Batterica Leaf Infiltrazione Assay per Fine Caratterizzazione di risposte di difesa delle piante che utilizzano il<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Patosistema

Riepilogo

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Abstract

In assenza di cellule immunitarie specializzate mobili, piante utilizzano il loro localizzata morte cellulare programmata e Sistemica resistenza acquisita per difendersi contro l'attacco patogeno. Il contributo di uno specifico gene Arabidopsis per la risposta immunitaria impianto complessivo può essere specifico e quantitativamente valutata analizzando la crescita dei patogeni all'interno del tessuto infetto. Per oltre tre decenni, il batterio Pseudomonas syringae pv hemibiotrophic. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) è stato ampiamente applicato come modello patogeno per studiare i meccanismi molecolari alla base della risposta immunitaria Arabidopsis. Per offrire patogeni nel tessuto foglia, sono stabilite diversi metodi di inoculazione, ad esempio, la siringa infiltrazione, tuffo inoculazione, spray, infiltrazione vuoto e inondazioni inoculazione. Il protocollo che segue descrive un metodo siringa infiltrazione ottimizzato per fornire virulenta Psm ES4326 in foglie di adultisuolo coltivato piante di Arabidopsis e schermo per una migliore precisione predisposizione alle malattie (EDS) nei confronti di questo patogeno. Inoltre, questo protocollo può essere integrato con più pre-trattamenti per sezionare ulteriormente specifici difetti immunitari all'interno di diversi livelli di difesa vegetale, compresi l'acido salicilico (SA) Immunità -Triggered (STI) e Immunità MAMP-Triggered (MTI).

Introduzione

A causa della loro natura, sessili, piante sono costantemente minacciati da una pletora di agenti patogeni che espongono diversi stili di vita e le strategie nutrizionali ^1. In prima approssimazione, gli agenti patogeni biotrofici mantengono il loro ospite vivo per recuperare le sostanze nutritive, mentre agenti patogeni necrotrophic tossine attivamente segreti ed enzimi per uccidere tessuto ospite e nutrono le cellule morte ^1. Un altro gruppo di agenti patogeni, hemibiotrophs chiamati, inizia il loro corso l'infezione con il palco biotrofico e si sposta alla fase necrotrophic al raggiungimento di una certa soglia di accumulo patogeno ^2. Al fine di difendersi efficacemente contro questi microrganismi, piante hanno sviluppato un complesso sistema immunitario innato dotato di molteplici meccanismi di sorveglianza per rilevare l'attacco patogeno e innescare localizzato morte cellulare programmata ^{3 e} sistemica la resistenza acquisita (SAR) ^4. La ricerca attuale è focalizzata sulla caratterizzazione del sig essenzialenaling componenti e incrociati colloqui all'interno del sistema immunitario pianta ^5.

Come proposto nel modello "zigzag" ^5, il primo strato della risposta immunitaria innata pianta richiede la presenza di plasma-membrana localizzata Motivo recettori di riconoscimento (PRR) per rilevare l'invasione di un microbo. PRR sono in grado di riconoscere i modelli Microbe-Associated Molecular (mAmps) e stabilire Immunità MAMP-Triggered (MTI) ^6. Oltre ad indurre una upregulation trascrizionale di geni che codificano le proteine ​​PR antimicrobici ^7, MTI porta ad una serie di eventi che arrestare la crescita dei patogeni, inclusa la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e reattive di azoto specie (RNS), deposizione di callosio a parete cellulare nonché l'attivazione della chinasi di segnalazione molteplici vie ^8.

