Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Özet

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Özet

Özel bir mobil bağışıklık hücrelerinin yokluğunda, bitkiler lokalize programlanmış hücre ölümü ve Sisteme Etki Eden Kazanılmış Direnç patojen saldırısına karşı kendilerini savunmak için kullanmaktadır. Genel bitki bağışıklık tepkisinin belirli bir Arabidopsis geni katkısı spesifik olarak ve kantitatif olarak enfekte olmuş doku içinde patojen büyümesinin tahlil ile değerlendirilebilir. Üç yılı aşkın süredir, hemibiotrophic bakteri Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (Psm ES4326) yaygın Arabidopsis bağışıklık tepkisini altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için bir model patojen olarak uygulanmıştır. Yaprak dokusuna patojenleri teslim etmek, birden fazla aşılama yöntemleri kurulmuştur, örneğin, şırınga sızma, daldırma aşılama, sprey, vakum infiltrasyon ve sel aşılama. Aşağıdaki protokol yetişkin yaprakları içine zehirli Psm ES4326 sunmak için optimize edilmiş bir şırınga sızma yöntem açıklanırArabidopsis bitkileri, toprak yetiştirilen ve doğru bu patojenin yönelik artan hastalık yatkınlık (EDS) için ekran. Buna ek olarak, bu protokol daha Salisilik Asit (SA) -Triggered Bağışıklık (STI) ve MAMP-Tetikledi Bağışıklık (MTI) dahil bitki savunma farklı katmanları, içinde belirli bağışıklık kusurları incelemek için birden fazla ön tedaviler ile takviye edilebilir.

Giriş

Nedeniyle sapsız doğası, bitkiler sürekli çeşitli yaşam tarzları ve beslenme stratejileri ¹ sergileyen patojenlerin bir bolluk tarafından tehdit edilmektedir. Nekrotrofik patojenler aktif gizli toksinler ve enzimler konak dokusunu öldürmek ve ölü hücreleri ¹ beslemek için ise bir ilk yaklaşım için, biotrophic patojenler, besin almak için hayatta onların ev sahibi korumak. Patojenler olarak adlandırılan hemibiotrophs başka bir grup, patojen birikimi ² belli bir eşik ulaştıktan sonra nekrotrofik sahneye biotrophic sahne ve vardiya ile enfeksiyon kursu başlıyor. Etkili bu mikroorganizmalara karşı kendilerini savunmak amacıyla, bitkiler patojen saldırı tespit ve tetiklemek için birden fazla gözetim mekanizmaları ile donatılmış karmaşık bir doğal bağışıklık sistemini geliştirmişlerdir hücre ölümünü ³ yanı sıra Sistemik Kazanılmış Direnç (SAR) ⁴ programlanmış lokalize. Mevcut araştırma temel sig karakterize odaklanmıştırnaling bileşenleri ve bitki bağışıklık sistemi ⁵ içinde çapraz görüşmeler.

"Zik-zak" modeli ⁵ önerildiği gibi, bitki doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin birinci tabaka bir mikrop istilasına tespit etmek için, plazma membran lokalize bir görüntü tanıma Reseptörler (PRR) varlığını gerektirir. PRR'ler Mikrop İlişkili Moleküler Desenler (MAMPs) tanımak ve MAMP-Tetikledi Dokunulmazlık (MTI) ⁶ kurabiliyoruz. Antimikrobiyal PR proteinleri ⁷ kodlayan genlerin transkripsiyonel bir regülasyonunu indükleyici yanı sıra, MTI hücre duvarına reaktif oksijen türlerinin üretimi (ROS) ve reaktif nitrojen (RNS), kaloz birikimini içeren patojen büyümesini tutuklama etkinlikleri çeşitli yol açar yanı sıra birden fazla kinaz sinyal aktivasyonu ⁸ yolaklarıyla olarak.

