Somatik yeniden programlanması Kinetik Ölçümü ve Gerçek Zamanlı Görselleştirme

Özet

Bu çalışmada sunulan protokol analizi akış sitometrisi kullanılarak, pozitif ve negatif pluripotent kök hücresi belirleyicilerinin kinetik ölçümleri ile yeniden programlama ilerlemesi gerçek zamanlı izleme için yöntemler tarif etmektedir. protokol aynı zamanda iPSC oluşturma sırasında morfolojisi ve işaretleyici veya muhabir ifade görüntüleme bazlı değerlendirmesini içerir.

Özet

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources.

This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

Giriş

Hasta türetilmiş uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) hücre terapisi ve ilaç taraması için gelecek vaat eden araçlar. Onlar tedavisi için hücrelerin bir otolog kaynak sağlar. Buna ek olarak, mevcut embriyonik kök hücre (ESC) hatları sağlayacak ötesinde genetik hastalıkların detaylı in vitro analizi sağlayan genetik arka çok geniş bir dizi kapsar. Son gelişmeler, Sendai virüsü, epizomal plasmidleri ya da mRNA'lar ^1,2 ile yeniden programlama içeren iPSCs üretilmesi için çeşitli yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Özellikle, farklı yeniden programlama yöntemleri verimlilik ve güvenlik çeşitli düzeylerde ilişkili ve çeşitli uygulamalar için kendi uygunluğunu etkileyen diğer yollarla farklılık muhtemel olan. yeniden programlama teknolojilerinin çeşitli kullanılabilirliği ile, yeniden programlama sürecini değerlendirmek için yöntemler geliştirmek önemli hale gelmiştir. Çoğu mevcut yöntemler morfoloji veya boyama nitel inceleme güveniyorkök hücre spesifik boyalar ve antikorlar ile. Bir son zamanlarda geliştirilen bir yöntem PSC özgü miRNA'lar veya farklı hücreye özel mRNA ³ duyarlı lentiviral floresans muhabir kullanır. Böyle izleme yöntemleri seçimi ve farklı durumlar için yeniden programlama tekniklerinin optimizasyonu kolaylaştırmak. Örneğin, CDy1 yeniden programlama modülatörleri ⁴ taranması için erken iPSCs bir floresan sonda olarak kullanılmıştır. gözlemlemek ve farklı yeniden programlama deneyler karşılaştırmak için yeteneği de sürecin kendisi daha iyi bir anlayış kazanıyor için kritik öneme sahiptir. Örneğin, şimdi bazı somatik hücre tipleri diğerlerine ^5'ten yeniden programlamak kolay olduğu bilinmektedir ve hücreler ^6-8 yeniden programlama sırasında ara devletler geçmesi. Ne yazık ki, yeniden programlama sürecini altında yatan mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır ve dolayısıyla yeniden programlama yöntemleri arasında kesin farklar da d beklemektedirefined. Böylece, izleme yöntemleri, değerlendirilmesi ve yeniden programlama olayları karşılaştıran kök hücre alanı için kritik olmaya devam ediyor.

Bu protokol açıklanan yöntemler izlenmesi izin ve yeniden programlama sürecinin değerlendirilmesi ve bu tekniklerin yeniden programlama reaktiflerin farklı ayarlar karşılaştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. İlk yaklaşım akım sitometri içeren pozitif ve negatif pluripotent kök hücre (PSC) belirteçleri karşı antikorların kombinasyonları kullanılarak analiz eder. İkinci yaklaşım çiftler gerçek zamanlı görüntüleme ve toplam izdiham (hücreler kapsadığı yüzde yüzey alanı) ve işaretleyici sinyalleri (floresan sinyalleri kapsadığı yüzde yüzey alanı) izdiham ölçümü.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1.Solution ve Orta Hazırlık