Fino ad oggi, diversi piani di gestione pluriennali sono stati identificati per innescare MTI in Arabidopsis, compresi flg22 batterica ⁹ (Un frammento di acido 22 aminoacidi derivato da flagellina), elf18 ¹⁰ (18 aminoacidi dalla batterica fattore di allungamento Tu) e un componente strutturale della parete cellulare peptidoglicani ^11. Per stabilire una infezione di successo, alcuni patogeni specializzate hanno sviluppato la capacità di proteine ​​effettrici virulenza segrete negli spazi intracellulari o intercellulari, e quindi reprimere MTI e innescare suscettibilità Effector-Triggered (ETS) ^12,13. Ad esempio, effettori di virulenza possono inattivare proteine ​​Mitogen-chinasi attivata (MAPK) fosforilazione cascate di MTI per indurre lo sviluppo della malattia entro il tessuto infetto ^14-16. Durante la co-evoluzione dinamica tra host e patogeni, piante anche sviluppato la strategia di contrattacco di riconoscere le proteine ​​effettrici e attenuare la virulenza patogeno molecole ^17. Questo riconoscimento diretto o indiretto effettrici è mediata dalla resistenza alle malattie (R) ¹⁸ proteine. La maggior parte di torlo sono membri di NB-LRR (Nucleotide Binding e leucina-ricchi ripetizioni) della famiglia ^19. La percezione di un effettore avirulent da una proteina R provoca una risposta più forte e più ampia immunitario caratterizzato come Immunità Effector-Triggered (ETI) ^20. Oltre inducendo l'espressione di geni di difesa ²¹ e la produzione di metaboliti difesa ^22, ETI spesso porta ad una rapida morte cellulare programmata localizzata noto come Hypersensitive Response (HR) per limitare il patogeno di diffondersi nel tessuto adiacente ^3.

Oltre alla morte cellulare programmata localizzato ^23, le piante sono in grado di avviare un lungo periodo e risposta immunitaria a livello di sistema denominato Systemic Acquired Resistance (SAR) ^4. Su sfida con un agente patogeno biotrofico, cellule vegetali innescano la biosintesi e l'accumulo di un phytohormone endogena acido salicilico (SA) e delle proteine ​​PR in entrambi i tessuti locali e sistemiche ^24. Attraverso til suo processo, un elevato stato di preparazione si ottiene nelle foglie non infetti che consente il montaggio risposte di difesa veloce durante una successiva infezione da un ampio spettro di agenti patogeni ^24. SA ed i suoi analoghi sintetici come benzo (1,2,3) -thiadiazole-7-carbothioic estere dell'acido S-metil (BTH) e acido 2,6-dichloroisonicotinic (INA) sono in grado di indurre chimicamente acido salicilico (SA) Immunità -Triggered (STI), su richiesta esterna ^24. Nonexpressor di-Patogenesi correlati geni 1 (NPR1) si propone di essere uno dei recettori SA e funziona come un regolatore trascrizionale importante durante risposta di difesa SA-mediata sia nei tessuti locali e sistemiche ^21,25,26. E 'stato definitivamente dimostrato che NPR1 è necessario per istituzione SAR e la perdita di NPR1 conduce alla drammatica suscettibilità verso Pseudomonas syringae ^25.

Per caratterizzare ampiamente il contributo molecolare della piantacomponenti nelle interazioni pianta-patogeno, molteplici test biologici sono stati sviluppati per misurare gli eventi di difesa specifici, tra cui i ROS scoppio ^27, callosio ^di deposizione 28, espressione geni di difesa e l'accumulo dei loro prodotti proteici ^21. Mentre questi dosaggi individuali possono fornire intuizioni in una forma specifica della risposta immunitaria pianta, nessuno di essi, tuttavia, sono in grado di rappresentare la risposta di difesa completa sull'intera livello di impianto. Al contrario, la quantificazione della crescita dei patogeni dopo l'infezione fornisce una stima complessiva della risposta immunitaria a livello di organismi. Pertanto, lo sviluppo e l'ottimizzazione di un preciso e altamente standardizzata saggio patogeno inoculazione è fondamentale per alimentare la ricerca e le scoperte sulle risposte immunitarie Arabidopsis.

Pseudomonas syringae, un batterio Gram-negativi, è stato identificato come un phytopathogen in grado di causare la malattia in una vasta gamma di piante ospiti tra cui Arabidopsè ^29. Poiché il sistema pianta-patogeno modello Arabidopsis - P. interazione syringae è stato ampiamente applicato per comprendere i meccanismi molecolari alla base della pianta risposte di difesa ^29. Finora, oltre 50 P. patovar syringae sono stati identificati in base alla loro capacità di infettare diverse specie vegetali ³⁰ . P. syringae pv. DC3000 pomodoro (Pst DC3000) ³¹ e P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) ³² sono i due ceppi virulenti più utilizzati e ampiamente caratterizzate. Oltre ad essere riconosciuto dalla pianta e innescando la risposta MTI, Pst DC3000 e Psm ES4326 sono in grado di secernere proteine ​​effettrici virulenti per sopprimere MTI e attivare ETS per favorire la crescita del ^31,33 patogeno.