Şimdiye kadar, çok sayıda bakteriyel MAMPs flg22 ⁹ da dahil olmak üzere, Arabidopsis'te MTI tetiklemek için tespit edilmiştir (Flagellin türetilen bir 22 amino asit fragmanı) ve yapısal hücre duvarı bileşeni elf18 ¹⁰ (bakteriyel için uzatma faktörü Tu 18 amino asit), ¹¹ peptidoglikanlar. Başarılı bir enfeksiyon kurmak için, bazı özel patojenler, hücre içi veya hücreler arası boşluklar içine gizli virülans efektör proteinleri yeteneği gelişti ve dolayısıyla MTI bastırmak ve Efektör-Tetikledi Hassasiyetinin (ETS) ^12,13 tetikleyebilir var. Örneğin, hastalık oluşturma efektörler enfekte olmuş doku ^14-16 içinde hastalık gelişimini azaltmak için TEB Mitojen Aktive Protein Kinaz (MAPK) fosforilasyon kaskadlar etkisiz hale getirebilir. Host ve patojen arasındaki dinamik işbirliği evrimi sırasında, bitkiler de efektör proteinleri tanır ve patojen hastalık oluşturma ¹⁷ molekülleri azaltmak için kontra strateji geliştirmiştir. Bu, doğrudan veya dolaylı efektör tanıma hastalık direnci (R) proteinleri ¹⁸ aracılık eder. T çoğuetek NB-LRG üyeleri (nükleotid Bağlama ve Lösin Zengin Tekrarlar) ailesi ¹⁹ vardır. R proteini tarafından avirulent efektör algısı Efektör-Tetikledi Bağışıklık (ETİ) ²⁰ olarak karakterize güçlü ve daha geniş bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarır. Savunma genlerinin ²¹ ekspresyonunu ve savunma metabolitlerinin ²² üretimini indükleyen yanı sıra, ETİ genellikle komşu doku ³ içine yayılmasını kısıtlamak için patojen Hiperduyarlı Cevap (HR) olarak bilinen bir hızla lokalize programlı hücre ölümüne yol açar.

Programlanmış lokalize hücre ölümü ²³ ek olarak, bitkileri (SAR) ⁴ Sisteme Etki Eden Kazanılmış Direnç olarak adlandırılan uzun süreli ve sistem genelinde bir bağışıklık tepkisi başlatılması yeteneğine sahiptir. Bir biotrophic patojen ile tehditten sonra, bitki hücreleri, lokal ve sistemik dokularda ²⁴ hem de endojen fitohormon salisilik asit (SA) ve PR proteinlerinin sentezini ve birikimini tetikler. T yoluylaHer ne kadar süreç, hazırlık yüksek bir durumu patojenlerin ^24, geniş bir spektrum ile daha sonraki bir enfeksiyona karşı savunma davranışlarını sırasında daha hızlı bir montaj sağlar enfekte edilmemiş yaprak elde edilir. SA ve örneğin benzo gibi sentetik analogları (1,2,3) tiadiazol-7-karbotioik asit S-metil ester (BTH) ve 2,6-dikloroizonikotinik asit (INA) kimyasal Salisilik asit uyarabildiğinden (SA) dış uygulama ²⁴ üzerine -Triggered Bağışıklık (STI). Patojenesis-ilgili genler 1 (NPR1) arasında Nonexpressor lokal ve sistemik dokularda ^21,25,26 hem de SA aracılı savunma cevabı sırasında büyük bir kopyalama düzenleyicisi SA reseptörleri ve işlevlerinden biri olarak kabul edilmektedir. Bu kesin NPR1 SAR kurulması için gerekli olan ve NPR1 kaybı, Pseudomonas syringae'ye ²⁵ doğru dramatik bir duyarlılığa yol açtığı gösterilmiştir.

Yoğun bitki moleküler katkı karakterize etmek içinbitki-patojen etkileşimlerine bileşenleri, çok sayıda biyo-deneyler, ROS ²⁷ patlama da dahil olmak üzere, belirli bir savunma etkinlikleri ölçmek için protein ürünlerinin ²¹ kaloz birikimi ²⁸ savunma genleri ekspresyonunu ve birikimini geliştirilmiştir. Bu bireysel deneyler bitki bağışıklık tepkisinin özel bir forma anlayış sağlamak mümkün olmakla birlikte, bunların hiçbiri, ancak, tüm tesis düzeyinde tam bir savunma yanıtı temsil edebiliyoruz. Bunun aksine, enfeksiyondan sonraki patojen büyümesinin miktar organizma seviyesinde bağışıklık tepkisinin genel bir tahmin sağlar. Bu nedenle, kesin ve son derece standart patojen aşılama testinin geliştirilmesi ve optimizasyonu Arabidopsis bağışıklık tepkiler üzerine araştırma ve keşifler kadar yakıt için kritik öneme sahiptir.

Pseudomonas syringae, bir Gram negatif bir bakteridir, Arabidops da dahil olmak üzere bitki hücrelerine bir dizi hastalığa neden olabilen bir fitopatojenin olarak tanımlandı²⁹ olduğunu. P. - Model bitki-patojen sistemi, Arabidopsis gibi syringae etkileşim yaygın moleküler mekanizmaları altında yatan bitki savunma yanıtları ²⁹ anlamak için uygulanmıştır. Şimdiye kadar, üzerinde 50 P. Syringae pathovars farklı bitki türlerinin ³⁰ bulaştırmak için kendi yeteneklerine göre tespit edilmiştir . P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) ³¹ ve P. syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) ³² iki en yaygın olarak kullanılan ve yaygın karakterize öldürücü suşlar vardır. Kenara bitki tarafından tanınan ve MTI yanıtı tetikleyen olmaktan, Pst DC3000 ve Psm ES4326 MTI bastırmak ve patojen büyüme ^31,33 lehine ETS tetiklemek için öldürücü efektör proteinleri salgılayan yeteneğine sahiptirler.

