grafik bir gösterimi için yazılım kullanımı da tarif edilmektedir. Tüm işlem nispeten basittir ve tamamen profilli numune sayısı ve mevcut klasik bir PCR ve ddPCR makineleri sayısına bağlıdır.

Aşağıdaki protokol BR standart prosedürleri açıklar AF V600E pozitif FFPE referans standardı hücre çizgileri (HD598, HD593, HD617, HD273 ve yabani tipteki (WT)) Doku Hazırlanması System (TPS) protokolü kullanılarak tam otomatik bir cihaz içinde gerçekleştirilir. Ardından, izole edilmiş DNA örnekleri ddPCR sistemi kullanılarak BRAF V600E mutasyonların varlığı için analiz edilir. Tüm örnekler profilli edildikten sonra hedeflenen mutasyon analizi yapılır ve veri veri analiz yazılımı içine yüklendi. Örneklerin sayısına bağlı olarak / grup çalışıldı, veri analizi bir ile birkaç saat gerekebilir. Metodolojinin deneysel bileşeni alınmasında doğruluk gerektirir DNA vesayısal hava Pipetler ve Pipet, pipetleme bağlamında ilgili daha fazla açıklayan bir jove Öğrenim Video "> 96 gözlü plakalara pipetleme veri analiz yazılımı kullanılarak yapılır ise.

Protokol

FFPE Referans Standart Hücre Hatları 1. DNA Ekstraksiyon

Not: Bu işlem için, DNA izolasyonu, aşağıdaki protokolde tarif edildiği gibi FFPE Doku DNA izolasyon kiti kullanılarak FFPE referans standardı hücre hatları (HD598, HD593, HD617, HD273 ve vahşi tip (WT)) için yapıldı. Otomatik DNA ekstraksiyon toplam DNA izolasyonu için üreticinin yönergelerini izleyerek elde edildi.

1. Bir mikrotom ve orijinal FFPE bloğunu kullanan, elle prosedürlere göre, önce, DNA ekstraksiyon ve analiz taze kesitler hazırlamak. Doku bölümünde (ler) için örnek bir giriş 10 um arasında kombine bir toplam kalınlığını aşmaz analiz emin olun ve yüzey alanı, tek bir bölüm için 600 mm ² aşmamasına dikkat.

1.2 TPS protokolü

Not: Tablo 1 'de gösterilen birimleri 48 numune işleme için gereken minimum karşılık gelir ve prosedür,gösterilen TPS kurallarına uygundur. Deneye başlamadan önce otomatik programı sırasında örneklerin kaybını önlemek için, 600 x g'de santrifüj e-tüp içinde FFPE örnekleri yerleşmek.

