디지털 물방울 PCR은 포르말린 고정 파라핀 포함 된 참조 표준 세포주에서 BRAF의 V600E 돌연변이를 검출하기 위해 채용

요약

이 비디오의 목적은 임상에서 드문 돌연변이를 검출하는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 참조 표준 셀 라인과 디지털 방울 PCR (ddPCR) 분석 자동화 된 DNA 추출을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. FFPE 샘플에서 돌연변이를 검출하는 것은 FFPE 샘플에서 ddPCR의 임상 적 유용성을 보여줍니다.

초록

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

서문

키 조절 유전자의 유전 적 돌연변이의 축적은 암 ^1에 이르는, 세포 증식, 분화, 생존 등의 정상 세포의 프로그래밍을 변경합니다. RAS-RAF-MAP 키나아제 경로는 성장 신호를 세포 반응을 매개한다. 종양 BRAF 돌연변이는 ² 지나친되기 위해 암 단백 BRAF가 발생할 수 BRAF 유전자의 드라이버 돌연변이에서 발생할 수 있습니다. BRAF 유전자의 돌연변이는 또한 차례로, 성장 인자 - 매개 규제 ^4-6 독립적 과도한 세포 성장 및 증식에 이르게, MEK 및 ERK ³ 시그널링을 통한 과민성 하류 초래한다.

여러 가지 도구는 ddPCR으로 포르말린 고정, 파라핀 (FFPE) 참조 표준 셀 라인에서 정량 실시간 BRAF의 V600E 돌연변이로, DNA 돌연변이 프로파일을 사용할 수 있습니다. ddPCR 절대 정량 PCR 기반의 방법입니다종래의 실시간 정량적 PCR (qPCR의) ^7,8- 비해 더 높은 정확성을 제공. ddPCR 또한 더 많은 정보를 암 연구 및 진단 ^9있게 DNA 템플릿 희귀 돌연변이 검출을위한 전력 및 높은 정확도를 해결 제공한다. 낮은 서식 복사 번호 ^10-12을 연구 할 때 기존의 qPCR에 이상 ddPCR의 추가 장점은 향상된 감도와 정확도를 포함한다. 여기서, 자동 ddPCR 의해 BRAF V600E 돌연변이의 유무를 판정 하였다 FFPE 참조 표준 세포주로부터 DNA를 추출하기위한 프로토콜이 설명된다. 데이터 분석 및 결과의 그래픽 표현을위한 소프트웨어의 사용이 또한 설명된다. 전체 절차는 상대적으로 간단하고 완전히 프로파일 링 할 샘플의 개수 및 사용 가능한 통상적 인 PCR과 ddPCR 기계의 수에 의존한다.

다음 프로토콜은 BR에 대한 표준 절차를 설명 AF V600E 양성 FFPE 참조 표준 세포주 (HD598, HD593, HD617, HD273 및 야생형 (WT))는 티슈 제조 시스템 (TPS) 프로토콜을 사용하여 완전히 자동화 된 장비에서 수행된다. 이어서, 절연 DNA 샘플 ddPCR 시스템을 사용 BRAF V600E 돌연변이의 존재에 대해 분석된다. 모든 샘플들이 파일링 된 후에 표적 돌연변이 분석이 수행되고 데이터가 데이터 분석 소프트웨어로 로딩되었다. 샘플의 수에 따라 / 기 공부, 데이터 분석은 하나에서 여러 시간에 요구할 수있다. 방법론의 실험적인 구성 요소는 처리에 정확성을 필요로 DNA를 하고rological 피펫과 피펫, 피펫의 상황에 대해에 대한 자세한 내용을 설명하는 조브 과학 교육 비디오 "> 96 웰 플레이트에 피펫 팅, 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 수행된다.

프로토콜

FFPE 참조 표준 셀 라인 1. DNA 추출

주 :이 절차는 DNA 추출은 아래 프로토콜에 기재된 바와 같이 FFPE 조직 DNA 분리 키트를 이용 FFPE 참조 표준 세포주 (HD598, HD593, HD617, HD273 및 야생형 (WT))에서 수행 하였다. 자동화 된 DNA 추출은 전체 DNA의 분리를위한 제조업체의 지침에 따라 이루어졌다.

1. 마이크로톰 및 원래 FFPE 블록을 사용하여 수동으로 설정된 절차에 따라, 종래 DNA 추출 및 분석 신선한 섹션을 준비한다. 조직 절편 (들)에 대한 입력 샘플이 10 ㎛의 두께의 합계를 초과하지 않는 것을 확인하고 분석 표면적은 단일 섹션 600mm ^2를 초과하지 않도록.