Işlevsel Arabidopsis ve P. etkileşimini incelemek syringae, çoklu0; patojen enfeksiyon yöntemleri patojen teslim yaklaşımına dayalı geliştirilmiştir. Toprak yetiştirilen bitkiler için patojen şırınga infiltrasyonu, vakum infiltrasyonu, daldırma aşılama ve sprey aşılamadan ^29,34 ile teslim edilebilir. Son zamanlarda, fide sel aşılama tahlil doku kültürü üzerinde büyük ölçekli ekranlar gerçekleştirmek için geliştirilen genç Arabidopsis bitkiler ³⁵ plakaları yetiştirilen. Şırınga sızma, en sık kullanılan yaklaşım olarak, elle stoma ²⁹ olarak adlandırılan doğal yaprak deliklerden apoplast içine patojeni sunar. P. Bu yaklaşım sayesinde, eşit miktarlarda syringae enfekte kanadı içine sızabilir ve bitki bağışıklık tepkisinin gücü ters patojen artışı seviyeleri ile bağıntılıdır. Bu nedenle, patojen büyümesinin ölçümü bütün bitki düzeyinde bağışıklık fonksiyonunu değerlendirmek için en uygun yaklaşım olarak hizmet vermektedir. Buna ek olarak, şırınga infiltrasyonu lokal ve sistemik doku ayırt edebilirsiniz, hangi olabilir bSAR ³⁶ altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize uygulanabilir e.

Aşağıdaki protokol, artan hastalık yatkınlık (EDS) için Arabidopsis mutantlar ekrana Psm ES4326 ile optimize edilmiş şırınga sızma testi açıklar. Bu protokol, iki Arabidopsis genotipleri istihdam sağlayacak: vahşi tip ekotipinin Columbia-0 (Col-0) bitkileri (kontrol) ve npr1-1 kayıp fonksiyon-mutantlar (hypersusceptible) Bu öldürücü bakteri suşu Psm ES4326 ³⁷ ile enfekte olacaktır. Npr1-1 mutant tirozin son derece korunmuş histidin değiştirir ve ²⁵ fonksiyonel olmayan protein işler NPR1 molekülünün ankirin-tekrar konsensüs dizisi içinde bir nokta mutasyonu taşır. Buna ek olarak, şırınga süzme analizinde modifikasyonları bir dizi MTI ve STI da dahil olmak üzere bağışıklık tepkisi, spesifik tabakalar kusurların kantifikasyonuna izin veren bu tarif edilmiştir.

Protokol

Aşağıdaki metni Arabidopsis'de Psm ES4326 şırınga sızma deneyi optimize gerçekleştirmek için adım adım bir protokol açıklar. Bu deneyde başlıca işlemleri basitleştirilmiş bir akış şeması (Figür 1) yer almaktadır.

