Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

Özet

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Özet

Xenopus laevis (kurbağa), pronephros, embriyonik böbrek tek nefron oluşur ve böbrek hastalığı için bir model olarak kullanılabilir. Xenopus embriyolar dışarıdan geliştirmek, büyük ve kolayca mikroenjeksiyon veya cerrahi işlemler tarafından manipüle edilebilir. Buna ek olarak, kader haritaları erken Xenopus embriyolar için kurulmuştur. sonuçta bir organa veya ilgili dokuya sebebiyet verecek bağımsız blastomere hedefli mikroenjeksiyon seçici gelişen embriyonun geri kalan ikincil etkilerin azaltılması, aşın ya da, bu sınırlı bölge içinde gen ekspresyonunu yıkmak kullanılabilir. Bu protokol, biz 4 ve 8 hücreli embriyolar belirli blastomer içine mikroenjeksiyon yoluyla gelişen Xenopus böbrek (pronephros), hedef kurulan Xenopus kader haritaları nasıl kullanılacağını açıklar. soy izleyicilerin enjeksiyon enjeksiyon spesifik hedefleme doğrulamasına imkan sağlar.Embriyolar 38 evresine kadar gelişti sonra - 40 tüm montaj immün Pronephric gelişimi görselleştirmek için kullanılır ve pronephros hedeflenen hücrelerin katılım değerlendirilebilir. Aynı teknik pronephros ilave olarak diğer doku tiplerini hedef uyarlanabilir.

Giriş

Xenopus embriyonik böbrek, pronephros, böbrek gelişimini ve hastalığın incelemek için iyi bir modeldir. Embriyolar, harici olarak geliştirilmesi büyük boyutta, çok sayıda üretilebilir ve kolayca mikroenjeksiyon veya cerrahi prosedürler ile işlenir. Buna ek olarak, memeliler ve amfibiler böbrek gelişimini yöneten genler korunur. Embriyonik amfibiler bir pronephros var ve yetişkin amfibi bir metanephros varken, pronephros, mesonephros ve metanephros ^1: Memeli böbrekler üç aşamadan yoluyla ilerleme. Bu, böbrek formlarının temel filtreleme birimi nefron ve memeli ve amfibi hem nefrogenezisi ^{2, 3} geçmesi, aynı sinyal iletim ve endüktif olaylar. Xenopus pronephros proksimal, orta ve distal tübülleri bağlayan oluşan tek nefron içerir, ve (memeli glomerulus benzer) glomus ^{1, 4-6} (Şekil 1 ). Xenopus pronephros tek büyük nefron, bu böbrek gelişim ve hastalık süreçlerinde rol oynayan genlerin incelenmesi için basit bir model olarak uygun hale getirir.

Hücre kader haritaları erken Xenopus embriyolar için kurulan ve serbestçe Xenbase ^7-11 online olarak mevcuttur edilmiştir. Aynı teknik, kalp ya da gözler gibi diğer hedef dokulara adapte edilebilir, ancak burada, gelişmekte Xenopus pronephros hedef soyu izleyicilerin mikroenjeksiyon için bir teknik açıklanmaktadır. Köken izleyiciler erken blastomere enjekte edilebilir, geliştirme sırasında bu hücre soyu görselleştirme sağlayan (vital boyaların, floresan etiketli dekstranlar, histokimyasal tespit enzimler, ve mRNA floresan proteinleri kodlayan dahil) etiketlerdir. Bu protokol MEM-RFP mRNA kodlama membran soy izleyici olarak, kırmızı floresan proteini ¹² hedef kullanır. Hedeflenen Mikroenjeksiyon teknolojiBurada tarif edilen 4- ve 8 hücreli embriyolar bireysel blastomerlerin için bir dizi yöntem vasıtasıyla ilgili bir geni fazla-sentezlemek üzere gen ekspresyonunu veya eksojen RNA ile yıkmak morpholinos enjeksiyon için kullanılabilir. ventral, bitkisel blastomer içine enjekte edilerek, öncelikle embriyo pronephros gelişimsel bir kontrol olarak kontralateral pronephros bırakarak, hedeflenecektir. Bir izleyicinin ko-enjeksiyon doğru blastomere enjekte edildi doğrular ve embriyoda dokular gösterir pronephros hedeflenmesi doğrulayarak, enjekte blastomer ortaya çıktı. pronephros immün Pronephric tübüller hedef alınmıştır ne kadar iyi görselleştirme sağlar. Overekspresyonu ve demonte etkiler daha sonra bir gelişimsel kontrol olarak hizmet veren embriyo, kontralateral tarafa karşı gol olabilir ve Pronephric indeksi ¹³ hesaplamak için kullanılabilir. hücre kaderinin haritaların temini bu hedefli mikroenjeksiyon tekniği oth hedef dokulara kullanılmasına olanaker pronephros ve, bir floresanlı işaretleyici birlikte enjeksiyon dışında her bir dokuya hedeflenmiş mikroenjeksiyon analiz öncesi doğrulanmasına izin verir.