1.2 TPS 프로토콜

주 : 표 1에 나타낸 양 (48)은 샘플을 처리하는 데 필요한 최소에 해당하고, 절차도시는 TPS 지침에 따른다. 실험을 시작하기 전에 자동 프로그램 중에 시료의 손실을 피하기 위해 600 XG에서 원심 분리하여 튜브의 전자 FFPE 시료를 진정.

1. 자동화 된 DNA 분리 악기와 컴퓨터를 켭니다. 실행 제어 소프트웨어를 열고 TPS 갑판 적재 영역으로 자동로드 트레이를 삽입합니다.
2. 도 1에 도시 된 바와 같이 해당 홈통으로 시약을 분주한다.
   1. 샘플 캐리어 랙에 4 샘플 (BRAF (WT), BRAF V600E 50 %, 5 %, 1 %)을 놓습니다.
   2. 열 2, 3의 골짜기에서 팁 상자를 놓고 실행을 중단 할 팁 당 하나 이상의 필터의 존재에 대한 도움말을 확인합니다.
   3. 그들에게 3-5 번 반전 용해 버퍼 및 세척 버퍼의 적절한 혼합을 확인하고 열 4 (그림 1)의 각 골짜기에로드.
   4. 몇 번이나 가벼운 vort에 대한 반전 후exing, (그림 1, 표 1) 표시된 곳 1 슬롯 빈 떠나, 열 5에있는 작은 골짜기에서 용출 버퍼, 자석 구슬 및 FFPE 버퍼를로드합니다.
   5. 플레이트 캐리어 (그림 1)에 2 ㎖의 깊은 우물 판 (DWP)을로드합니다.
3. 실행을 시작하기 전에 다음 최종 단계를 수행합니다 :
   1. 모든 튜브와 시약 골짜기를 뚜껑을 벗기다. 충분한 용량이 액체 폐기물 병에 사용할 수 있습니다 확인합니다. 고체 폐기물 병이 비어 및 생물 학적 가방 늘어서 있는지 확인합니다. 팁 꺼내기 판은 폐기물 어셈블리의 중앙에 있는지 확인합니다.
   2. 전면 커버를 닫습니다.
4. 소프트웨어를 시작합니다. NA_Prep_Main_MLSTARlet.med 파일을 엽니 다.
5. "시작."악기 상태는 실행에 유휴 상태로 전환됩니다.
6. 이 실행을위한 샘플의 수를 입력합니다. 이 런 (DNA = 0)에 대해 원하는 방법을 선택합니다. 제 1 고 부피의 위치를​​ 입력매화 팁, 모든 용지함이 가득 경우 "1"을 선택. 모든 용지함이 가득 경우 "1"을 선택, 최초의 표준 볼륨 끝의 위치를​​ 입력합니다.
   참고 :이 장비는 다음 사용자의 개입없이 자동 단계를 실행합니다. 상세한 흐름은도 2에 도시되어있다. 실험이 끝나면 반응물 폐기물 및 팁 폐기 조립체 내로 주입된다.
7. 형광 방법에 의해 정제 된 게놈 DNA를 정량.
   주 : 3.3 NG / μL의 최소 농도를 포함하는 DNA 샘플 ddPCR 분석 (2 장)을 실시한다.

2. DNA 돌연변이 프로파일 : ddPCR 프로토콜

주 : 1) 물방울 세대, 2) 기존의 PCR 증폭, 3) 물방울 읽기 및 4) DNA 돌연변이 프로파일 : DNA 돌연변이 프로파일에 대한 프로토콜은 3 주요 단계로 구성되어 있습니다.

2.1. 물방울 세대

참고 : ddPCR의 수퍼 믹스가이 혼합 액적 생성에 필요한 시약을 포함로, ddPCR하는 것이 좋습니다.