1. Bitki Büyüme Koşullar

1. Sow tohumlar
   1. Gevşek alt O onları iliklerine toprak ve su kapları ile doldurulmuş 2 tencere (çapı 4, uzun boylu 3.75) hazırlayın / N fazla suyu boşaltmadan önce.
   2. Levha ya da diğer kağıt ağırlığında katlanmış 70 mm, her saksı, 50-100 Arabidopsis tohumu, yabani-tür Col-0 veya npr1-1 mutant ekmek.
   3. % 80-90 (Şekil 2A) için bağıl nemi arttırmak için su püskürtülür şeffaf bir kubbe ile tencerenin kapağını kapatın.
2. Tam tabakalaşma ve senkron filizlenmesi için izin vermek için 72 saat boyunca 4 ° C'de pot inkübe.
3. Standart büyüme koşulları pot aktarın (12 saat ışık/ 12 saat karanlık, 21 ° C, ışık yoğunluğu 100 mol / m ² / sn, bağıl nem% 40) tohum çimlenme için izin vermek. Su yoğunlaşmasını önlemeye yardımcı olacaktır büyüme odası, transferinden sonra hemen açılması bir 2-3 oluşturmak için kubbeyi Crack.
4. Ilk gerçek yaprak uzunluğu 2-3 mm boyuta ulaştığında, düz toprak ile doldurulmuş 72 kuyu pot fidan nakli.
   1. Düz toprak yüzeyinin ortasında 1-derin depresyon oluşturmak için parmağınızı veya 1 ml pipet kullanın.
   2. Yavaşça mümkün olduğunca az kök hasarı ile bireysel fidan ayırın. Dikkatle forseps ile sağlam köklere sahip fide pick up.
   3. Depresyon içine nakli şok aza indirmek ve yavaşça depresyon doldurmak için çevredeki toprağı aşağı pat yapışan toprak simler ile birlikte tek ayrılmış fide yerleştirin. Biyolojik tehlikeli atık kabına ilave fide ve toprak atın ve uygun imhaYerel biyolojik tehlike atık kurallarına.
   4. Su üstten fide aktarılır ve tamamen% 80-90 nem korumak için su püskürtülür şeffaf bir kubbe ile düz kapak. Daha sonra 4 gün sabahı kubbesi çatlak ve tamamen o günün sonunda çıkarın, 3 gün boyunca kubbeyi tutun.
      Not: Ekim tohumlar alternatif düz toprakla dolu bir 72-kuyu üzerine bir cam pipet ile 2-3 tohum aktarılması, ardından 4 ° C'de 48 saat boyunca 1 mi,% 0.1 agar ihtiva eden 1.5 ml santrifüj tüplerine katmanlaştırıcı tohumları ile gerçekleştirilebilir. Yassı çimlenme sonrası bir hafta çıkarılabilir şeffaf bir kubbe ile kaplı olması gerekir. İlave fideler oyuk başına sadece bir fide bırakmak için çıkarılabilir.
5. 20 dakika için 1-su içinde daire ıslatılmasıyla Su bitkileri her iki günde bir, daha sonra fazla suyu tahliye.
   Not: sulama tesisleri için zaman aralığı büyüme odası nem bağlıdır ve kararlı taban olması gerekirKullanıcının bitki büyüme tesisinin sürekli gözlem d. Onlar iyi sulanan emin olmak için her gün bitkileri kontrol edin. Sadece birkaç noktalar, su fışkırtma bir şişe üst gelenler bitkilerin kurutulması durumunda.
6. Ya da büyüme koşulları (photoperiod, sıcaklık) bağlı olarak 3-5 haftalık karşılık gelişim aşaması # 3.50 (rozet boyutu% 50 bitmiş boyut), yakın bitkiler üzerinde patojen enfeksiyonu tahlilleri (Adım 3-5) gerçekleştirin. Çiçeklenme ortaya çıkması (evre # 5) yaşa bağlı direnç ^38,39 başlangıcından sonra bitkiler bulaştırmak etmeyin.

Kültür Medya ve Tabaklar 2. Hazırlık

1. Kral'ın B (KB) sıvı ortam 1 L olun. Yavaşça 1000 ml görünür pelet yoktur ₂ O kadar deiyonize H ile bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak 20 g proteoz pepton ve 2 g potasyum fosfat dibazik trihidrat karıştırın. 20 dakika bir sıvı döngüsü 150 ml'lik bir cam şişe içine kısım 100 ml otoklav.
2. HazırlamakKB katı ortam ile kültür plakaları.
   1. Yavaşça 20 gr Proteoz peptonlu, 2 gr Potasyum Fosfat Dibazik Trihidrat ve 1000 ml 15 gr Agar deiyonize H _{2 O} karıştırın Otoklav.
   2. Gelecekteki yoğunlaşmayı en aza indirmek ve antibiyotik bozulmasını önlemek için dokunmak serin kadar bir manyetik karıştırıcı plaka üzerinde orta soğutun. Ortam 1 ​​M MgSO ₄ steril 18 ml steril% 80 Gliserol ve 5 ml. Psm ES4326 50 ug ml bir son konsantrasyona kadar soğutuldu ortamı içine streptomisin ekleyin streptomisin karşı direnç taşıdığı göz önünde ^{- 1.}
   3. Plakaları dökün. 100 mm x 15 mm ve 150 mm x 15 mm Petri kapları: KB medya plakaları iki farklı boyutta hazırlayın. Daha küçük Petri içeren ortam birincil bakteri kültürü plakası olarak hizmet verir ve bakteri plaka sayma gibi büyük Petri kabı vermektedir.
      Not: plakaları sayma bakteriler için, dikdörtgen şekilli plakalar azaltmak için kullanılabiliriki katı kadar tedaviler geleneksel yuvarlak plakalara göre plaka başına çizilebilir beri sarf maliyet.
      1. Enfeksiyon deney öncesinde plakaları dökün. Streptomisin sülfat yana kadar 3/2 ay 4 ° C'de saklayın KB aracı madde içinde plakaları kademeli antibiyotik aktiviteye ⁴⁰ kaybeder.