Per sezionare funzionalmente l'interazione tra Arabidopsis e P. syringae, multiplo0; metodi di infezione patogeni sono stati sviluppati sulla base del metodo di consegna patogeno. Per gli impianti di terreno coltivati, agente patogeno può essere trasportata da siringa infiltrazione, infiltrazione di vuoto, tuffo inoculazione e spruzzo inoculazione ^29,34. Recentemente, piantina saggio alluvione-inoculazione è stato sviluppato per eseguire grandi schermi su colture di tessuti piastre-grown giovani piante di Arabidopsis ^35. Siringa infiltrazione, come una delle soluzione più utilizzata, garantisce manualmente patogeno nel nell'apoplasto attraverso le aperture dell'anta naturale chiamati stomi ^29. Attraverso questo approccio, gli importi uguali di P. syringae può essere infiltrato nella foglia infetta e la forza della risposta immunitaria pianta è inversamente correlato ai livelli di crescita dei patogeni. Pertanto, la quantificazione della crescita dei patogeni serve come un approccio ottimale per valutare la funzione immunitaria a livello di tutta la pianta. Inoltre, siringa infiltrazione può distinguere il tessuto locale e sistemica, che può be applicabile nel caratterizzare i meccanismi molecolari alla base SAR ^36.

Nel seguente protocollo, si descrive una siringa infiltrazione dosaggio ottimizzato con PSM ES4326 per lo screening mutanti di Arabidopsis per una maggiore suscettibilità alle malattie (EDS). Questo protocollo si avvarrà di due genotipi di Arabidopsis: una wild-type ecotipo Columbia-0 (Col-0) piante (controllo) e mutanti npr1-1 perdita di funzione (ipersensibili) che sarà infettato con ceppo batterico virulento Psm ES4326 ^37. Il mutante npr1-1 porta una mutazione puntiforme all'interno della sequenza consenso ankyrin-repeat della molecola NPR1, che altera la istidina altamente conservata in tirosina e rende la proteina non funzionale ^25. Inoltre, una serie di modifiche del dosaggio siringa infiltrazione sono descritte che consentono la quantificazione dei difetti negli strati specifici della risposta immunitaria, compresi MTI e STI.

Protocollo

Il testo che segue descrive un protocollo graduale a compiere ottimizzato Psm ES4326 saggio siringa infiltrazione in Arabidopsis. Principali procedure di questo test sono rappresentate in un diagramma di flusso semplificato (grafico 1).

