HIV kaynaklı Nöroinflamasyondan bir Fare Modeli İki foton Mikroskop kullanarak Serebral Vasküler Mimarlık Niceleme

Özet

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Özet

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

Giriş

İnsan Bağışıklık Yetmezliği Virüsü 1 (HIV-1) virüs enfeksiyonunun akut fazında beyni işgal ve verimli onların aktivasyon yol mikroglia ve beyin ikamet makrofajlar hem bozar - ve her iki konak kaynaklı inflamatuar mediatörlerin ve çözünür HIV-1 serbest bırakma Böyle Tat ve ^(1,2 gözden) gp120 olarak virotoxins. Sonuç olarak, kronik nöroenflamatuar devlet HIV-1 İlişkili Nörokognitif Bozuklukları (EL) ^3-5 patogenezine katkıda düşünülmektedir MSS içinde kurulmuş olur.

HIV-1 Tat veya farelerin merkezi sinir sistemi içinde, interlökin (IL) -17A arasında kronik aşırı mikrovasküler seyrelmesi ^6,7 ile sonuçlandığı gösterilmiştir. Bu kronik Nöroenflamasyon serebral damarlarda üzerindeki etkileri yoluyla EL patogenezine katkıda bulunabileceği ihtimalini yükseltir. Ayrıca bu soruyu incelemek için, biz serebral vasküler yapıda çalışılmıştır ölçmek için yöntemler geliştirmişlerdirtures.

Bu kağıt, kademeli bir uzunluğu, toplam kademeli bir uzunluk ve ortalama kılcal çap ve ince bir kafatası kortikal pencereden kılcal ağ şebekeleri in vivo görüntüleme kullanılarak total kılcal hacmi ve ortalama kılcal düğümleri, kılcal kesimlerinin sayısı ölçülmesi için bir yöntem tarif eder (daha önce tarif edilen modifiye protokolleri) ^8,9, hem de iki foton mikroskopi kullanılarak beyin bölümlerinin ex vivo görüntüleme. In vivo ince kafatası kortikal pencere serebral çevrenin korunması için izin verir çünkü beyin dilimleri kılcal ağları ex vivo görüntüleme rekonstrüksiyonu sağlarken Bu kombine yaklaşım, serebral vasküler parametrelerin bütünsel bir kantitatif sağlar üç boyutlu, tam kılcal ağ şebekeleri, - daha sonra ticari olarak temin edilebilen yazılımı kullanılarak belirlenebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvan Kaynakları Rochester Üniversitesi Komitesi Üniversitesi Bu yazıda yapılan tüm işlemleri onayladı.

1. Ön cerrahi hazırlanması (ve fare)

1. Gerekli tüm ekipman ile cerrahi alan hazırlayın. Önceden% 70 etanol kullanılarak işlem sırasında kullanılan tüm araçları sterilize edin. İsteğe bağlı olarak, bir cam boncuk sterilizatör kullanın veya araçları sterilize etmek otoklav.
2. Bir izofluran buharlaştırıcı bağlı bir izofluran indüksiyon odasında fare yerleştirin. 1 L / dakikalık bir hızda 4% izofluran seviyelerini ayarlayın.
   Not: astrosit-özgü glial fibriler protein (GFAP) promoteri (HIV Tat-Tg fareleri) ile tahrik edilen bir doksisiklin (DOX) uyarılabilir HIV-1 Tat transgen, burada bildirilen deneylerde, fareler için ¹⁰ HIV etkisini incelemek için kullanılmıştır Daha önce tarif edildiği gibi ^7,10 -1, serebral vasküler yapısı üzerinde nöro-inflamasyonu neden olmuştur.
3. Yavaşça ve fare gözlemlemek için indüksiyon odasına ipucu# 39; ın düzeltilmesi refleks. Düzeltilmesi refleks bastırılmış edildikten sonra,% 2 izofluran düzeyini ayarlamak ve cerrahi tezgah burun konisi indüksiyon odasından hava akışını yönlendirmek.
4. Hızla su infüzyon ısıtma pedi indüksiyon odasından fareyi hareket ettirin. Burun konisi ile izofluran (% 1.5-2) uygulanmaya devam. Solunum hızı (RR) izleme yoluyla değerlendirilen bireysel fare toleransına göre anestezi ayarlayın.
   Not: RR depresyon serebral kan akımı ve damar çapı değerlendirmesini değiştirerek fizyolojik gaz parametrelerini perturb olabilir. Dakikada 55-65 nefes arasında RR tutmaya çalışın. Kalp atım hızı (KAH), aynı zamanda anestezi derinliği değerlendirmek kullanılabilir; damar çapı fizyolojik değişiklikleri önlemek için dakikada 300-450 atım arasında HR tutun. Tipik olarak, anestezi verilen bir fare 1 L / dk 1.5-2.0 izofluran% arasında yeterli olacaktır.
5. Ayrıca anestezi derinliğini kontrol etmek için bir ayak tutam gerçekleştirin. Fare, iletişimi yanıt vermezsecerrahi girişim rüler.