3. Gelişmiş Hastalık Duyarlılık (EDS)

1. 1. Gün - plaka üzerinde Streak bakteri
   1. İki gün EDS analizden önce, çizgi Psm ES4326 den -80 ° C gliserol stoğundan ° BB-Strep bakteriyel kültür levhası ve 24-48 saat süre ile 28 ° C'de inkübe edin.
2. 2. Gün - sıvı kültür ve su bitkileri başlatmak
   1. , 28 ° CO / N ¹ streptomisin ve 250 rpm'de sallamak ^- 50 ug ml içeren 4 ml sıvı KB ortamı ile steril bir test tüpünde, sıvı kültürü başlatmak.
      Not: EDS enfeksiyonu testi için, genotip tavsiye edilir başına 6 bitkileri kullanaraked. STI ve MTI testlerde, tedavi başına genotip başına 6 bitki tavsiye edilmektedir. Bakteri inokulum için, 0.3 ve 0.6 arasında λ _600Nm optik yoğunluk ile taze sıvı bir kültürün kullanımı tavsiye edilir.
   2. Mark örnekleme enfekte doku kolay tanımlama için bir künt uçlu su geçirmez işaretleyici ile yaprakları sayısı 5 ve 6 sapı (Şekil 1). Stoma açılmasını geliştirmek ve yaprak haline patojen çözümün girişini kolaylaştırmak, 20 dakika boyunca alttan düz iliklerine iyi bitkileri sulamak için, daha sonra aşırı suyu boşaltın.
      Not: Alternatif olarak, şeffaf bir kubbe ile düz kapak ve stoma açıklığı arttırmak için 2-4 saat boyunca suya daldırın.
   3. 3. Gün - Patojen seyreltme ve şırınga infiltrasyonu
      Not: Sabah saatlerinde Patojen enfeksiyon duyarlı genotiplerin en belirgin hastalık belirtilerinin patojen çoğalması ve gelişmesi için en uygunudur. Infect tutmak için her türlü çabayıTutarlı iyon zamanlama deneysel tekrarlamalı arasında varyasyon azaltmaya yardımcı olur sirkadiyen ritimler ve gündüz gen regülasyonu ^41,42 etkisini ortadan kaldırmak için.
      1. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 9600 x g'de mikrosantrifüj tüpü içinde 1.5 ml bakteri kültürü Pelet ve supernatant atın. Steril 10 1 ml mM _MgCl2 ile bakteri pelletini.
         Not: Magnezyum katyonları P. motilitesini ve yapışma artırabilir Syringae ^43.. Alternatif olarak, aynı konsantrasyonda MgSO ₄ kullanın. Steril su Mg tuz çözeltileri için kabul edilebilir bir alternatiftir.
      2. 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde 10 mM _MgCl2 9 ml bakteri süspansiyonu seyreltilir ve λ = 600 nm bir spektrofotometre ile bakteri optik yoğunluk (OD) ölçün. Nihai OD _600Nm 10 mM _MgCl2 = EDS enfeksiyonu tahlili için 0.0002 ile bakteri ile seyreltilir.
      3. Yaprak InfiltrateSeyreltilmiş bir bakteri çözeltisi ihtiva eder (genel olarak insülin şırınga olarak da bilinir) bir 1 ml'lik kör uç iğnesiz şırınga.
      4. Tam kapasite ile şırınga kadar doldurmayın. Sızma işlemi sırasında çok daha iyi bir kontrol sağlamak için 0.5-0.6 ml ile doldurun.
      5. Işaret parmağı üstünde yaprak alt yüzeyini Açığa, yavaşça başparmak yardımıyla yaprak konumunu ayarlamak. Bu basınç eşit dağıtılmış sağlamak için yaprak yüzeyine dik şırınga yerleştirin. Yaprak hasarı azaltmak için sızma sırasında yaprak orta damarı alanı önlemek için deneyin.
      6. Yavaşça bakteriyel çözüm sızmaya pistonu itmek; koyu renkli bir yaprak rengi ile gösterildiği gibi yaprak mezofil sıvı girişi görselleştirilecektir. Yaprağın tüm yüzeyini sızmak deneyin. Bu, tek bir girişimde başarılı değilse, başka bir infiltrasyon nokta seçin ve tüm yaprak yüzey kaplı kadar yukarıda açıklanan işlemleri tekrarlayın.
      7. Tamamlandığında, yavaşça ilave patojen çözüm kaldırmak için emici dokusu ile yaprak leke. Görme hasar için enfekte yaprak dokusu inceleyin.
         Not: sızma tamamlandıktan sonra dairesel şırınga izlenim görünür olmamalıdır.
      8. Orijinal büyüme koşulları içine dönmeden önce 1-2 saat kurumaya sızmış bitkiler bırakın. Sonraki su ile net bir kubbe sprey ve kapağı enfekte bitkiler 2 saat sonra açılış bir 2-3 üretmek ve enfeksiyon deney geri kalanı boyunca bunu bırakmak kubbeyi çatlak.
         Not: P. yana Syringae aynı tesiste yetiştirilen diğer bitkilere enfeksiyöz ajanı yayılma riski yoktur, bir havadan patojen değildir. Ancak, ilave bir önlem olarak, yakınlarda bulunan virüslü bitkiler ve diğer deneysel bitkiler arasındaki fiziksel temastan kaçının. Şeffaf bir kubbe ile düz Kaplama patojen virülansını artırmak ve hastalığın ilerlemesini hızlandırır.kaplama dönem bu adımı ve optimal süresi, kullanıcının bitki büyüme tesisinin nem koşullarına göre tespit edilmesi gerekmektedir ihtiyacı.
   4. 5. Gün - medya plakaları ön kurutmaya
      1. Soğuk depolama biriminin dışına 150 mm x 15 mm KB plakalarını alın ve plaka üzerinde herhangi bir ön mevcut su yoğunlaşmasını kurulayın. Yaklaşık 24 saat boyunca oda sıcaklığında tutularak kuru tabaklar. Bu işlemi hızlandırmak için, 30-60 dakika boyunca kırık onların kapaklı bir laminer akış kaputu koyun.