Embriyo mikroenjeksiyon sırasında, gelişimsel sıcaklık, sıkı regüle Xenopus gelişme oranı o ¹⁴ oranda bağımlı olduğu verilmelidir. Geliştirme süresi yavaşlatılır için 4 ve 8-hücresi enjeksiyonu - (16 ° C 14) Embriyolar daha soğuk sıcaklıklarda inkübe edilmelidir. 22 ° C, evre 1 (1 hücreden) kalkınma anda 16 ° C geliştirme anda 3 yaklaşık 4 saattir sahneye iken 3 (4 hücreleri) yaklaşık 2 saattir sahneledi. Bu 22 ° C'de 8 hücreli (evre 4) embriyo için bir 4-hücreli embriyo gitmek için yaklaşık 15 dakika sürer, ancak 16 ° C'de yaklaşık 30 dakika sürer. Benzer bir şekilde, 22 ° C 'de, sadece bir 16 hücreli embriyo (Aşama 5) ilerleme için bir 8-hücreli embriyonun 30 dakika sürer. Bu kez 16 ° C'de 45 dakika için artırılır.refore, embriyolar, 16 hücre aşamasına kadar ilerleme önce, 8-hücre aşamasında enjeksiyon için yeterli zaman sağlamak için embriyo gelişimi hızını yavaşlatmak için yararlıdır. Buna ek olarak, büyüme sıcaklığı hız veya böbrek tam gelişmiş kadar embriyo gelişimini yavaşlatmak için modüle edilebilir.

Iribaş aşamalı Xenopus embriyoların epidermis dokusu ¹⁵ diseksiyon veya takas olmadan gelişen pronephros kolay görüntüleme için izin nispeten şeffaftır. Nedeniyle Xenopus embriyoların göreli şeffaflık, canlı hücre görüntüleme de ^16,17 mümkündür. Sonra Xenopus embriyolar ^18-20 gen ifadesinin manipülasyonu hedeflenen Pronephric gelişmenin değerlendirilmesinde izin 40 embriyolar - pronephros görselleştirmek için immün, orta distal proksimal ve sahnenin bağlantı tübül 38 etiket kurulan antikorlarla mümkündür tüm montaj.