İnce kafatası Kranial Window 2. Hazırlık

1. Fare gözlerine yapay gözyaşı jeli uygulayın. Tamamen makas veya elektrikli tıraş makinesi kullanarak fare derisi saç kaldırmak.
2. Povidon-iyot çözeltisi uygulayarak saç derisini sterilize; kurumasını bekleyin. Sonra, bir ışık mikroskobu altında, tamamen parietal kemikler işaretleme, kuyruk frontal kemik ve Bregma açığa fare derisi deri kaldırmak.
3. Kolay çıkartılması için membranlar kurutmak için kafatasına% 10 ferrik klorür solüsyonu az miktarda uygulanır. Yavaşça kafatası kazıyarak # 5/45 forseps ile kurutulmuş membranlar çıkarın.
4. Headplate pencerenin etrafında tutkal ince bir tabaka sürün. Yavaşça pencereye merkezindeki ilgi alanı tutmak, fare kafatası karşı headplate basın. Tutkal polimerize etmek headplate dental çimento bir damla uygulanır.
5. Ince bir tabaka sürünheadplate penceresinin kenarında tutkal tuzlu tutmak için bir rezervuar oluşturmak için. Tutkal kuruduktan sonra, fare headplate koşum içine headplate vida.
   Not: Bu prosedürde kullanılan fare headplate kablo demeti, bir metal taban ve iki metal sütunlu bir yapıdır. Her sütunda bir bahar ve bir kanat somun var. Headplate bahar üstüne yerleştirilir ve baş seviyesi ve hareket etmiyor kadar kanat somun sıkılır.
6. 6000 rpm'de Microtorque matkap bağlanmış bir matkap ucu ile headplate penceresinden herhangi bir tutkal çıkarın. Gemilere yapısal hasarlara neden olabilir fare kafatası aşırı ısınmasını önlemek için her 10-15 saniyede durdurun.
   1. Yeni bir matkap ucu yardımıyla, orta hatta (headplate penceresinin çapının üçte biri) yanal olarak Microtorque matkap 1,5 mm yerleştirin. 4000 rpm'de ince bu konum etrafında kafatası başlayın. Doğrudan aşağı yönlü baskı ile kafatası arasında hafifçe matkabı hareket ettirin.
   2. Kes drilling her 10-15 sn fare kafatası aşırı ısınmasını önlemek için. Bu süre zarfında, bir sıkıştırılmış hava spreyi kullanarak birikmiş kafatası tozu temizleyin.
   3. 5-10 saniye kafatası soğumaya RT tuzlu su damla. Yavaşça kafatası inceltme devam etmek yumuşak bir doku ile tüm sıvıyı çıkarın.
7. Kafatasının son incelme için, headplate haznesindeki tuzlu küçük bir hacim yerleştirin ve hafifçe küçük damarlar açıkça görülebilir kadar ilgi alanı üzerinde diş MicroBlade süpürün.