         Not: Bu adım, bir sonraki aşamada plaka yüzeyinde dairesel bir damlacık oluşumu için kritik önem taşır.
   5. Gün 6 - patojen büyümesini nicel
      Not: Aşağıdaki patojen miktar prosedür bakterilerin eşit miktarda bitkiler yaprak morfolojisi değiştirmiştir, özellikle yaprak halinde teslim edilmektedir teyit etmek için enfeksiyondan sonra erken zaman noktalarında gerçekleştirilebilir.
      1. Ortaya çıkmasının ardından enfekte doku işleyinkloroz duyarlı genotiplerde enfekte dokuların sararma ile gösterilen ancak nekrotik lezyonlar gelişimi (Şekil 2B) daha önce.
         Not: Önerilen örnekleme süresi üç gün patojen aşılamadan sonra olduğunu. Patojen büyüme çevresel bir dizi faktöre bağlı olduğu, ancak, inkübasyon süresi 2 ½ 3 ½ günlük bir aralık içinde değişebilir ve kullanıcının bitki büyüme imkan enfeksiyon ilerlemesinin dikkat gözlemlerle tespit edilmesi gerekmektedir olabilir.
         1. Her genotip (Şekil 1) 6 taşlama tüpleri hazırlayın. Bir paslanmaz çelik öğütme topu yerleştirin ve her bir tüpe 10 _mM MgCl2, steril 500 ul ilave edin.
         2. Bitki enfekte yaprak ayırın ve 1 delikli kağıt zımba (Şekil 1) ile bir yaprak diski yumruk.
            Not: örnekleme hatasını en aza indirmek, aynı pozisyonda her örneklenmiş yaprak yumruk deneyin. Üst yaprak diskinin Örneklemeyaprağın tavsiye edilir.
         3. Rasgele forseps kullanarak her öğütme tüpe (iki farklı bitkilerden) 2 yaprak diskleri yerleştirin.
         4. Tüp kapatın ve 10 dakika süreyle maksimum hızda yüksek verimli bir homojenleştirici (dakikada 1600 vuruş) ile doku homojen hale getirilir. Doku iyi homojenize ve çözümleri nedeniyle enfekte yapraklardan klorofil sürümüne yeşile kadar gerekirse bu işlemi tekrarlayın.
      2. Homojenizasyon için beklerken, çok kanallı bir pipet ve pipetleme rezervuarı kullanarak 180 ul 10 _mM MgCl2, 96 oyuklu bir kültür plakasına ilk 6 satır doldurun.
      3. Öğütme işleminden sonra, 96-kuyulu plakanın ilk sıraya temel doku süspansiyonu 20 ul transfer ve sıvı yukarı ve aşağı pipetleme tekrar karıştırılır. Küçük doku parçaları ucu yapışmasına neden olursa, çözümün doğru hacmini edinmelerine yardımcı 2-3 mm tutturun.
         1. Üst o üzerinde damlacık için yeterli alan sağlamaklevha, uzay alternatif sıralardaki farklı genotipleri doku (Şekil 1) f. On kat seri seyreltme hazırlamak için, ikinci satıra 20 ul sıvı transferi ve altıncı seyreltme kadar bu işlemi tekrarlayın.
      4. Aktarım ayrılır pipet uçları (Şekil 1) kullanılarak 150 mm x 15 mm KB plaka üzerine 96-yuvalı plaka çözeltisi 20 ul. En yoğun en inceltilmiş süspansiyon çalışın.
         Not: En konsantre seyreltilmiş çoğu hareketle gereksiz seyreltilerde arasındaki pipet uçları değiştirmek için yapar. Plaka de önceden kurutulmuş ise (genellikle 15-30 dakika) absorbe kadar aktarılan damlacık ortamı üstünde sağlam kalmalıdır. Kuruma süresi, oda sıcaklığında ve nem ile değişir.
      5. Kapak kırık ile oda sıcaklığında plaka kurulayın. Artık sıvı plaka yüzeyinde görülebilir kez kapak, ters kapatın ve oda sıcaklığında plaka ya da 28 ° C inkübatör inkübe.
      6. Koloniler görünür hale gelene kadar 40-60 saat inkübe. Tabakalarına büyüme oluşturan üniteler (cfu) oluşturan koloni öngörülebilir 10 misli bir düşüş (Şekil 2C) yansıttığını teyit edin. Onlar büyümek ve koloniler sigorta önce bakteri sayın. Örtüşen kolonileri yok düşük sulandırma bakteri sayısını belirler. Genellikle tercih edilen seyreltme 10-50 koloniler arasında içerecektir sayılacak.
         Not: Varyasyon teknik çoğaltır arasında mevcut olabilir; Bu nedenle, her bir deney için düşük seyreltme ayrı belirlenmelidir.
      7. Bakteriyel çoğalma seviyelerini hesaplamak için, üst üste (R) yanı sıra, yazılı olarak, her teknik tekrarında (T) içindeki bakteri sayısı sayısı belge. Koloni oluşturan birim sayısını belirler - formülü ile kob / yaprak disk: kob / yaprak disk = (T × 10 ^R / 20) 500/2 ×
      8. Süreden için aşağıdaki elektronik tablo şablonda verileri yazınbir grafik (Şekil 1) ce (elektronik tablo veri analizi şablon dosyası için, Tablo 2). Her veri noktası, logaritmik ölçekte altı teknik kez tekrarlanan deneyin ortalaması olarak ifade edilir. Hata çubukları, ortalamanın% 95 güven aralığını temsil eder (n = 6).
         Not:% 95 güven aralıkları hesaplanması teknik çoğaltır sayısına göre ayarlanması gerekir.