1. Bodrum Membran Matrisi (Engelbreth-Holm-Swarm Tümörü arındırılmalıdır)
   1. Yavaş yavaş gece boyunca 4 ° C 'de buz üzerinde bazal membran matrisi (5 mi) eritin.
   2. steril, önceden soğutulmuş 15 ml konik bir tüp içinde buz soğukluğunda steril DMEM / F-12 ortamında, 5 ml 1: stok solüsyonu: 1 seyreltin. Önceden soğutulmuş, 1.5 ml steril mikro santrifüj tüplerine alikotları dağıtın ve hemen -20 ° C'de saklayın.
   3. 4 ° C'de bir gece boyunca 1 taban membran matrisi kısım: kullanım öncesinde, dondurulmuş 1 eritin. 1 kısım buz gibi 1, bir nihai seyreltme steril DMEM / F-12 ortamı ile bir 50 kat: 100 kullanımı sırasında, daha 1 seyreltin.
   4. Uygun doku kültürü (TC) kaplara 100 seyreltilmiş bazal membran matrisi çözeltisi ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe: 1 uygun miktarda. Tipik olarak, bir kat TC bulaşık O seyreltilmiş bazal membran matris solüsyon 3 ml,F 20 ^cm2 yüzey alanı kaplama TC yemekler diğer tipleri / yüzey alanının ^cm2 başına seyreltilmiş matris 0.15 ml bir oranda plakalar. önceden herhangi bir kültür ortamı ve hücreler ilave edilmeden kalan çözelti aspire.
2. fibroblast Orta
   1. gece boyunca 4 ° C 'de ES Kalifiye Fetal Sığır Serumu (ES-FBS) 100 ml'lik bir şişe çözülme.
   2. 50 çözülmüş ES-FBS ile yıkanır ve DMEM ortamı 445 ml MEM esansiyel olmayan amino asit çözeltisi (1x) 5 ml. 0.22 um'lik bir filtreden bileşenlerinin birleşik sterilize ve 4 haftaya kadar 4 ° C 'de orta saklayın.
3. IMEF Orta
   1. gece boyunca 4 ° C'de ES-FBS 100 ml'lik bir şişe çözülme.
   2. çözülmüş FBS 50 ml MEM esansiyel olmayan amino asit çözeltisine 5 ml (1 x) ve DMEM ortamı 445 ml 2-merkaptoetanol, 500 ul ekle.
   3. 0.22 um'lik bir filtreden bileşenlerinin birleşik sterilize beni depolamak4 haftaya kadar 4 ° C 'de dium.
4. Temel fibroblast büyüme faktörü çözeltisi (B-FGF)
   1. D-PBS 990 ul serum Değiştirme 10 ul ekleyin ve iyice yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
   2. 10 ug liyofilize B-FGF bir şişeye,% 1 (h / h) Serum Yedek çözeltisi 1 ml. İyice hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
   3. en fazla 4 hafta içinde gerekli olana kadar -20 ° C'de mikro santrifüj tüplerine ve mağaza 200 ul alikotları 10 ug / ml beta-FGF çözeltisi kısım.
5. İnsan Pluripotent Kök Hücre (hPSC) Orta
   1. gece boyunca 4 ° C'de serum yerine bir 100 mL şişe çözülme.
   2. çözülmüş serum Değiştirilmesi 100 ml, MEM gerekli olmayan amino asit çözeltisine 5 ml (1 x) ve DMEM / F-12 ortamında 395 ml 2-merkaptoetanol, 500 ul ekle.