Fizyolojik Parametrelerinin 3. İzleme

1. Kafatası tamamen inceltilmiş sonra, sahibinden fare ayırmak ve sırtında üzerine yerleştirin. Yavaşça açıkça medial uyluk açığa her iki arka bacaklarını aşağı bantlayın.
2. Makas veya elektrikli tıraş makinesi ile hem medial uyluk üzerinde saç çıkarın. Povidon-iyot ile uyluk kapsayan cerrahi siteyi dezenfekte edin.
3. Femoral ven üzerinde medial sağ uyluk cilt üzerinde Pinchve arter 5. forseps kullanarak. Yavaşça yukarıya doğru çekin ve deriyi kesip cilt kaldırmak için makas kullanın.
   Not: Sol uyluk cerrahi komplikasyon (vasküler anomaliler, rüptüre damarlar) durumunda saklıdır.
4. Cerrahi siteye% 0,9 tuz yaklaşık 3-5 damla uygulayın. Bu damarların büyük büyütme, hem de damarların nemli sitesi tutmak ve önlenmesi kurutma sağlar. Açık açık iki # 5/45 forseps kullanılarak femoral nörovasküler demet içine diseksiyon ile arter femoral ven ayırın.
5. Yaklaşık 1 cm arayla femoral arter altında cerrahi sütür iki, 3 cm'lik parçalar yerleştirin. Kateterizasyon sırasında aşırı kan kaybını önlemek için yardımcı olacak bir damar turnike oluşturmak için üst dikiş saat yönünde çevirin.
6. Yaylı makas kullanılarak femoral arter küçük bir kesi yapmak. Kateter arter içinde sıkıca kadar kesi ve peşin yoluyla arter kateteri yerleştirin.
7. sızıntı ve uygun kateter yerleştirme değerlendirmek için üst sütür (turnike) açılmak. Sütürler kullanılarak geminin içindeki kateter etrafında iki knot bağlayarak femoral artere kateter sabitleyin.
8. Kan pıhtılaşmasını önlemek için kateter ile heparin 10 ul (100 lU / ml) enjekte edilir. Sonra, cerrahi basit bir kesintiye desen 4-0 sütür ile birlikte cildi dikerek sağ uyluk kapatın.
9. Intraperitoneal sağ alt kadranda içine üretan 50 ul (1.2 mg / g) enjekte edilir. Beş dakika sonra intraperitonal üretan 100 ul bir toplam sol alt kadrana bir 50 ul enjeksiyon ile tekrarlayın. Eşzamanlı anestezi derinliği için fare tekrar kontrol ederken yavaşça yaklaşık% 0.25 izofluran seviyesini düşürür.
   Not: bağırsakları perfore kalmaması arka karın duvarı boyunca periton boşluğu içinde yüzeysel iğne tutun. Bu karın rektus mu kısma yapılabiliruzak iç organlardan ve sonra enjekte scles.
10. Kılcal tüp kullanarak, kateter arter kan 40 ul örnek toplamak. Bir tuzlu dolu dört yollu ve heparin şırınga ile donatılmış kan basınç dönüştürücü kateter takın.
11. Kateterin istenmeyen kaldırılmasını önlemek için cerrahi alete tansiyon dönüştürücüyü bantlayın. Ortalama arter basıncı izleme başlayın.
12. Bir kan gazı analizörü giriş portuna kan dolu kılcal tüpü yerleştirin. Tüm kan ekstre edildikten sonra, giriş portundan kılcal tüp kaldırmak. _O 2 ve CO ₂ kan gazları, kan gazı analizörü yazdırılan bir kağıt üzerinde görünecektir.

Floresan Boya 4. Enjeksiyon

1. 5. forseps kullanarak medial sol uyluk üzerinde cilt sıkıştırın. Yavaşça yukarıya doğru çekin ve deriyi kesip cilt kaldırmak için makas kullanın. Dekstran konjuge kırmızı yayan rhodamine boya hazırlayın(70 kDa) (serum fizyolojik içinde eritilmiş 10 mg / kg).
2. Femoral bağlı bir 30 G iğne ile bir 1 ml şırınga vein.Using bulun şırınga 130 ul hattına görüntüleme için uygun bir floresan boya daha önce hazırlanan çözelti çizin. Şırınga içine tamamen boya çizim ve sıkıca şırınga duvara iterek tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
   1. Viraj sert bir yüzey konik tarafı yukarı bastırarak yaklaşık 30 derecelik bir açıyla 30 G iğne. Boya ile iğne doldurun ve 100 ul örneği bırakarak, herhangi bir aşırı sıvı atın.
3. Yavaş yavaş femoral ven içine boya 100 ul örneği enjekte edilir. İğneyi çıkardıktan sonra, herhangi bir kanamayı durdurmak için enjeksiyon siteye sürekli hafifçe baskı uygulayın. Boya 5 dakika dönmesine izin verin.
   Not: alternatif, sağ femoral ven başka cerrahi sitenin yaratılması yoluyla daha fazla kan kaybını önlemek için floresan boya enjeksiyon için yerine kullanılabilir. Buna ek olarak, eğerHayvan cerrahi siteden kontrolsüz kanama, bu çok fazla heparin kateteri yıkamak için verildiğini bir göstergesi olabilir. Orada 10-15 dakika içinde hiçbir pıhtılaşma ve fare kanama hala devam ediyorsa, yeni bir fare ile deney yeniden başlatmayı düşünün.
4. Daha sonra dikkatli bir şekilde mide üzerine fareyi çevirmek, 4-0 sütür ile birlikte cildi dikerek sol uyluk kapatın ve fare headplate koşum içine yerleştirin.