1. , 오염을 방지 같은 깨끗한 PCR 후드, 깨끗한 피펫, 낮은 단백질 결합 튜브를 사용하여, 장갑을 착용 표준 예방 조치를 따르십시오.
2. 인간 게놈 DNA 샘플의 최소 농도는 3.3 NG / μL 있는지 확인하십시오. 주 : 정제 DNA 시료 농도의 양은 % 돌연변이 주파수 검출의 분석에 따라 달라질 것이다.
3. 96 웰 PCR 플레이트에 반응 혼합물을 조립합니다. 해동과 RT에 반응 성분 평형. (각 정제 된 DNA 샘플 (66ng / 2 μL) 증류수로 20 μL를 구성하여 2 배 ddPCR의 수퍼 믹스 (10 μL) 및 (20) 프라이머 (순방향 및 역방향, 900 ㎚) 및 프로브 (250 nm의)를 결합하여 PCR 반응을 준비 ) 방울 생성기 프로토콜 당
4. 분배 전에 튜브의 하단에 컨텐츠를 수집 및 균질성을 간단히 원심 분리되도록 충분히 혼합 소용돌이. 로드 (20) & #181, 방울 형성​​을위한 카트리지 상 L.
5. 제조자의 권장 프로토콜에 따라 액적 발생기의 작동
   1. 홀더의 상부 좌측에 위치 된 카트리지의 노치와 홀더에 카트리지를 삽입한다. 바닥 우물에 중앙으로 샘플을 포함하는 반응 혼합물의 20 μL, 발전기 오일의 70 μl를 추가합니다.
   2. 카트리지의 상단에 개스킷을 부착합니다. 가스켓은 홀더의 양쪽 끝에 안전하게 걸려 있는지 확인; 그렇지 않으면, 액적 생성하기에 충분한 압력이 달성되지 않을 것이다.
   3. 악기의 위에 녹색 버튼을 누름으로써 액적 발생기를 열고 카트리지를 삽입. 홀더 전원 (오른쪽에서 왼쪽)와 홀더 (가운데 오른쪽) 표시등이 녹색으로 둘은 올바른 위치에있을 때.
   4. 문을 닫고 다시 악기 상단 버튼을 눌러 방울 생성을 시작합니다. 참고 : B를 누르면utton, 물방울이 생성 된 미세 유체 채널을 통해 석유 및 샘플을 그리기 출구 우물을 통해 매니 폴드 위치 자체. 그들이 축적 곳에 물방울이 잘 방울로 흐른다. 10 초는 액적 생성이 진행 중임을 나타냅니다 후 액적 표시 등 (오른쪽) 녹색으로 깜박입니다.
   5. 액적 생성이 완료되면, 3 표시등이 녹색으로 변경; 버튼을 눌러 문을 열고 장치에서 홀더를 제거합니다. 홀더에서 일회용 가스켓을 제거하고 폐기합니다. 주 : 카트리지의 상단 웰 방울을 포함하고, 중간 및 하부 웰 잔유 소량 거의 비어.

2.2. PCR을위한 준비

1. 제조자의 프로토콜 기기에 나타낸 각 시료에 대하여, 권장하는 96 웰 PCR 플레이트의 웰에 단일 상부 웰 카트리지로부터 액적 (40)의 내용을 μL 피펫. 아니TE : 멀티 채널 피펫을 사용하여 액 적을 에멀젼 전송에 적합하다. 방울의 느리고 부드러운 흡입은 전송 중에 방울 전단을 최소화하는 것이 좋습니다.
2. 즉시 증발을 방지하기 위해 방울을 전사 후 호일 PCR 플레이트를 밀봉. PCR 플레이트 실러와 방울 리더 바늘과 호환되는 천 공식 박 플레이트 씰을 사용합니다. PCR 플레이트 실러 설명서의 지시 사항을 따르십시오.
3. 180 ° C의 플레이트 실러 온도와 5 초에 시간을 설정합니다.
4. 트레이 문을 열 수있는 화살표를 누릅니다. 96 웰면이 위를 향하도록 트레이에 지원 블록을 배치합니다. 지원 블록에 96 웰 플레이트를 놓고 모든 판 우물이 지원 블록에 정렬​​되어 있는지 확인하십시오.
5. 천 공식 호일 씰 1 시트 96 웰 플레이트를 커버. 96 웰 플레이트 지원 블록에 고정하고, 천 공식 호일 씰으로 덮여되면, 실 버튼을 터치합니다. 트레이가 닫히고열 밀봉 시작합니다.
6. 가열 밀봉이 완료되면, 자동으로 문이 열리고 열 순환 용 히트 블록으로부터 판을 제거하고 열 블록을 제거한다.
7. 접시에 모든 우물이 호일에 우울증이 잘 각을 통해 쉽게 알 수 있음을 확인하여 밀봉되어 있는지 확인합니다. 밀봉하면, 플레이트는 열 순환에 대한 준비가되어 있습니다.
8. 물방울이 제거되면, 열려면 카트리지 홀더에 래치를 누릅니다. 빈 카트리지를 제거하고 폐기.
9. 표 2에 설명 된 매개 변수에 따라 기존의 PCR 증폭을 수행합니다.