1. Otomatik DNA izolasyonu enstrüman ve bilgisayarı açın. Run kontrol yazılımı açın ve TPS güverte yükleme alanı içine otomatik yük tepsi yerleştirin.
2. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, karşılık gelen olukları içine reaktifleri koyun.
   1. Numune taşıyıcı raflarına 4 örnekleri (BRAF WT BRAF V600E 50,% 5 ve% 1%) yerleştirin.
   2. Sütunları 2 ve 3 teknelerde uç kutuları yerleştirin ve çalıştırın iptal edecek, ucu başına birden fazla filtre varlığını ipuçlarına bakın.
   3. Onlara 3-5 kez ters yüz edilerek lizis tamponu ve yıkama tamponu uygun karışmasını sağlamak ve sütunda 4 (Şekil 1) ilgili olukları içine yerleştirin.
   4. Birkaç kez veya hafif Vort için tersini sonraexing, (Şekil 1, Tablo 1) belirtilen yerlerde 1 yuva boş bırakarak, sütunda 5 küçük teknelerde elüsyon tamponu, manyetik boncuk ve FFPE tampon yerleştirin.
   5. Plaka taşıyıcısı (Şekil 1) üzerine 2 ml derin kuyu plaka (DWP) yükleyin.
3. Bir çalışma başlamadan önce aşağıdaki nihai adımları gerçekleştirin:
   1. Tüm tüpleri ve reaktif olukları şapkasını çıkarmak. Yeterli kapasite sıvı atık şişe mevcuttur onaylayın. Katı atık şişesi boş ve biyolojik tehlikeli bir çanta ile kaplı olduğunu doğrulayın. Ucu çıkarma plaka atık montaj merkezli olduğunu doğrulayın.
   2. Ön kapağı kapatın.
4. Yazılımını başlatın. NA_Prep_Main_MLSTARlet.med dosyasını açın.
5. Tıklayın "Başlat". Enstrüman durumu çalıştıran boşta geçiş olacaktır.
6. Bu çalışma için örneklerin sayısını girin. Bu çalışma (DNA = 0) için istenen yöntemi seçin. İlk yüksek vol konumunu girinume ucu, tüm tepsiler doluysa "1" seçilmesi. Tüm tepsiler doluysa "1" seçilerek, ilk standart hacim ucunun konumunu girin.
   Not: Cihaz sonra kullanıcı müdahalesi olmadan otomatik adımlarda çalışacaktır. Ayrıntılı iş akışı Şekil 2'de gösterilmiştir. Deney bittiğinde, reaktif atıklar ve ipuçları atık montaj enjekte edilir.
7. Florometrik bir yöntemi kullanarak saflaştırılmış genomik DNA ölçmek.
   Not: 3,3 ng / ul'lik bir konsantrasyona az ihtiva eden DNA numuneleri ddPCR analizi (bölüm 2) tabi tutulur.

2. DNA Mutasyon profil: ddPCR Protokolü

Not: 1) Damlacık nesil 2) Konvansiyonel PCR büyütmesi, 3) Damlacık okuma ve 4), DNA mutasyonu profilleme: DNA mutasyonu profilleme için protokol 3 büyük adımlardan oluşur.

2.1. Damlacık oluşturma

Not: ddPCR Supermix olduğuBu karışım damlacık üretimi için gerekli olan reaktif içerdiğinden, ddPCR için önerilir.

1. , Kontaminasyonu önlemek gibi bir temiz PCR kaput, temiz pipetleri ve düşük protein bağlama tüpleri kullanan, eldiven giymiş gibi standart önlemler, izleyin.
2. İnsan genomik DNA örneği minimum konsantrasyonu 3.3 ng / ml olduğundan emin olun. Not: saflaştırılmış DNA örneği konsantrasyonu miktarı% mutasyon sıklığı algılama analizine göre değişir.
3. 96 gözlü PCR plakaları içinde reaksiyon karışımlarını bir araya getirin. Çözülme ve oda sıcaklığına kadar reaksiyon bileşenlerini dengeye getirin. (Her saflaştırılmış DNA örneği (66ng / 2 ul), distile su ile 20 ul'ye kadar yapmak, 2X ddPCR SuperMix (10 | il) ve 20 primerleri (ileri ve geri, 900 nM) ve sonda (250 nM) birleştirilerek PCR reaksiyonları hazırlayın ) damlacık jeneratör protokolü başına
4. Dağıtım önce tüpün alt kısmında içeriğini toplamak için homojenlik ve kısaca santrifüj sağlamak için iyice karışımı karıştırın. Yük 20 & #181; damlacık oluşumu için kartuş üzerine l.
5. İmalatçının tavsiye ettiği protokole göre damlacık jeneratör çalışması,
   1. Sahibinin sol üst tarafına yerleştirilmiş kartuş içinde çentik ile tutucu içine kartuşu takın. Alt kuyulara ortasına örnekleri içeren bir reaksiyon karışımı 20 ul, ve jeneratör yağı 70 ul ekle.
   2. Kartuşun üstünde conta takın. Conta sahibinin iki ucunda güvenli bağımlısı olduğundan emin olun; aksi halde, damlacık oluşturma için yeterli basınç elde edilemez olacaktır.
   3. Cihazın üstündeki yeşil düğmeye basarak damlacık jeneratör açın ve kartuşu takın. Tutucu gücü (sağdan sola) ve tutucu (orta sağ) gösterge ışıkları yeşil, hem doğru konumda olduğunda.
   4. Kapıyı kapatmak için tekrar enstrüman üst düğmesine basın ve damlacık nesil başlatırlar. Not: b bastıktan sonrabasıp bırakın, damlacıklar oluşturulan mikroakışkan kanallar aracılığıyla petrol ve örnekleri çizim çıkış kuyuları üzerinde manifoldu pozisyonları kendisi. Onlar birikir nerede Damlacıklar, iyi damlacık içine akar. 10 saniye damlacık nesil devam etmekte olduğunu göstermek için daha sonra damlacık gösterge ışığı (sağda) yeşil renkte yanıp söner.
   5. Damlacık oluşturma tamamlandığında, 3 gösterge ışıkları katı yeşile; düğmesine basarak kapıyı açın ve üniteden tutucu çıkarın. Yuvasından atılan contasını çıkartın ve atın. Not: kartuşun üst kuyu damlacıkları içerir ve orta ve alt oyuklar kalıntı yağın küçük bir miktarı ile, hemen hemen boş olduğunda.