Vivo İki-Foton Görüntüleme 5.

1. Sürekli anestezi seviyesini korumak için emin olun, iki foton mikroskop cerrahi cihazı taşıyın. Headplate rezervuar içine% 0,9 tuz az miktarda koyun ve tuzlu su ile temas, böylece mikroskop objektif indirin. Aydınlık görüntüleme objektif kullanılarak ilgi alanı bulun
2. Floresan boya için uygun bir dalga boyuna iki-fotonlu lazer uyarımı ayarlayın. 25x o kullanan iki foton görüntüleme başlayınbjective.
   Bu deneylerde 780 nm'lik bir dalga boyunda heyecan bir kırmızı ışık rodamin boya konjüge edilmiş bir dekstran kullanılan unutmayın. Emisyon filtresi bandpass 607/36 bir boya floresans tespit etmek ve emisyon filtresi bandpass 480/20 arteryal otoflüoresan tespit etmek için kullanıldı
3. Görünümü ekranda yatak bir kılcal bulun ve iki foton görüntüleme yazılımı kullanarak kılcal damarların optik zoom 2. Edinme görüntüleri kullanarak bu bölgeyi büyütmek.
4. Görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra, dekapitasyon servikal dislokasyon ile fare kurban.

6. Ex Vivo İki Foton Görüntüleme

1. Ekstra ince makas kullanarak, fare frontal kemikler interparietal kemikleri kafa derisi bir kesi yapmak. Işaretçi parmak ve başparmak ile kafatası kenarlarına cilt sabitleyin.
2. Medial interparietal kemik altında ekstra ince makas yerleştirin ve sagital sütür boyunca kafatası kesti. Bregma işaretleme sonra yaklaşık 3 mm kafatası kesme durdurun.
   Not: Beyni kesilmesini önlemek için kafatası keserken yukarı yönlü baskı uygulayın.
3. # 5 forseps kullanarak, beyinden gelen kafatası ayırmak ve dikkatle beynin yüzeyine herhangi meninksler kaldırmak. Kalan Meninksler yanlışlıkla beyin lacerate olabilir; Aşırı bakım Bunu önlemek için alınmalıdır. Beyin kafatası boşalana kadar yavaşça yavaşça ileri ilerleyen beynin altında 5. forseps kaydırın.
   Not: aşağı yönlü baskı beyin delinmesiyle önlemek için kullanılması gerektiğini söyledi.
4. Fareler için belirli bir beyin kesit aracı beyin yerleştirin. Beynin üzerinde yapay beyin omurilik sıvısının damla uygulayarak beyin yıkayın.
5. Bregma bregma 0 dan beynin 2 mm koronal bölümü çıkarın -2. Yukarı bakacak 0 bregma ile yapay beyin omurilik sıvısı içeren içbükey cam slayt üzerine koronal bölümü (bölümün en kafatası parçası) yerleştirin. Yavaşça beyin sl kapakBir cam kapak slip ile buz.
   Not: Bu damar mimarisini deforme olabilir bir kez beyin bölümünde yer cam basarak kaçının.
6. Mikroskop sahneye slayt aktarın ve kapak kayma% 0,9 tuz az miktarda koyun. Bu tuzlu su ile temas edene kadar mikroskop objektif indirin. Aydınlık objektif kullanarak beynin orta hat bulun.
7. İki foton görüntüleme başlayın ve tekrar 25x objektif kullanarak orta hat bulun. Koronal bölümün kortikal yüzeyinde boyuna fissür arayarak bunu gerçekleştirmek. Orta hat üzerinde görüntüleme ekranın sağ kenarına yerleştirin ve yanal üç tam kare (orta hattan yaklaşık 1.5 mm) izleyici ekran üzerinde hareket.
   Bu deneylerde, görüntüleme parametreleri adım 5.2 not belirtilenlerle aynı olduğunu not edin.
8. Kılcal damarlar görünümü ekranda zorlukla görülebilir hangi derinliğe bulun. Odak ilave 20 uçağı düşürünmikron z-yığınının üst belirlemek için.
9. 1 mikron görüntü kalınlığı ayarlayın. 100 um için görünüm ekranı indirin ve piksel% 1'den az doygun olduğu gibi boyunca lazer gücünü ayarlamak.
   Not: z-yığın görüntüleri 100 ardışık 500x500x1 um görüntülerin bir dizi derlenmektedir. Daha doğru post işleme hesaplamaları olacak z yığın büyük. Genellikle, 100 mm veya daha büyük bir z-yığını toplamak için çalışmayın.
10. Bitişik XY simgesi ardından XY tekrarlayın simgesine basın. Z-yığın tamamlandığında, Seri Bitti simgesine basın ve dosyayı kaydedin.