Protokol

(: HSC-AWC-13-135 protokol #) Aşağıdaki protokol Kurumsal Bakım ve Kullanım Kurulu olarak hizmet vermektedir Laboratuar Hayvan Hastalıkları Hayvan Refahı Komitesi için Houston'ın Merkezi'nde Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

Böbrek hedefli Enjeksiyonlar için blastomer 1. Kimlik ve Seçimi

1. Embriyoların oluşturmadan önce, embriyo erken hücre bölünmeleri yönünü anlamak için Xenopus Kalkınma ²¹ Normal Tablo kullanın. Alternatif olarak, Xenbase ¹¹ Xenopus erken gelişim aşamaları erişim şemaları.
2. Mikroenjeksiyon için hedeflenen hangi blastomere seçmek için Xenbase ¹¹ interaktif Xenopus hücre kaderi haritalar erişin.
3. Tek hücreli embriyo bir koyu pigmentli hayvan kutup beyaz ve yolky bir bitkisel kutup, sahip olduğunu gözlemleyin. Not Vitellin E olarak bilinen koruyucu zar,nvelope, embriyo kapsar.
4. İlk bölünme genellikle embriyonun sol ve sağ taraf arasında meydana dikkat edin. Bu hücreler Pronephric soy eşit katkıda bulunur.
5. İkinci bölünme 4 hücreli embriyo lider, dorsal ve embriyonun ventral yarılarına ayıran unutmayın. Dorsal hücreleri daha küçüktür ve ventral hücreleri (Şekil 2A ve Şekil 3A) daha az bir pigment.
   1. Sol ve sağ tarafta, dorsal daha gelişen böbrek daha fazla katkıda (D; küçük, hafif hücreler) blastomer (Şekil 2A); ventral blastomer (büyük, koyu hücreler V) belirleyin.
   2. 4 hücreli embriyo içine enjekte ise, sol böbrek (Şekil 3A ve Bölüm 3) hedef sol ventral blastomer enjekte.
6. üçüncü bölge sekiz hücreli embriyonun sonucu, hayvansal ve bitkisel tarafı ikiye bölmektedir. Bu noktada, dört hayvan blastomerler [vardır sol ve sağ ventral(V1) ve dorsal (D1)], dört bitki blastomerler [sol ve ventral sağ (V2) ve dorsal (D2)] (Şekil 2B ve Şekil 3B).
   1. ventral, bitkisel blastomer (V2) bulun. Bu blastomer başka hücreler bu aşamada (Şekil 2B) gelişmekte böbreğe daha fazla katkıda bulunur. 8 hücreli embriyo sol böbrek hedeflemek için, sol V2 blastomer (Şekil 3B ve Bölüm 3) içine enjekte edilir.
7. Dördüncü ve beşinci bölünmelerin hayvansal ve bitkisel blastomer ikiye bölmek dikkat edin. İki döl 16 hücreli embriyo ile sonuçlanan, her blastomere oluşturulur. Hücreler kendi selefi adını taşır. Örneğin, 8-hücre evresinden itibaren V2 blastomere 16 hücreli aşamada (Şekil 2C) V2.1 ve V2.2 döl yol açar. 16-hücre aşamasında V2.2 hücrenin gelişmekte olan böbrek katkıda hücrelerin çoğunluğu içerir.
8. Altıncı ve yedinci bölünmelerin 32 hücre Embry neden NotO. Yine, iki döl onların selefi aşağıdaki adlandırılır her blastomer, oluşturulur. Örneğin, 16-hücre evresinden itibaren V2.2 blastomere 32 hücreli aşamada V2.2.1 ve V2.2.2 yol açar. Orada hücreleri (bitkisel hayvana) A, B, C ve D olmak üzere dört sıra halinde tespit edildiği 32. hücreli aşamada alternatif bir adlandırma sistemi ve dört sütun içinde 1, 2, 3 ve 4 (şekilde dorsal) ventral için. Bu nedenle, gelişmekte olan pronephros en çok katkıda bulunan V2.2.2 blastomere, bu alternatif bir adlandırma sistemi (Şekil 2D) altında C3 adlandırılır.