1. Impianto condizioni di crescita

1. Seminare i semi
   1. Preparare 2 vasetti (4 di diametro, 3,75 in alto) senza bloccare pieni di pentole suolo e le acque, mettetelo a bagno dalla parte inferiore O / N prima di scaricare l'acqua in eccesso.
   2. Seminare 50-100 semi di Arabidopsis, wild-type Col-0 o npr1-1 mutanti, su ogni piatto con un piegato 70 mm del peso di foglio o altra carta.
   3. Coprire la pentola con una cupola trasparente spruzzato acqua per aumentare l'umidità relativa al 80-90% (Figura 2A).
2. Incubare la pentola a 4 ° C per 72 ore per permettere la stratificazione completa e germinazione sincrona.
3. Trasferire il piatto per le condizioni di crescita normali (luce 12 ore/ 12 hr scuro, 21 ° C, l'intensità della luce 100 micromol / m ² / sec, umidità relativa del 40%) per consentire il seme di germinare. Crack la cupola per generare un 2-3 in apertura subito dopo il trasferimento alla camera di crescita, che contribuirà a evitare la formazione di condensa.
4. Quando la prima foglia vera raggiunge la dimensione di 2-3 mm di lunghezza, trapiantare le piantine dalla pentola per un 72-pozzetti riempiti con terreno pianeggiante.
   1. Utilizzare un dito o un puntale 1 ml per creare un 1-in depressione profonda al centro della superficie del terreno in piano.
   2. Separare delicatamente le singole piantine con il minor danno possibile radice. Prendere con cautela piantine che hanno radici intatte con una pinza.
   3. Posizionare un singolo piantina separata insieme al ciuffo terreno aderente per ridurre al minimo urto il trapianto nella depressione e tamponando delicatamente verso il basso il terreno circostante per riempire la depressione. Eliminare le piantine in più e il suolo in contenitore per rifiuti biologici e smaltire a normacon le linee guida locali di smaltimento dei rifiuti a rischio biologico.
   4. Acqua piantine trasferito dalla parte superiore e completamente coprire il piatto con una cupola trasparente spruzzato acqua per mantenere 80-90% di umidità. Mantenere la cupola per 3 giorni, poi rompere la cupola la mattina del giorno 4 e rimuovere completamente entro la fine di quel giorno.
      Nota: Sementi possono essere alternativamente svolte da semi stratificando in 1,5 ml provette contenenti 1 ml 0,1% agar per 48 ore a 4 ° C seguita da trasferimento 2-3 semi con una pipetta di vetro su un 72-pozzetti piatto riempito con terreno. Case devono essere coperti con una cupola trasparente che può essere rimossa una settimana dopo la germinazione. Piantine in più possono essere rimossi per lasciare un solo piantina per pozzetto.
5. Piante acquatiche ogni due giorni di immersione appartamenti a 1-in acqua per 20 minuti, poi scolare l'acqua in eccesso.
   Nota: l'intervallo di tempo per l'irrigazione delle piante dipende l'umidità della stanza di crescita e deve essere determinata la based sull'osservazione costante di struttura crescita delle piante dell'utente. Controllare le piante ogni giorno per assicurarsi che siano ben innaffiate. Se solo pochi punti si stanno prosciugando, acqua quelle piante dall'alto con una bottiglia spruzzo.
6. Eseguire saggi di infezione patogeno (Fase 3-5) su piante che sono in prossimità o di sviluppo stadio # 3,50 (quando la dimensione rosetta è il 50% dimensione finale), il che corrisponde a 3-5 settimane di età in base alle condizioni di crescita (fotoperiodo, temperatura). Non infettare le piante dopo infiorescenza nascita (fase # 5) a causa della comparsa di resistenza legate all'età ^38,39.

2. Preparazione di cultura dei media e Piastre

1. Fare 1 L di B King (KB) mezzo liquido. Mescolare delicatamente 20 g peptone proteoso e 2 g di fosfato di potassio triidrato bibasico utilizzando un bastoncino magnetico con 1.000 ml di H _{2 O} deionizzata fino a quando non vi è alcun pellet visibile. Aliquotare 100 ml in 150 ml e bottiglie di vetro autoclave su un ciclo liquido 20 min.
2. Prepararepiastre di coltura con terreno solido KB.
   1. Mescolare delicatamente H 20 g proteoso Peptone, 2 g di potassio fosfato dibasico triidrato e 15 g Agar con 1.000 ml deionizzata ₂ O. Autoclave.
   2. Raffreddare il mezzo su un piatto mescolare magnetica fino a quando è fresco al tatto per ridurre al minimo la formazione di condensa e futuro evitare il degrado degli antibiotici. Aggiungere 18 ml sterile 80% glicerolo con 5 ml sterili 1 M _MgSO4 al mezzo. Dato che Psm ES4326 porta resistenza contro streptomicina, aggiungere streptomicina nei media raffreddati ad una concentrazione finale di 50 pg ml ^{- 1.}
   3. Versare le piastre. Preparare due diverse misure di piatti supporti KB: 100 mm x 15 mm e 150 mm x 15 mm e piatti Petri. Il Petri piatto contenente il mezzo più piccola funge da piastra di coltura dei batteri primarie, e la piastra di Petri più grande funge batteri contare piatto.
      Nota: per i batteri conteggio piatti, piatti a forma rettangolare possono essere utilizzate per ridurre lamateriali di consumo costano in quanto il doppio dei trattamenti possono essere tracciati per piastra rispetto ai piatti rotondi tradizionali.
      1. Versare le piastre prima dell'esperimento infezione. Conservare le piastre KB medie a 4 ° C per un massimo di 2-3 mesi dal streptomicina solfato perde gradualmente l'attività antibiotica ^40.