2.2. PCR için Preparasyon

1. Üreticinin aygıt protokolde belirtilen her bir numune için, tavsiye edilen bir 96-çukurlu PCR plaka tek bir kuyunun içine en iyi kartuşlardan damlacık içeriğinin 40 ul üzerinden pipetleyin. Hayırte: çok kanallı bir pipet kullanarak damlacıklar emülsiyon aktarmak için idealdir. Damlacıkların Yavaş ve nazik aspirasyon transferleri sırasında damlacık kesme aza indirmek için tavsiye edilir.
2. Hemen buharlaşmasını önlemek için damlacıkların aktardıktan sonra folyo ile PCR plaka mühür. PCR plaka kapatıcı ve damlacık okuyucu iğneler ile uyumlu delinebilir folyo plaka contaları kullanın. PCR plaka mühürleyen kullanım kılavuzunda yönergeleri izleyin.
3. 180 ° C plaka mühürleyen sıcaklığı ve 5 sn saati ayarlayın.
4. Tepsi kapıyı açmak için oka dokunun. 96-iyi tarafı yukarı bakacak şekilde tepsiye destek bloğu yerleştirin. Destek blok üzerine 96-plaka koyun ve tüm plaka kuyuları destek bloğu ile uyumlu olduğundan emin olun.
5. Delinebilir folyo mühür 1 levha ile 96-plaka örtün. 96-plaka destek bloğu üzerinde güvenli ve delinebilir folyo mühür ile kaplıdır sonra, mühür düğmesine dokunun. Tepsi kapanacakve ısı yalıtım başlatacaktır.
6. Isı yapıştırma işlemi tamamlandığında, kapı otomatik olarak açılır; Termal bisiklet için ısı bloğu plaka kaldırmak ve daha sonra ısı bloğu kaldırmak.
7. Plaka tüm kuyu folyo depresyonlar her bir üzerinde aşikar olduğu kontrol ederek sızdırmaz olduğundan emin olun. Mühürlü sonra, plaka, termal bisiklet için hazırdır.
8. Damlacıklar çıkarıldıktan sonra, açmak için kartuş tutucu üzerindeki mandalları basın. Boş kartuşu çıkarın ve atın.
9. Tablo 2'de ayrıntılı parametreleri takip ederek geleneksel PCR gerçekleştirin.

2.3 Damlacık okuma (üreticinin tavsiye ettiği protokole göre)

Not: damlacıklar halinde nükleik asit hedefin PCR amplifikasyonu takiben damla okuyucu cihaz tek bir 2-renk algılama sistemi ¹³ kullanılarak her damlacık analiz eder. Biz genellikle FAM algılayıp ayarlamakd VIC muhabiri floroforlar.