Embriyolar 2. Hazırlık

1. (PH-8,0% 2 sistein, NaOH) Dejelly çözeltisinden 50 ml hazırlayın.
2. Standart protokollere ^14'e göre bir tek erkek kurbağa hem testis izole edin. 0.1 M NaCI, 2 mM KCI, 1 mM MgSO _4, 2 mM; 10 mi Testis saklama solüsyonu (1 x Marc Modifiye Ringer [MMR ile dolu bir 60 mm Petri kabı içinde testisler yerleştirin_CaCl2, 5 mM HEPES, pH 8, 0.1 mM EDTA] ^12,% 1 sığır serum albümini, 50 ug / ml gentamisin). 4 ° C'de testisler saklayın.
   Not: Testis yaklaşık 7 saklanabilir - 4 ° C'de 10 gün, ancak döllenme verimliliği testis saklanmış olan daha azalır.
3. Standart protokollere ^14'e göre yumurta elde etmek için bir dişi kurbağa sıkıştırın. 100 mm Petri kabındaki yumurta toplamak. Fazla suyu dökünüz.
4. o forseps ve bir jilet kullanarak Testis Depolama Çözüm ise bir testisin ¼ kesti. yumurta içeren Petri kabı testis parçasını aktarın. Testis saklanan ne kadar süredir testis, büyüklüğüne hesabına kullanılan testis bölümünün boyutunu ayarlayın ve kaç yumurta döllenir edilecektir. Genellikle yumurta bir debriyaj döller taze disseke testis 1/3 ¼ kullanın.
5. forseps ve bir jilet kullanarak küçük parçalar halinde testis bölümünü kesmek. Yeterince 0.3x MMR eklePetri kabı + 30 mg / ml gentamisin yumurta kapsayacak. karıştırmak için çanak MMR girdap.
6. döllenme oda sıcaklığında gerçekleşmesi için yaklaşık 30 dakika bekleyin. Hayvan yarımküre (embriyonun pigmentli tarafı) etkili verimlilik üzerine embriyonun üstünde oturup unutmayın. Daha sonra, bir transfer pipeti kullanılarak Petri kabı MMR çıkarın. Embriyoların karşılamak için çanak yeterli Dejelly Çözüm ekleyin.
7. Önümüzdeki birkaç dakika içinde, yavaşça aralıklı çanak girdap. Şu anda yemeğin Dinç sallayarak ekseni kusurlarına neden olabilir.   Embriyoların jöle kat eriyecektir ve embriyolar dönen sırasında yemeğin ortasında birleştirmek olacaktır. Embriyolar yakından yemeğin ortasında birbirlerine dokunmadan sonra, bir transfer pipet yardımıyla Dejelly Çözüm kaldırın. 5 dakikadan daha uzun için Dejelly Çözüm embriyolar bırakmayın, ya da embriyolar zarar görebilir.
8. 0.3x 5 kez - dejellied embriyolar 3 yıkayındikkatlice dökerek veya MMR kapalı pipetleme ve yeni MMR ile çanak doldurarak MMR + 30 mg / ml gentamisin. çanak MMR tüm çıkarmayın ya da embriyolar zarar görebilir.
9. Bir transfer pipet kullanarak Petri kabı herhangi bir gübresiz yumurta ya da testis parçaları çıkarın.
10. 14 ve 22 ° C arasında embriyolar inkübe edin.
    Not: düşük sıcaklıklarda yetiştirilen Embriyolar yüksek sıcaklıklarda yetiştirilen embriyolar daha yavaş gelişir. Gelişim aşamaları Zamanlama Xenbase ²² bulunabilir.
    1. gelişim üzerinden alanı için, bir Petri kabı içinde tek bir döllenme embriyoların yerde yarısı 14 ° C 'de tutulur ve bir Petri tabağına embriyoların yarısı 18 ° C'de tutuldu. Bu, tek bir gübreleme 4-hücre ya da 8 hücreli embriyolara enjeksiyonu iki set sağlar.