   3. 0.22 um'lik bir filtreden bileşenlerinin birleşik sterilize en orta depolamak4 haftaya kadar 4 ° C.
   4. kullanım sırasında, 37 ° C'ye kadar hPSC orta ön ısıtmak ve bFGF 4 ng / ml ile tamamlar.
6. IMEF Orta (CM) Buzdolabı
   1. T-175 kültür şişesine,% 0.1 jelatin 18 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   2. inkübasyon bir saat sonra,% 0.1 jelatin çözeltisini çıkarın. IMEF ortam 45 ml 9.1 x 10 ⁶ mitotik-inaktive fare embriyonik fibroblastlar (IMEF) ilave edin ve gece boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edilir.
   3. Gece boyunca inkübasyondan sonra, eski IMEF orta kaldırmak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca D-PBS, 25 ml ile bir kez yıkanır.
   4. D-PBS aspire yıkama ve bFGF 4 ng / ml ile takviye edilmiş, önceden ısıtılmış hPSC ortamı 90 ml, ekleyin. Tam olarak, 24 saat boyunca 37 ° C inkübatör inkübe edin.
   5. kuluçkalamadan 24 saat sonra, aseptik IMEF şişeden hPSC orta kaldırmak ve bir 0.22 um filtre ile sterilize edilir. 5 içine kısım-20 ° C'de 0 ml konik tüpler ve donma kadar gerekli. IMEF CM -20 ° C'de en fazla 6 ay süreyle saklanabilir.
   6. IMEF şişeye bFGF 4 ng / ml ile takviye edilmiş, önceden ısıtılmış hPSC ortamının başka bir 90 ml. Tam olarak, 24 saat boyunca 37 ° C inkübatör inkübe edin. kadar 7 gün boyunca CM hasat tekrarlayın.
   7. kullanım sırasında, 37 ° C'ye kadar IMEF-CM önceden ısıtmak ve bFGF 4 ng / ml ile tamamlar.
7. E8 Orta
   1. gece boyunca 4 ° C'de 10 mi E8 ek çözülme.
   2. Geri kalan bazal ortama çözülmüş E8 ek içeriğini ilave aseptik E8 bazal ortamı 10 ml çıkarın ve. İyice karıştırın ve 0.22 mm'lik bir filtreden sterilize edin. 2 hafta boyunca 4 ° C'de komple ortam saklayın.
   3. Kullanım sırasında, orta kısım, oda sıcaklığına kadar kullanılmak üzere önceden ısıtın. 37 ° C E8 Orta-sıcak öncesi tavsiye edilmez.
8. hücre Yanirting Tampon
   1. Hücre EDTA çözeltisi (1 mM nihai konsantrasyon), HEPES tampon (25 mM son konsantrasyon) Penisilin / streptomisin solüsyonu (100 birim / ml son konsantrasyon) ve sığır serum albümini (% 1 son konsantrasyon) ilave edilerek ayırma hemen önce taze ayırma tamponu hazırlayın Dulbecco Fosfat Tamponlu Tuz (kalsiyum ve magnezyum içermeyen) içinde.
   2. kullanmadan önce, bir 0.22 um filtre ile tampon sterilize edin.
9. Hücre Sıralama Kurtarma Orta
   1. Penisilin / streptomisin (100 ünite / ml nihai konsantrasyon) ve kaya İnhibitörü-Y-27632 (10 uM son konsantrasyon) eklenerek Fibroblast Ortama 50 ml değiştirin. Ön ısınmaya 37 ° C için bu orta kriteri hücreleri tohumlanmasından önce.