4. SA-Tetikledi Bağışıklık (STI)

1. 1. Gün: Adım 3.1 açıklandığı gibi aynı prosedürü uygulayın.
2. Gün 2: Sıvı bakteri kültürü (Aşama 3.2) bitkiler sulama ve başlatılması yanı sıra, SA türevi sodyum salisilat ²¹ dış uygulama tarafından direnci sağladığım göstermektedir.
   Not: Saf SA zayıf suda çözünürlüğe sahiptir ve daha önceki pH ayarlama gerektiren, böylece, bu tahlil için tavsiye edilmez.
   1. P. karşı SA aracılı savunma indüklemek için syringae ve gelecekteki enfeksiyon ²¹ için prime ^bitkiler,(Sahte gibi) iyi bir 1 mM sodyum salisilat buğu veya _H2O ile 24, püskürtme bitkileri patojen enfeksiyonundan önce 16-24 saat.
3. 3. Gün: = OD _600Nm için 0.001 patojen seyreltme hazırlayın ve şırınga infiltrasyon (Adım 3.3) ile tüm yaprak yüzeyine bakteri itin.
4. 6. Gün: EDS tahlili (Adımlar 3.4 ve 3.5) için tarif edildiği gibi patojen ölçümü ve sayım işlemi için, prosedürü izleyin. Plaka ve saymak _H 2 O ve Sodyum Salisilat - ayrı ön işlem örnekleri. Ön-muamele sistemleri - vahşi tür Arabidopsis thaliana için patojen büyümesinde 1-2 log azalma Sodyum Salisilat beklenmektedir.

5. MAMP-Tetikledi Bağışıklık (MTI)

Not: Bu deneme içinde, bizler, vahşi tip Arabidopsis Col-0 ve mutant fls2 ve efr kullanılan bitkiler. FLS2 ve EFR plazma membran lokalize Örüntü Tanıma Reseptörler (PRR) flg22 ve elf18 tanıyabilir, respe vardırctively ^9,10. Psm ES4326 dış MAMP tedavi öncesi ve şırınga infiltrasyonu, aşağıdaki mutant değişmeden patojen büyümesinin ile gösterilir MAMP, spesifik tipte bir duyarsızlık her PRR sonuçları kaybı.