Enjeksiyon Çözümleri ve Embryoların Mikroenjeksiyon 3. hazırlanması

1. 0.01 içeren enjeksiyon çözeltisi hazırlayınng / nl membrana bağlı kırmızı floresan proteini (MEM-RFP) mRNA ⁹ embriyolar 4-hücre ya da 8-hücre aşamasına kadar olan gelişmekte iken. enjekte etmeye hazır olana kadar buz üzerinde enjeksiyon solüsyonu saklayın.
2. ". İğne çektirmenin durumda üst hizalanmış yedek tüp üst, bir iğne çektirmenin içine yedek cam kapiller tüp 800 ısı 2. değerini ayarlayın ve 650 Press çekme değer" 7 Yük çekme "butonuna iğneyi çekin. Bu, tek bir 7 2 iğne yaratacak" cam kapiller tüp.
3. Dumont forseps bir çift ile bir çekti iğne ucu kapalı snip.
   Not: İğneyi çekerek sonra, ucu kapalı mühürlü ve açık kesmek gerekir. İğne ucu olacak çapı daha küçük, bu kesilir iğne noktasına yakın. uç çapı Burada kullanılan mikroenjeksiyon sistemi ile enjeksiyon hacmi etkilemez, ancak daha büyük bir çapa sahip bir uç embriyo hasar olasılığı daha yüksektir.
4. m kaymaİğnenin sırtına icropipette pens. Sonraki, yuvanın arkasında iğne sırtına büyük delik O-halkasını slip.
5. madeni yağ iğne hava kabarcıkları almak için dikkatli olmak, bir 27 ölçü derialtı iğne kullanarak iğne doldurun.
6. piston yüklü beyaz plastik spacer büyük bir delik içine iğne oturma, mikroenjektör piston üzerine iğne Kayma. dalgıç beyaz aralama, büyük delik O-ring ve halkasında takip mikroenjektör gövdesine, en yakın küçük bir O-ring olmalıdır. halkayı sıkarak iğne sabitleyin. Düzgün güvenli olduğundan emin olmak için iğne yavaşça çekin.
7. iki bip kalmayana kadar basın ve mikroenjektör kontrol kutusu üzerindeki "boş" düğmesini basılı tutun.
8. Parafilm bir parça üzerine enjeksiyon solüsyonu pipetle 3 ul. Parafilm enjeksiyon solüsyonu boncuk içine iğne ucu yerleştirin. Basın ve microi düğmesine "doldurmak" tutunnjector kontrol kutusu iğne içine enjeksiyon çözümü çizmek için.
9. 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamisin içinde% 5 Ficoll kenetlenmek 500 mikronluk bir poliester ile kaplı bir 60 mm Petri kabı doldurmak. çanak içine 30 4-hücreli ya da 8 hücreli embriyolar - dikkatle 20 pipetle.
10. Saç döngüsünü ¹⁴ kullanılarak blastomer iğne karşı karşıya enjekte edilecek, böylece embriyolar manipüle. Sol böbreği hedef 4-hücreli embriyolar ya da 8 hücreli embriyo sol V2 blastomer sol ventral blastomer iğne bakacak şekilde embriyolar sıraya.
11. çanak her bir embriyonun seçilen blastomere içine enjeksiyon solüsyonu 10 nL enjekte edilir.
    Not: Petri kabı altındaki örgü embriyolar stabilize eder ve bunları stabilizasyon için saç döngü kullanılmadan enjekte sağlayan, kaymasını engeller.
12. Aktarım 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamisin içinde% 5 Ficoll ile dolu bir kültür plakasının oyuklarına embriyolar enjekte edilmiştir. Enjekte embriyo inkübeen az bir saat süreyle 16 ° C'de in enjekte blastomerler iyileşmesi izin vermek.
13. aşama 9 (ön gastrulasyon kadar) 0.3x MMR + 30 mg / ml gentamisin ile dolu olan yeni bir kültür plakasının yuvaları içine iyileşti embriyolar aktarın.
14. 40 ²¹ - embriyolar evre 38 ulaşana kadar 22 ° C - 14 embriyolar inkübe edin.