3. Maggiore Malattia suscettibilità (EDS)

1. Giorno 1 - batteri Streak sulla piastra
   1. Due giorni prima del test EDS, striscia Psm ES4326 da -80 ° C stock di glicerolo su una piastra di coltura batterica KB-Strep e incubare a 28 ° C per 24-48 ore.
2. Giorno 2 - avviare la cultura e piante acquatiche liquidi
   1. Avviare la coltura liquida in una provetta sterile con 4 ml di liquido KB mezzo contenente 50 ug ml ^{- 1} streptomicina e agitare a 250 rpm, 28 ° CO / N.
      Nota: Per EDS analisi infezione, utilizzando 6 piante per genotipo è suggerisceed. Per STI e MTI test, si raccomanda di 6 piante per genotipo per il trattamento. Per l'inoculo batteri, si raccomanda di utilizzare una coltura fresca liquido con densità ottica a _600nm λ tra 0,3 e 0,6.
   2. Mark piccioli delle foglie numero 5 e 6 con un pennarello impermeabile smussato-end per una facile identificazione dei tessuti infetti a campionamento (Figura 1). Per migliorare l'apertura degli stomi e facilitare l'ingresso della soluzione di agente patogeno nella foglia, innaffiare le piante ben immergendo il piatto dal fondo per 20 minuti, poi scaricare l'acqua in eccesso.
      Nota: In alternativa, coprire il piatto con una cupola trasparente e immergerlo in acqua per 2-4 ore per aumentare l'apertura degli stomi.
   3. Giorno 3 - diluizione agenti patogeni e la siringa infiltrazione
      Nota: infezione patogeno durante le ore del mattino è ottimale per la proliferazione degli agenti patogeni e lo sviluppo dei sintomi della malattia più pronunciati su genotipi sensibili. Fare ogni sforzo per mantenere la infettaretempi di ioni coerente per eliminare l'effetto dei ritmi circadiani e regolazione genica diurno ^41,42, che aiuta a ridurre la variabilità tra le repliche sperimentali.
      1. Pellet coltura batterica in una microcentrifuga tubo da 1,5 ml a 9.600 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Risospendere il pellet batterico con 1 ml di soluzione sterile 10 mM MgCl _2.
         Nota: cationi magnesio può migliorare la motilità e l'adesione di P. syringae ^43. In alternativa, utilizzare _MgSO4 alla stessa concentrazione. Acqua sterile è un sostituto accettabile per le soluzioni saline Mg.
      2. Diluire la sospensione batteri con 9 ml di 10 mM MgCl ₂ in una provetta da centrifuga da 50 ml e di misurare la densità ottica (OD) di batteri con λ = spettrofotometro a 600 nm. Diluire i batteri con 10 mM MgCl ₂ al OD _600nm finale = 0.0002 per EDS test infezione.
      3. Infiltrati nella fogliacon 1 ml siringa senza ago punta smussata (comunemente noto come la siringa insulina) che contiene la soluzione diluita batterica.
      4. Non riempire la siringa fino alla sua massima capacità. Riempire con 0,5-0,6 ml per consentire un controllo molto migliore durante il processo di infiltrazione.
      5. Esporre la superficie inferiore del foglio sulla parte superiore del dito indice, e quindi regolare la posizione delicatamente foglia con l'aiuto di pollice. Posizionare la siringa in posizione verticale contro la superficie del foglio per assicurare che la pressione è uniformemente distribuita. Cercate di evitare la zona nervatura centrale durante l'infiltrazione per ridurre i danni foglia.
      6. Spingere lentamente lo stantuffo per infiltrarsi soluzione batterica; ingresso liquido nel mesofillo foglia verrà visualizzato come indicato dal colore delle foglie più scuro. Tentativo di infiltrazione tutta la superficie della foglia. Se questo non viene realizzato in un unico tentativo, scegliere un altro punto infiltrazione e ripetere le operazioni sopra descritte finché l'intera superficie del foglio è coperto.
      7. Una volta completato, asciugare delicatamente la foglia con carta assorbente per rimuovere la soluzione patogeno supplementare. Ispezionare visivamente il tessuto fogliare infetta per danni.
         Nota: L'impressione siringa circolare non deve essere visibile dopo l'infiltrazione è completa.
      8. Lasciare le piante infiltrati asciugare per 1-2 ore prima di restituirli nelle loro condizioni di crescita originali. Successivamente, spruzzare una cupola trasparente con acqua e coprire le piante infette per 2 ore, poi rompere la cupola per generare un 2-3 in apertura e lasciarlo acceso per tutto il resto dell'esperimento infezione.
         Nota: Poiché P. syringae non è un patogeno nell'aria, non vi è alcun rischio di diffusione dell'agente infettivo ad altre piante coltivate nella stessa struttura. Tuttavia, come ulteriore precauzione, evitare il contatto fisico tra piante infette e di altri impianti sperimentali situati nelle vicinanze. Coprendo il piatto con una cupola trasparente aumenterà la virulenza degli agenti patogeni e accelerare la progressione della malattia. Ilhanno bisogno per esigenze questo passaggio e la durata ottimale del periodo di copertura deve essere determinato in base alle condizioni di umidità di impianto crescita delle piante dell'utente.
   4. Giorno 5 - Pre-asciugare i piatti dei media
      1. Prendere le piastre 150 mm x 15 mm KB dall'unità di conservazione frigorifera e asciugare qualsiasi preesistente condensa sulla piastra. Lastre secche di tenerli a temperatura ambiente per circa 24 ore. Per accelerare questo processo, metterli in una cappa a flusso laminare con i loro coperchi incrinate per 30-60 min.