2.3 물방울 읽기 (제조업체에서 권장하는 프로토콜에 따라)

주 : 방울 핵산 표적의 PCR 증폭에 이어, 액적 리더 구 개별적 2 색 검출 시스템 ^(13)을 이용하여 각각의 방울을 분석한다. 우리는 일반적 FAM의 검출을하도록 설정D VIC 기자 형광.

1. 주요 방울 독자에게 "세척 시스템"을 클릭하고 ddPCR 분석이 준비합니다.
2. 방울 리더에 판을로드하고 "시작."액적 리더는, 각각의 샘플을 흡인 방울을 singulates 및 2 색 검출기 과거의 단일 파일에 스트림. 검출기는 양극과 음극 샘플을 열거 방울을 읽습니다.
3. 액적 판독이 완료되면, 도어를 열고 유닛으로부터 판 홀더를 제거한다. 홀더에서 96 - 웰 PCR 플레이트를 제거하고 폐기합니다.
4. 적절한 유지 보수를 위해, 액적 리더 오일을 교체하고 필요에 따라 폐기물 용기를 비우고. 미생물 성장을 방지하기 위해 폐 병에 10 % 표백제 50 ㎖를 추가한다.

2.4 DNA 돌연변이 프로파일 (제조업체에서 권장하는 프로토콜에 따라)

참고 : PCR 양성 및 PCR 음성 방울은 절대 quantific을 제공하기 위해 계산됩니다데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 디지털 형태로 타겟 DNA BRAF V600E 돌연변이의 ATION.

1. 샘플, 분석, 실험에 대한 정보를 입력하는 설정을 클릭합니다.
2. 설정 창에서, 플레이트 (filename.qlp)을로드, 데이터를 열고 분석하는 분석을 클릭합니다. 결과 표, 잘 선택기 및 가공 데이터 / 그래픽 디스플레이 : 데이터 분석 인터페이스는 세 개의 창으로 분리된다.
3. 처리 된 데이터 창에서 각 대상에 대한 농도 데이터는 판지도의 우물에 나타나는 결과 표에서 표로하고 있습니다. 농도 플롯의 데이터를 시각화하기 위해 농도를 클릭합니다.

결과

우리 ddPCR 분석을 위해, 우리는 BRAF V600E 돌연변이 FFPE 참조 표준 세포주를 연구했다. 액적 리더는 노트북 컴퓨터 실행 데이터 분석 소프트웨어에 연결합니다. 각 방울은 (+) 또는 인 형광 진폭에 기초하여 정의된다. 제조자에 의해 제공된 소프트웨어는 또한 사용자 정의 컷오프는 양극과 음극 사이에 물방울 임계 값을 정의하기 위해 입력 할 수있다. 샘플의 양 및 음의 방울의 수는 복사 / μL?...

토론

여기서는 특정 유전자 돌연변이 진단을위한 기준 표준 FFPE 세포주 샘플들로부터 ddPCR의 적용 및 DNA 분리를 강조. 본 연구에서는, TPS 자동화 DNA 분리 방법이 용이하고 자동화 된 적응 될 수있는 사용되며, 더 큰 규모의 실험 및 하부 가변성을 허용 동시에 48 가지 시료를 수용 할 수있다. 본 연구에서 DNA 분리의 한계 중 하나는 모든 FFPE 시료가 고유 한 표면 오염 물질, 미생물, 식물에서 서로 다를 것, ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument	Siemens	10701001	Automated DNA isolation instrument
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	772BR1119
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	771BR1497
Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment		621BR17718
PX1 PCR plate sealer	Bio-Rad	770BR1575
QuantaSoft software	Bio-Rad
DNA isolation kit
VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1	Siemens	10632398
VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1	Siemens	10632399
CO-RE tips	Siemens
ddPCR mutation analysis
ddPCR Supermix	Bio-Rad	BR186-3010	2X concentration
DG8 cartridge	Bio-Rad	BR186-4008
Droplet Generator oil	Bio-Rad	BR-186-3005
Gasket	Bio-Rad	BR186-3006
Droplet reader oil	Bio-Rad	BR-186-3004