4. Sabitleme ve Embriyolar immün

1. MOPS / EGTA / magnezyum sülfat 50 ml hazırlamak / formaldehit Tamponu [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7.4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO _4,% 3.7 (h / h) formaldehid].
2. bir cam şişede 40 embriyo - 20 evre 38 - Bir transfer pipeti kullanarak, 10 koydu. karıştırmak için flakon ve ters şişeye% 100 etanol içinde 10 ul% 5 benzokain ekleyin. embriyoların uyutmak için 10 dakika bekleyin.
3. Cam bir pipet kullanılarak şişeden MMR çıkarın. Aynı anda birden fazla şişe işleme durumunda, şişeler, 24-iyi hücre kültür plakasına dik yapılabilir.
4. Cam borutte, MEMFA ile flakon doldurun. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile, üç boyutlu bir sallanan platform üzerinde şişe yerleştirin.
5. Cam bir pipet kullanılarak şişeden MEMFA çıkarın. % 100 metanol ile flakon doldurun. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç boyutlu bir sallanan platform üzerinde şişe yerleştirin. Bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın ve -20 ° C'de% 100 metanol gecede embriyolar saklayın.
6. Hazırlama 1x Fosfat Tamponlu Tuzlu Su-İnek Serumlu bir Albümin-Triton (PBT): 1X PBS, 2 mg / ml inek serum albümini,% 0.1 Triton X-100.
7. 1x PBT 1% 10 keçi serumu ile: Primer antikor solüsyonu hazırlayın fare monoklonal 5 seyreltme 4A6 antikoru, fare monoklonal antikorunun 3G8 bir 1:30 seyreltme (ara ürün uzak ve bağlantı tübüller ²⁰ zarlarını etiket) ve 1 (proksimal tübüllerin ²⁰ etiket lümen): tavşan poliklonal RFP antikor 250 seyreltme (MEM-RFP izli etiket). 4 ° C'de saklayın.
8. Seconda hazırlayınRy antikor çözeltisi:% 10 keçi serumu ile 1 x PBT, 1: 500 Alexa 488 keçi anti-fare IgG (stok konsantrasyonu 2 mg / ml; etiket 4A6 ve 3G8 etmek için) ve 1: 500 Alexa 555 keçi anti-tavşan IgG (hazır konsantrasyonu 2 mg / ml MEM-RFP tracer etiket). Mağaza 4 ° C'de, folyo tüp kapsayan ışıktan korumak için.
9. Seçenek olarak ise, boyama sonrası, birincil ve ikincil antikorlar toplamak ve gelecekteki deneyler yeniden kullanım için 4 ° C'de saklayın. Antikor yeniden kullanım için kaydedilecek ise,% 0.01 sodyum azit ekleyin.
10. Yerleşik protokoller ¹⁸ kullanılarak embriyolar immunostain.

Embriyolar ve Hedeflenen Pronephric Doku Analizi 5. Görselleştirme

1. Doğru blastomere 1X bir floresan stereomikroskop altında tracer floresan görüntüleyerek enjekte edildi doğrulamak için immunohistokimyasal embriyolar Ekran (bütün embriyo görmek için) ve 5X büyütme (böbrek görmek için). biz ile çok iyi bir cam levha yerleştirin embriyolar1x PBT ucu ile bir transfer pipet kullanarak dolu rf kesti. Bir saç döngü ile embriyolar işleyin. Embriyonun sol tarafında pronephros eş enjekte izleyici hediyem var sadece embriyolar kullanın (Şekil 3C, F ve Şekil 4C, F) geninin aşırı ekspresyonu veya demonte analizi için.
2. Bir cam şişe içinde embriyoların yerleştirilmesi ve Murray Clear flakon doldurarak: Alternatif olarak, Murray'in Clear embriyolar (1 kısım benzil alkol 2 parça benzil benzoat) temizleyin. Bir cam plaka kullanarak embriyolar gözünüzde canlandırın.
   Not: Murray Temizle bir organik çözücü ve dikkatle ele alınmalıdır. eldiven giyin ve sadece Murray'nın Clear cam şişeleri ve pipet kullanın.
3. 3 hafta - 2 için 4 ° C 1x PBT saklayın embriyolar. embriyoların uzun süreli depolama için, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 100 metanol içinde iki kez yıkanarak embriyolar dihidrat. % 100 metanol içinde -20 ° C'de embriyolar saklayın.