1. Gün 1 ve 2: Adım 3.1 ve 3.2 açıklandığı gibi aynı prosedürü uygulayın.
2. 3. Gün: MAMP, tedavi öncesi ve patojen enfeksiyonu
   1. , MAMP-Tetiklemeli Dokunulmazlık kurmak flagellin epitop flg22 veya EF-Tu epitop elf18 ve 1 mcM solüsyonu hazırlamak için patojen enfeksiyonu (Adımlar 3.3.3-3.3.6) önce tüm yaprak yüzey 4 saat içine şırınga-sızmak. Bu P. karşı MAMP aracılı savunma indüksiyonu için sağlayacak syringae ve başbakan gelecek enfeksiyonu ^6,37 için tesisler.
      Not: Kamuya açık mikrodizi verileri flg22 ya elf18 tedavi ^37.44'ü sonra 4 saat olur MAMP duyarlı genlerin yüksek transkripsiyon yeniden programlanması saptandı. Bu durumda, 4 saatlik önerilirCol-0 MAMP ile muamele edilmiş ve fls2 ve efr mutantlar arasında patojen büyümesinin açık bir fark elde sonuçlanır MAMP ön işlem süresi.
   2. Emici doku ile ekstra MAMP çözüm çıkarın ve yaprak içindeki sıvı emme sürecini hızlandırmak için ortaya bitkiler bırakın. Şırınga basınç infiltrasyonu yaraladı etkisi hesaba katmak için, kontrol bitkilerinin yaprakları içine _H 2 O sızmak.
   3. OD _{600 nm} için patojen seyreltme hazırlayın = 0,001 MAMP / _H2O ile önceden işlemden geçirilmiş bir şırınga infiltrasyonu ile yaprak (Aşama 3.3) tüm yaprak yüzeyine bakteri itin.
3. 6. Gün: Adım 3.4 ve 3.5 de tarif edildiği gibi patojen ölçümü ve sayım işlemi için, prosedürü izleyin. Plaka ve ayrı ayrı _H 2 O ve MAMP-ön tedavi örnekleri sayılır. Yabani tip Arabidopsis, patojen büyümesinde 1-2 log azalma kısmen güçlü olan, MAMP ön tedavisi yapılmış bitkilerde beklenmektedirflg22 aracılık ettiği er redüksiyon elf18 için karşılaştırıldı.

Sonuçlar

Burada açıklamak protokol optimize edilmiş P. temsil syringae şırınga sızma deneyi nicel Arabidopsis bitkilerde bağışıklık tepkisini değerlendirmek için. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, Psm ES4326 şırınga infiltrasyonu sulandırılmış hali ve koloniler numaralandırma ile patojen ekstre edilmek ve nicelendirilmek izlemektedir.

Protokol metin içinde Aşama 3'de tarif edildiği gibi, Psm ES4326 karşı ...

Tartışmalar

Nüfusu mevcut arazileri azalan ve artan dünyada araştırmacılar ekin iyileştirilmesi için acil ihtiyaçları zorlanmaktadır. Verim büyük ölçüde çeşitli biyotik ve abiyotik streslere etkilenebilir. Bunlar arasında, patojen enfeksiyonu tek başına ⁴⁵ ABD'de yaklaşık% 12 kayıp sorumlu mahsul verim azalmasına önde gelen nedenlerinden biridir. Bu sorunu gidermek için, masif araştırma modeli Arabidopsis'de yapılmıştır - P. syringae pathosystem kapsamlı bileşenleri ve b...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MetroMix 360	Grosouth	SNGMM360
Large pots	Grosouth	TEKUVCC10TC
12 x 6 Inserts	Grosouth	LM1206
11x 21 Flats with no holes	Grosouth	LM1020
11x 21 Flats with holes	Grosouth	LM1020H
Vinyl propagation domes	Grosouth	CW-221
Proteose Peptone	Fisher Scientific	DF0122-17-4
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate	MP Biomedicals	151946
Agar	Fisher Scientific	A360-500
Streptomycin sulfate	Bio Basic Inc	SB0494
100 x 15 mm Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875713
150 x 15 mm Petri dishes	Fisher Scientific	R80150
Rectangular plate	Fisher Scientific	12-565-450
MgCl2 Hexahydrate	Bio Basic Inc	MB0328
Glycerol	Bio Basic Inc	GB0232
MgSO4	Bio Basic Inc	MN1988
1 ml syringe	Fisher Scientific	NC9992493
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A
Grinding tubes	Denville Scientific	B1257
Caps for grinding tubes	Denville Scientific	B1254
Stainless steel grinding ball	Fisher Scientific	2150
96-well plate	Fisher Scientific	12-556-008
Sodium Salicylate	Sigma Aldrich	s3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)	Genescript	Made to order
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	Genescript	Made to order
Hole puncher	Staples	146308
Biophotometer plus	Eppendorf	952000006
PowerGen High-Throughput Homogenizer	Fisher Scientific	02-215-503
Accu spin micro centrifuge	Fisher Scientific	13-100-675
Multichannel pipette (10-100 µl)	Eppendorf	3122 000.043
Multichannel pipette (30-300 µl)	Eppendorf	3122 000.060
Pipette (20µl)	Eppendorf	3120 000.038
Pipette tips	Fisher Scientific	3552-HR
Sharpie permanent marker	Staples	507130
1.5 ml tube	Eppendorf	22363204
Forceps	Fisher Scientific	08-890