İnsan Fibroblast 2. Sendai Aracılı yeniden programlanması

1. Önce 24 saat, Sendai virüs transdüksiyon 2 x 10 ⁵ ° C arasında bir yoğunlukta fibroblastlar tohum6 gözlü TC levhaları istenen kuyulara oyuk başına arşın.
2. aşağıdaki gibi Gün 0 üzerinde iletimi gerçekleştirin.
   1. 37 ° C su banyosu içinde fibroblast Orta öncesi sıcak 2 mi. -80 ° C depolama Sendai virüsü boruları kümesi çıkarın ve ilk 5 için 37 ° C su banyosu içinde borunun alt daldırılmasıyla bir anda her bir tüp, bir çözülme - 10 saniye, ve daha sonra su tüpü çıkarın banyo ve oda sıcaklığında erimeye sağlar. çözülmüş sonra, kısaca tüp santrifüj ve buz üzerinde hemen yerleştirin.
   2. önceden ısıtılmış Fibroblast orta 1 ml enfeksiyonun, aşağıdaki çokluğu (İB) elde etmek için tüpler her biri için (COA göre) uygun hacimleri ilave edilerek, ticari olarak ikinci jenerasyon Sendai virüs kullanarak oyuk başına aşağıdaki şekilde transduse edilmesi : KOS = 5 x 10 ⁶ UKÜ, hc-Myc = 5 x 10 ⁶ UKÜ, hKlf4 = 3 x 10 ⁶ UKÜ.
   3. İyice hafifçe yukarı ve aşağı karışımı pipetleme viral çözüm karıştırın. Comple5 dakika içinde bir sonraki adımı te.
   4. yeniden programlanması için fibroblast kuyudan Fibroblast Orta aspire ve her iyi viral çözeltinin 1 ml ekleyin. 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatöründe hücreleri yer ve bir gece boyunca inkübe edilir.
3. gece inkübasyon sonrasında, transdüksiyon orta aspire ve eski orta düzgün (30 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu çözeltisi) atmayın. dönüştürülmüş hücreler önceden ısıtılmış Fibroblast orta 2 ml ile değiştirin ve kültüre devam edin.
4. Kültür her gün taze Fibroblast Orta ile eski orta yerine 6 gün daha hücreler.
   Not: 7 gün transdüksiyon sonrası kadar değil, pasajı yeniden programlanması hücreleri yapın.
5. 6. Gün: iPSC Üretimi için hazırlayın Yemekleri
   1. Besleyici bağımlı iPSC üretimi için, bir 6-yuvalı doku kültürü (TC) çanak her çukuruna 1.5 ml% 0.1 jelatin solüsyonu ilave edin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   2. yani% 0.1 jelatin kaldırdökülmesinden inkübasyondan 1 saat sonra. Oyuk başına IMEF ortam, 2 ml 3 x 10 ⁵ mitotik-etkisizleştirilmiş fare embriyonik fibroblastlar (IMEF) ilave edin ve gece boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edilir.
   3. 6-yuvalı doku kültürü (TC) çanak her oyuğuna (100 dilüsyon 1) ve 1 saat 37 ° C'de inkübe besleyici bağımsız iPSC üretimi için, seyreltilmiş bazal membran matris 1.5 mL ekleyin.
6. Yedi gün transdüksiyon sonra, transduse fibroblastlar hasat ve iPSC koloni üretimi için önceden yapılmış kültür yemekleri üzerine onları yeniden plaka.
   1. fibroblastlardan normal kültür ortamı aspire ve D-2 ml PBS ile bir kez yıkama hücreleri.
   2. D-PBS aspire yıkama ve önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin / EDTA, 0.5 ml. 37 ° C'de 5 dakika - 3 hücreleri inkübe edin.
   3. Hücreler yuvarlanır sonra, trypsinization durdurmak için her kuyuya önceden ısıtılmış Fibroblast Orta 2 ml ekleyin. hafifçe t pipetleme kuyudan hücreleri çıkarmakO orta çanak yüzeyi boyunca. 15 mL konik santrifüj tüpü içinde bir hücre süspansiyonu toplanır.
   4. 2 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ve taze, önceden ısıtılmış Fibroblast Orta 2 ml hücreleri yeniden askıya.
   5. Istediğiniz yöntemi (hemasitometre veya otomatik hücre sayıcı) kullanarak hücre sayımı ve 6 kuyu başına, besleyici bağımlı koşulları 5 x 10 ⁴ hücre ve besleyici bağımsız koşulları 1 x 10 ⁵ hücre ile önceden hazırlanmış kültür kaplarına tohum çanak eh ₂ inkübatör gece boyunca 37 ° C,% 5 CO inkübe edin.
   6. Gece boyunca inkübasyondan sonra, uygulamaya bağlı olarak, hPSC ortamı, E8 orta veya IMEF durumunu ortama orta değiştirmek. her gün sonra taze ortam ile eski orta değiştirin.