1. Başbakan damlacık okuyucuya "Flush sistemi" tıklayın ve ddPCR analiz için hazır olun.
2. Damlacık okuyucu plaka yükleyin ve tıklayın "start". Damlacık okuyucu, her bir örnek aspire damlacıkları singulates ve 2 renkli dedektörü geçmiş bunları tek dosyaya akarsu. Dedektör olumlu ve olumsuz örnekleri numaralandırmak damlacıkları okur.
3. Damlacık okuma tamamlandığında, kapıyı açmak ve üniteden plaka tutucu çıkarın. Sahibinden 96-PCR plakasını çıkarın ve atın.
4. Doğru bakım için, damlacık okuyucu yağı yerine ve gerektiğinde atık yuvasını boşaltın. Mikrobiyal büyümeyi önlemek için atık şişeye% 10 çamaşır suyu 50 ml ekleyin.

2.4 DNA mutasyonu profilleme (üreticinin tavsiye ettiği protokole göre)

Not: PCR pozitif ve PCR-negatif damlacıkları mutlak quantific sağlamak için sayılırveri analiz yazılımı kullanılarak dijital formda, hedef BRAF V600E DNA mutasyonlarının asyon.

1. Numuneler, tahliller ve deneyler hakkında bilgi girmek için Kur'u tıklatın.
2. Kurulumu penceresinde, bir tabak (filename.qlp) yüklemek, sonra verileri açıp analiz analiz tıklatın. Sonuçlar Tablo, Kuyu Seçici ve İşlenmiş Data / Grafik Ekran: Veri analizi arayüzü üç pencere ayrılır.
3. İşlenmiş Veri penceresinde, her hedef için konsantrasyon veri plakası haritası kuyularda görünür ve Sonuçlar Tablo tabloda gösterilmektedir. Konsantrasyon araziler verileri görselleştirmek için Konsantrasyon tıklayın.

Sonuçlar

Bizim ddPCR analizi için, biz BRAF V600E mutasyonu FFPE referans standardı hücre hatları okudu. Damlacık okuyucu dizüstü bilgisayar çalıştıran veri analiz yazılımı bağlanır. Her bir damlacık pozitif ya da negatif olarak flüoresan genlik bazında tanımlanır. Üretici tarafından sağlanan yazılım da kullanıcı tanımlı kesim pozitif ve negatif damlacıklar arasındaki eşiği tanımlamak için girilmesine izin verir. Bir numune, pozitif ve negatif damlacık sayısıdır kopya / ul açıs?...

Tartışmalar

Burada, belirli bir gen mutasyonu değerlendirmesi için FFPE referans standardı hücre çizgisi örneklerinden ddPCR uygulanabilirliğini ve DNA izolasyonu vurgulayın. Bu çalışmada, TPS otomatik DNA izolasyon yöntemi kolayca, otomatik adapte edilebilir kullanılır ve büyük ölçekli deneyler ve alt değişkenliği sağlayan, aynı anda 48 farklı örnekleri kapasitelidir. Mevcut çalışmada DNA izolasyonu sınırlamaları biri her FFPE örnek tektir ve yüzey kirleticiler, mikrobiyal flora birbirlerini deği?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument	Siemens	10701001	Automated DNA isolation instrument
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	772BR1119
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	771BR1497
Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment		621BR17718
PX1 PCR plate sealer	Bio-Rad	770BR1575
QuantaSoft software	Bio-Rad
DNA isolation kit
VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1	Siemens	10632398
VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1	Siemens	10632399
CO-RE tips	Siemens
ddPCR mutation analysis
ddPCR Supermix	Bio-Rad	BR186-3010	2X concentration
DG8 cartridge	Bio-Rad	BR186-4008
Droplet Generator oil	Bio-Rad	BR-186-3005
Gasket	Bio-Rad	BR186-3006
Droplet reader oil	Bio-Rad	BR-186-3004