7. Veri İşleme

1. ImageJ yazılım in vivo kapiler görüntüyü açın. Elle iki foton yazılımı elde edilen değerlere dayalı uzaktan oranı piksel olarak ayarlayın.
   1. Araçlar menüsünden * düz * simgesini seçin. Oppo bir kılcal duvardan uzanan bir çizgi çizinsitesi kılcal duvar ve ImageJ tarafından sağlanan uzunluğu kaydedin.
      Bu açık bir şekilde, kapiler duvarlardan kenarlarını görselleştirmek amacıyla görüntüyü yakınlaştırmak için gerekli olabileceğini not edin.
   2. Kılcal boyunca farklı yerlerde adımı yineleyin 7.1.1, yanı sıra görüntüde birden kılcal damarlar.
2. Böyle Amira gibi analitik yazılım içine z yığın dosyasını açın. Alt uygulama araç çubuğundan Filament Editör simgesini seçin
   1. Üst veya z-yığının altına ya yaklaşık 20 Move izleyiciyi izleyici kalınlığını ayarlayın.
   2. İz simgesini seçin ve yüklenen görüntü üzerine imleci. Şekil 2C açıklanan yerlerde kılcal damarların yerleştirin düğümleri; segmentler otomatik komşu düğümler arasında görünecektir. Tüm z-yığınının boyunca kılcal Trace.
      Not: thr kılcal izlemek için uç noktaları ve şube noktaları arasında düğümleri yerleştirmek için gerekli olacaktırZ-yığın oughout.
   3. Bu düğümler kaldırmak için, Ara Kaldır simgesini tıklatın.
      Not: Bu Kaldır Seçili simgesini seçerek Seç Tek simgesini kullanarak döngü seçerek ve elle kaldırılması gerekir hatalı döngüye segmentleri oluşturabilirsiniz. Döngüler izleme sırasında aynı bölgede görünmeye devam ederse, bu düğümlerin farklı kılcal damarların yerleştirildi olasıdır.
   4. Izleme tamamlandıktan sonra, otomatik olarak ayıklanır vasküler parametreleri içeren bir elektronik tabloyu açmak için Graph Bilgisi simgesini seçin. Düğümleri ve segment sayısının ana görünümü ekranda mevcuttur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

İnce kafatası kortikal pencere kortikal kılcal damarların in vivo iki foton görüntüleme (Şekil 1) sağlar. Görüntüye uygun alan çok sayıda, farklı kılcal (Şekil 1A) gösterir. Aynı görüş alanında, herhangi bir arteryel hücre duvarı otofloresansı vardır ve ikinci harmonik üretimi ¹¹ (Şekil 1B) ile indüklenen örneğin kolajen floresan gibi diğer floresan sinyalleri, söz konusu olabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada tarif edilen yöntem, deneysel modeller / ayarları geniş bir beyin mikrovasküler yapılarını analiz etmek için uygulanabilir. Bu yöntemin başarılı olması için, üç kritik adım hakim olması gerekmektedir. İlk olarak, ince kafatası penceresi kafatası ya da altta yatan beyin zarar vermemelidir. Bu inceltme sırasında kafatası delinme ya da ısı kaynaklı damar kaçağa neden kolaydır. Floresan boya odak düzlemi içine sızabilir ve kılcal belirsiz gibi bu görüntüleme engelleyebilir. Kafata...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica Microscope	Leica Inc.	MZ8
High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner	180
Heating Pad	Stryker	TP3E
T/PUMP	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer	Datex Ohmeda	447
Artificial Tear Gel	Butler AHS	7312
Povidone-Iodine solution	Aplicare	52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Ferric Chloride Solution	Ricca Chemical Company	3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel	Henkel	45404
Dental Cement	Stoelting	51459
Microtoruqe II Handpiece Kit	Pearson Dental	R14-0002
005 Burr for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05
Norland Blade (Dental Microblade)	Salvin Dental	6900
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Group 2B Carcinogen
Braided Suture	Ethicon	735G
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Arterial Catheter	SAI Infusion Technologies	MAC-01	The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.
Blood Pressure Moniter	World Precision Intruments	SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable	World Precision Intruments	BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer	Siemens	248
40 μl Capillary Tube	VWR	15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)	Invitrogen	D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Spectra-Physics
ImageJ Software	National Institutes of Health (NIH)		Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software	Visage Imaging