BGO1v hOct4-GFP Muhabir İnsan Embriyonik Kök Hücreleri 3. Sendai yeniden programlanması (hESC) Türetilmiş İkincil Fibroblastlar

1. derprosedürüne uygun olarak BG01v hOct4-GFP raportör HESC hattından ikincil insan fibroblast ive önce ⁹ nitelendirdi.
2. İki gün transdüksiyon önce BGO1v / Hog fibroblast ortam maddesi kullanılarak, göz başına 2 x 10 ⁵ hücre bir 6-yuvalı plaka iki kuyu içine fibroblastlar türetilmiş plaka.
   1. 37 ° C'ye kadar Fibroblast Orta transdüksiyonu, önceden sıcak 2 ml gününde.
   2. -80 ° C depolama Sendai tüplerin bir set çıkarın. torbadan şişeleri çıkarın ve ilk 5 için 37 ° C su banyosu içinde borunun alt daldırılmasıyla bir anda her bir tüp, bir çözülme - 10 saniye sonra, tüpler oda sıcaklığında erimeye sağlar. çözülmüş sonra, kısaca tüp santrifüj ve buz üzerinde hemen yerleştirin.
   3. Üç Sendai tüplerinin her belirtilen sayılarını Fibroblast orta 2 ml (uygun birim için CoA bakınız), 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış ve iyice bir şekilde pipetli yukan aşağı çekilerek viral çözelti karıştırılır. Bir sonraki ste tamamlayın5 dakika içinde s.
      Not: Bu deney için, bir MOI 5: 5: 6 kullanıldı.
   4. fibroblast kuyulardan Fibroblast Orta aspire aktarılacak olan. iki gözüne viral süspansiyonun 1 mi aktarılacak olan ekleyin. 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatöründe hücreleri yer ve bir gece boyunca inkübe edilir.
   5. Gece boyunca inkübasyondan sonra, transdüksiyon orta kaldırmak ve uygun bir şekilde (30 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu) atın. dönüştürülmüş hücreler önceden ısıtılmış Fibroblast orta 2 ml de birbirlerinin yerini ve kültür devam etmektedir.
3. Kültür her gün taze Fibroblast Orta ile eski orta değişen 6 gün daha hücreler.
   1. Yedi gün transduced fibroblastlar hasat ve iPSC koloni üretimi için önceden yapılmış kültür yemekleri üzerine onları yeniden plaka, transdüksiyon sonrası.
   2. fibroblastlardan normal kültür ortamı aspire ve D-2 ml PBS ile bir kez yıkama hücreleri.
   3. DP kapalı aspireBS yıkama ve önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin / EDTA, 0.5 ml. 37 ° C'de 5 dakika - 3 hücreleri inkübe edin.
   4. Hücreler yuvarlanır sonra, trypsinization durdurmak için her kuyuya önceden ısıtılmış Fibroblast Orta 2 ml ekleyin. yavaşça çanak yüzeyi boyunca orta pipetleme kuyudan hücreleri çıkarmak. 15 mL konik santrifüj tüpü içinde bir hücre süspansiyonu toplanır.
   5. 200 x hücreleri Santrifüj 2 dakika boyunca örn. süpernatanı havalandırın, ve taze, önceden ısıtılmış Fibroblast ortam için uygun miktarda hücrelerin yeniden askıya.
   6. istediğiniz yöntemi (hemasitometre veya otomatik hücre sayıcı) kullanarak hücreleri saymak.
   7. Bir bazal membran matris oyuk başına 1 x 10 ⁵ hücre yoğunluğunda kalıt aktarımlı hücrelerin Tohum 6 oyuklu plaka -kaplı ve gece boyunca 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatörü içinde inkübe edilir.
4. Gece boyunca inkübasyondan sonra, 10 ng / m ile takviye edilmiş, koşullu ortam IMEF orta değiştirmekB-FGF l. bundan sonra taze IMEF CM her gün eski orta değiştirin.
5. Üç hafta mekanik incelemek ve klonal genişleme için istenen koloniler aktarmak veya analiz için kullanmak, transdüksiyon sonrası.