         Nota: Questo passaggio è fondamentale per la formazione di goccioline circolare sulla superficie della piastra nella fase successiva.
   5. Giorno 6 - Quantificare la crescita dei patogeni
      Nota: La seguente procedura di quantificazione patogeno può essere effettuata in precedenti momenti dopo l'infezione per confermare la stessa quantità di batteri vengono consegnati in foglia, soprattutto quando le piante hanno alterato foglia morfologia.
      1. Elaborare il tessuto infetto dopo la nascitadella clorosi indicato dalla ingiallimento del tessuto infetto nei genotipi suscettibili, ma prima dello sviluppo di lesioni necrotiche (Figura 2B).
         Nota: consigliato tempo di campionamento è di tre giorni dopo l'inoculazione patogeno. Tuttavia, poiché la crescita patogeno dipende da una serie di fattori ambientali, la lunghezza di incubazione può variare in un intervallo di 2 ½-½ 3 giorni e deve essere determinato da attente osservazioni della progressione dell'infezione in funzione della crescita delle piante dell'utente.
         1. Preparare 6 tubi di frantumazione per ciascun genotipo (Figura 1). Mettere una macinazione in acciaio inox palla e aggiungere 500 microlitri sterile 10 mM MgCl ₂ in ciascun tubo.
         2. Rimuovere il foglio infetto dalla pianta e punzone un disco foglia con un punzone di carta 1 foro (Figura 1).
            Nota: Per ridurre al minimo l'errore di campionamento, provare a pugni ogni foglia campionato nella stessa posizione. Il campionamento del disco foglio dall'altodella foglia è raccomandato.
         3. Casualmente posizionare 2 dischi fogliari (da due impianti diversi) in ciascun tubo di rettifica con pinze.
         4. Sigillare la provetta e omogeneizzare il tessuto con un omogeneizzatore ad alta produttività a velocità massima (1600 colpi al minuto) per 10 min. Ripetere questo processo, se necessario, fino a quando il tessuto è ben omogeneizzato e le soluzioni diventano verdi a causa di liberazione clorofilla dalle foglie infette.
      2. In attesa del omogeneizzazione, riempire le prime 6 righe di una piastra di coltura a 96 pozzetti con 180 microlitri 10 mM MgCl _{2 utilizzando} una pipetta multicanale e un serbatoio pipettaggio.
      3. Dopo la molatura, trasferire 20 ml di sospensione di tessuto terra nella prima riga della piastra a 96 pozzetti e mescolare pipettando ripetuto il liquido su e giù. Se i piccoli frammenti di tessuto intasare la punta, la clip è di 2-3 mm per aiutare acquisire il corretto volume della soluzione.
         1. Per fornire spazio sufficiente per la goccia sul o superioref la piastra, spazio tessuto da differenti genotipi nelle righe alternative (Figura 1). Per preparare una volte dieci diluizioni seriali, trasferire 20 microlitri liquido nella seconda fila e ripetere la procedura fino al sesto diluizione.
      4. Trasferimento 20 microlitri della soluzione dalla piastra a 96 pozzetti sul x 15 mm KB piatto 150 millimetri con punte per pipette divise (Figura 1). Lavoro dalla sospensione più diluita alla concentrazione più elevata.
         Nota: Procedendo da più diluita a più alta concentrazione permette di evitare di cambiare le punte delle pipette tra le diluizioni. Se la piastra è ben pre-essiccato, la gocciolina trasferito dovrebbe rimanere intatto sulla parte superiore del mezzo fino ad assorbimento (di solito 15-30 min). Il tempo di essiccazione varia con l'RT e l'umidità.
      5. Asciugare la piastra a temperatura ambiente con il coperchio rotto. Una volta non più liquido può essere osservato sulla superficie della piastra, chiudere il coperchio, capovolgere e incubare la piastra a temperatura ambiente o un incubatore a 28 °.
      6. Incubare le piastre per 40-60 ore fino a quando le colonie diventano visibili. Verificare che la crescita sulle piastre riflette il prevedibile 10 volte goccia in unità formanti colonie (ufc) (Figura 2C). Contare i batteri prima che invadere e fondono colonie. Determinare il numero di batteri in diluizione più basso che non hanno colonie sovrapposte. Di solito, la diluizione preferito da contare conterrà tra 10-50 colonie.
         Nota: variazione può essere presente tra le repliche tecniche; Pertanto, la diluizione più basso per ciascun replicato deve essere determinato separatamente.
      7. Per calcolare i livelli di proliferazione batterica, documentare il numero della riga (R), così come il numero dei batteri all'interno ciascun replicato tecnica (T) per iscritto. Determinare il numero di colonie un'unità di formatura - ufc / disco sfogliare la formula: disco ufc / foglia = (T × 10 ^R / 20) × 500 secondi
      8. Digitare i dati nel seguente modello di foglio di produCe una grafico (Figura 1) (per file di modello di analisi dati del foglio, vedi Tabella 2). Ciascun punto dati sono rappresentati come media di sei replicati tecnici su scala logaritmica. Le barre di errore rappresentano il 95% intervallo di confidenza della media (n = 6).
         Nota: Il calcolo degli intervalli di confidenza al 95% deve essere regolata in base al numero di repliche tecniche.