Sonuçlar

MEM-RFP mRNA ile 4 ve 8 hücreli Xenopus embriyoların Microinjections pronephros hedefleme farklı düzeylerde göstermektedir. 4 gösterileri sahne doğru MEM-RFP mRNA ekspresyonu ile 40 embriyolar Şekil. Embriyolar, sol ventral blastomere (Şekil 4A) enjekte ve MEM-RFP mRNA uygun ekspresyon modeli için kriteri edildi. Ara uzak proksimal, MEM-RFP'yi tanımlayan ve böbrek tübülleri bağlanmanın yanı sıra, uygun bir ...

Tartışmalar

Xenopus embriyoların geliştirilmesi pronephros Hedefleme belirlenmesi ve doğru blastomer enjekte dayanır. 8 hücreli embriyo V2 blastomer enjeksiyon sol pronephros ¹⁸ hedefliyor. Bu bir iç kontrol olarak kontralateral sağ pronephros bırakır. morfolino demonte veya RNA aşırı böbrek gelişimi değiştirmek için kullanıldığı takdirde, kontralateral sağ pronephros sol pronephros gen demonte veya aşırı ekspresyonuna etkilerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu durumda, böy...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Fisher	S271-3
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500
Calcium chloride	Fisher	C79-500
HEPES	Fisher	BP310-500
EDTA	Fisher	S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/ml	Amresco	E737-20ML
L-Cysteine, 99%+	Acros Organics	52-90-4
Ficoll	Fisher	BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875712
Mini Fridge II	Boekel	260009	Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid			For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W.	Invitrogen	D1817	Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water	Corning	46-000-CI
7" Drummond replacement tubes	Drummond	3-000-203-G/XL	Microinjection needles.
Needle puller	Sutter Instruments	P-30
Fine forceps	Dumont	11252-30	For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II	Drummond	3-000-204	Microinjector.
Mineral oil, heavy	Fisher	CAS 8042-47-5	Oil for needles.
27 G Monoject hypodermic needle	Covidien	8881200508	For loading mineral oil into microinjection needle.
5 ml Luer-Lok syringe	BD	309646	For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875713A
800 micron Polyester mesh	Small Parts	CMY-0800-C
Transfer pipets	Fisher	13-711-7M	For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate	Nest Biotechnology
MOPS	Fisher	BP308-500
EGTA	Acros Organics	67-42-5
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
15 mm x 45 mm Screw thread vial	Fisher	03-339-25B	For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell Culture plate	Nest Biotechnology
Benzocaine	Spectrum	BE130
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Methanol	Fisher	A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1x powder	Fisher	BP661-50
Bovine serum albumen	Fisher	BP1600-100
Triton X-100	Fisher	BP151-500
3D Mini rocker, model 135	Denville Scientific	57281
Goat serum, New Zealand origin	Invitrogen	16210064
Sodium azide	Fisher	S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody	European Xenopus Resource Centre		Primary antibody to label intermediate, distal and connecting tubules.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit	MBL	PM005	Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A11001	Secondary antibody to label kidney tubules.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21428	Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 Cavity spot plate	Corning	7220-85
Benzyl benzoate	Fisher	105862500	Optional - for clearing embryos
Benzyl alcohol	Fisher	A396-500	Optional - for clearing embryos