Fibroblast yeniden programlanması 4. Canlı Hücre Görüntüleme

1. Gerçek Zamanlı İzleme
   1. 7 gün önce tarif edildiği gibi arzu edilen orta ve matris sistemleri 6 oyuklu tabaklar üzerine hücre istenilen miktarda tohum, Sendai yeniden programlama kiti ile transdüksiyon sonrası. 37 ° C'de ayarlanmış bir nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde bulunan kamera içinde tohumlanır yemekler yerleştirin ve% 5 _CO2.
   2. üreticinin protokolüne göre önümüzdeki 14 gün için yakalama sürekli görüntü - (8 saat her 6) bir dizi aralıklarla her kuyunun bütün iyi görüntüleri yakalamak için görüntüleme yazılımı ayarlayın.
      Not: Faz kontrastlı görüntü ayarları koloni ilerlemesini değerlendirmek için, normal yeniden programlama için seçilir. halindeBG01v / Hog fibroblast yeniden programlama türetilmiş, bu yeniden programlama süreci boyunca izlenebilir faz kontrast ve endojen Oct4-GFP muhabiri yeniden aktivasyonu gibi yeşil floresan kanal görüntü yakalamak için en iyisidir.
   3. günlük olarak orta değiştirme, bu hPSC ortamı, E8, orta ya da IMEF-cm kadar olabilir, daha önce 21 sonrası iletimine 8. gün arasında tarif edildiği gibi deneye bağlı olarak. kuyular daha dolaylı immünofloresan kullanarak koloni oluşumu için analiz edilebilir.
   4. 21 gün 19 Deneyin sonunda, fibroblast için antikorlarla problanmış olan her bir kültür ortamı çıkarın ve seçim hücre işaretçilerini kaynaklanmaktadır.
   5. Önceden ısıtılmış DMEM / F-12 ortamı içinde 2 ml de bir kez, her yıkama.
   6. aşağıdaki şekilde, DMEM / F-12 ortamı, 1 ml her bir pozitif / negatif primer antikor çiftlerinin alikotları hazırlayın: anti-fare SSEA4 (1: 200) ve anti-fare CD44 (1:50), anti-fare TRA-1 60 (1: 200) ve anti-fare CD44 (1:50) ve alkali fosfataz LiLeke (1:50) ve anti-fare CD44 (1:50) ve. her bir karşılık gelen 1 mi birincil antikor çözüm ekleyin. 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   7. Primer antikor solüsyonu aspire ve önceden ısıtılmış DMEM / F-12 ortamı ile iki kez yıkanır.
   8. kırmızı floresan için: (1: 500), yeşil floresans ve keçi-anti-fare Alexa Fluor 594 konjuge sekonder için: (1: 500) keçi-anti-fare Alexa Fluor 488 konjuge sekonder kullanılarak (her bir 1 ml) ikincil antikor solüsyonları hazırlayın DMEM / F-12 ortamı. Nihai yıkamadan sonra her kuyuya ekle. 37 ° C'de 30 dakika süre ile ikincil antikorlar inkübe edin.
      Not: Alkalin Fosfataz Canlı lekesi (APLS) geçici sinyal için, anti-CD44, birincil inkübasyon önce kendine tarafından yapılmalıdır ve APLS sekonder antikor ile kuluçkalama sırasında ilave edilmelidir
   9. Sekonder antikor inkübasyonu takiben, çözüm aspire ve DMEM / F-12 orta ile iki kez yıkayın. Ekle taze önceden ısıtılmış DMEM / F-12son görüntü yakalama her iyi önce orta.
   10. faz kontrast, yeşil floresan ve kırmızı floresan: her üç tarama parametrelerini kullanarak her bütün kuyu görüntüleri elde etmek için görüntüleme yazılımı ayarlayın. Çeşitli büyütme görüntüleri oluşturun ve büyüme ve işaretleyici ifade izlemek için yazılımı ile zaman atlamalı filmleri oluşturmak. Üreticinin protokolü kullanın.
   11. analiz yazılımı kullanarak, faz kontrast ve BG01v / domuz yeniden programlama için yeşil floresan birimlerinde de üzerinde zaman izdiham değerlendirir.
2. Yeniden programlanması Ara kullanarak Hücre Yüzey İşaretleyiciler İzleme
   1. yeniden programlama sürecini izlemek amacıyla farklı kök hücre pozitif / negatif belirteçleri karşı antikorlar ile çeşitli zaman noktalarında yeniden programlama yemekleri sondalama ile farklı zaman noktalarında yeniden programlama olayları izleyin. Sonda kültürleri her 2 ila 3 gün çoğaltır yer olup olmamasına bağlı. yeniden programlama dis soruşturmaÇift boyama stratejiyi kullanarak 21 günde 19 de hes tamamen reprogrammed iPSC kolonileri ve boyanma dayalı kısmen reprogrammed koloniler tespit etmek bakabilirsiniz.
   2. Arzu edilen zaman noktasında, seçim markörleri için antikorlarla sondalanabilir her normal büyüme ortamını aspire.
   3. Önceden ısıtılmış DMEM / F-12 ortamı içinde 2 ml de bir kez, her yıkama.
   4. aşağıdaki şekilde, DMEM / F-12 ortamı, 1 ml her bir pozitif / negatif primer antikor çiftlerinin alikotları hazırlayın: yeşil floresan fluorofor (1: 200) ile konjuge SSEA4, TRA-1-60 yeşil floresan flüorofor (1 konjüge: 50), alkalin Canlı Leke (1: 500), CD24, yeşil flüoresan flüorofor (1:50), yeşil flüoresan flüorofor (1:50), EpCAM yeşil flüoresan florofora konjüge edilmiş konjüge, B2M (1:50) konjuge fare CD73 ile incelendi ve sıçan CD44 (1:50): yeşil flüoresan flüorofor (500 1) konjüge edilmiş anti-fare ikincil antikoru ile problanmıştır (1 100)anti-fare sekonder antikor kırmızı floresan fluorofor (: 500 1) konjuge. her bir karşılık gelen 1 mi birincil antikor çözüm ekleyin. 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   5. Aspire birincil antikor çözeltisi dışında ve önceden ısıtılmış DMEM / F12 ortamı ile iki kez yıkanır.
   6. konjüge edilmemiş antikorlar için, uygun ikincil antikor solüsyonlarının hazırlanması ile 2 adımlı bir yöntem kullanarak devam etmek ve 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. ikincil antikorlar birincil konağa ve tepki çapraz olmadığını onaylayın. Daha önce tarif edildiği gibi, ek yıkama adımları.
   7. tüm uygun yıkamadan sonra, son görüntü yakalamak için her bir kuyunun önce taze önceden ısıtılmış DMEM / F-12 orta ekleyin.
   8. Bir floresan mikroskop kullanılarak 100X büyütmede uygun filtre altında floresan görüntüler yakalayın ve mevcut analiz yazılımı kullanılarak görüntüleri analiz.