4. Immunità SA-Triggered (STI)

1. 1 ° giorno: Seguire la stessa procedura descritta al punto 3.1.
2. 2 ° giorno: Oltre a innaffiare le piante e l'avvio della coltura batterica liquido (punto 3.2), induce resistenza da applicazione esterna di SA derivato sodio salicilato ^21.
   Note: Pure SA ha scarsa solubilità in acqua e richiede la preventiva regolazione del pH, quindi non è consigliabile per questo test.
   1. Per indurre le difese SA-mediata contro P. syringae e primi impianti per l'infezione futuro ^21,24, impianti di verniciatura con una nebbia sottile di 1 mm di sodio salicilato o H _{2 O} (come) finto 16-24 h prima che l'infezione patogeno.
3. Giorno 3: Preparare la diluizione patogeno per OD _600nm = 0.001 e spingere i batteri in tutta la superficie del foglio da siringa infiltrazione (Step 3.3).
4. Giorno 6: Per patogeno quantificazione e processo di conteggio, seguire la procedura descritta per il saggio EDS (Piazza di 3.4 e 3.5). Campioni separatamente pretrattati - Piastra e contare il H _{2 O e} salicilato di sodio. Per wild-type Arabidopsis, una riduzione 1-2 log in crescita dei patogeni è previsto nei sodio Salicilato - piante pretrattati.

5. MAMP-Innescato Immunity (MTI)

Nota: In questo saggio, usiamo Arabidopsis wild-type Col-0 e mutanti FLS2 e EFR piante. FLS2 e EFR sono membrana plasmatica-localizzato modello recettori Recognition (PRR), che in grado di riconoscere e flg22 elf18, faucibusctively ^9,10. Perdita di ogni PRR risultati nella insensibilità al tipo specifico di MAMP, indicato dalla crescita patogeno inalterato nel mutante seguente MAMP pre-trattamento esterno e la siringa infiltrazione con PSM ES4326.

1. Giorno 1 e 2: Seguire la stessa procedura descritta al punto 3.1 e 3.2.
2. 3 ° giorno: pretrattamento MAMP patogeni e infezioni
   1. Per stabilire la Immunità MAMP-Innescato, preparare 1 mM soluzione flagellina epitopi flg22 o EF-Tu epitopi elf18 e siringhe infiltrarsi in tutta la superficie del foglio 4 ore prima che l'infezione patogeno (Piazza 3.3.3-3.3.6). Ciò consentirà per l'induzione delle difese MAMP mediata contro P. syringae e adescare le piante per future infezioni ^6,37.
      Nota: i dati di microarray pubblicamente disponibili rivelato la riprogrammazione massima trascrizionale di geni responsivi MAMP accade 4 ore dopo flg22 o elf18 trattamento ^37,44. Così, 4 hr è raccomandatodurata del MAMP pretrattamento che si traduce nel raggiungimento di una chiara differenza nella crescita dei patogeni tra MAMP trattati Col-0 e FLS2 e EFR mutanti.
   2. Rimuovere la soluzione in più MAMP con carta assorbente e lasciare le piante scoperte per accelerare il processo di assorbimento del liquido all'interno della foglia. Per spiegare l'effetto ferimento dalla siringa pressione infiltrazione, infiltrarsi H _{2 O} nelle foglie delle piante di controllo.
   3. Preparare la diluizione patogeno per OD _600nm = 0.001 e spingere i batteri in tutta la superficie del foglio di MAMP / _H 2 O foglia da siringa infiltrazione pre-trattati (Step 3.3).
3. Giorno 6: Per patogeno quantificazione e processo di conteggio, seguire la procedura come descritto al punto 3.4 e 3.5. Targa e contare il O H ₂ e campioni MAMP-pretrattati separatamente. In wild-type Arabidopsis, una riduzione 1-2 log in crescita dei patogeni è prevista per gli impianti MAMP pretrattati, con un po 'forteriduzione er mediato da flg22 rispetto al elf18.

Risultati

Il protocollo che descriviamo qui rappresenta un P. ottimizzata syringae assay siringa infiltrazione per valutare quantitativamente la risposta immunitaria in piante di Arabidopsis. Come illustrato nella figura 1, l'infiltrazione siringa Psm ES4326 è seguita da estrazione patogeno e quantificazione mediante diluizioni seriali e colonie enumerazione.

Come descritto al punto 3 nel testo protocollo Enhanced Malattia susc...

Discussione

Con la diminuzione a disposizione terreni agricoli e l'aumento della popolazione, i ricercatori di tutto il mondo sono sfidati con le esigenze urgenti per il miglioramento delle colture. Il rendimento può essere notevolmente influenzato da vari stress biotici e abiotici. Tra questi, l'infezione patogeno è una delle principali cause di riduzione della resa delle colture, responsabile di circa il 12% delle perdite solo ⁴⁵ negli Stati Uniti. Per risolvere questo problema, la ricerca massiccia è stata ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MetroMix 360	Grosouth	SNGMM360
Large pots	Grosouth	TEKUVCC10TC
12 x 6 Inserts	Grosouth	LM1206
11x 21 Flats with no holes	Grosouth	LM1020
11x 21 Flats with holes	Grosouth	LM1020H
Vinyl propagation domes	Grosouth	CW-221
Proteose Peptone	Fisher Scientific	DF0122-17-4
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate	MP Biomedicals	151946
Agar	Fisher Scientific	A360-500
Streptomycin sulfate	Bio Basic Inc	SB0494
100 x 15 mm Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875713
150 x 15 mm Petri dishes	Fisher Scientific	R80150
Rectangular plate	Fisher Scientific	12-565-450
MgCl2 Hexahydrate	Bio Basic Inc	MB0328
Glycerol	Bio Basic Inc	GB0232
MgSO4	Bio Basic Inc	MN1988
1 ml syringe	Fisher Scientific	NC9992493
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666-A
Grinding tubes	Denville Scientific	B1257
Caps for grinding tubes	Denville Scientific	B1254
Stainless steel grinding ball	Fisher Scientific	2150
96-well plate	Fisher Scientific	12-556-008
Sodium Salicylate	Sigma Aldrich	s3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)	Genescript	Made to order
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	Genescript	Made to order
Hole puncher	Staples	146308
Biophotometer plus	Eppendorf	952000006
PowerGen High-Throughput Homogenizer	Fisher Scientific	02-215-503
Accu spin micro centrifuge	Fisher Scientific	13-100-675
Multichannel pipette (10-100 µl)	Eppendorf	3122 000.043
Multichannel pipette (30-300 µl)	Eppendorf	3122 000.060
Pipette (20µl)	Eppendorf	3120 000.038
Pipette tips	Fisher Scientific	3552-HR
Sharpie permanent marker	Staples	507130
1.5 ml tube	Eppendorf	22363204
Forceps	Fisher Scientific	08-890