Akış C kullanarak yeniden programlanması Kinetiği 5. Ölçümytometry

1. Yeniden programlanması Kantitatif Kinetik Ölçümü Hücre Yüzey Antikorlar kullanarak
   1. yeniden programlama öncesinde her zaman noktası için yeniden programlama deneyler uygun sayıda kurdu. yeniden programlamanın ilk 7 gün boyunca yeniden programlama kinetiklerini ölçülmesi için, tek tek transdüksiyon istenen her bir zaman noktası için gerçekleştirilir. Gün 7 sonra zaman noktalarında için, yeniden programlama olaylarını ölçmek için devam etmek için yeterli besleyici bağımsız zaman noktaları tohum. 6-çukurlu plaka tek bir sıra flow sitometri analizi gerçekleştirmek için hücre yeterli miktarda ürün elde edilir.
   2. Bu son nokta deneyi gibi, tek tek oyuklara tüm istenen yeniden programlama zaman noktalarında ölçün. Fibroblast Orta iyi istenen kapalı aspire. D-PBS ile bir kez yıkanır.
   3. D-PBS yıkama kapalı aspire. oyuğuna% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi 1 ml ilave edilir, test edilecek. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
   4. inkübasyondan sonra, dissociKuyunun yüzeyine karşı 1 ml hücre süspansiyonu yıkama suretiyle tek hücre halinde hücreler yedi ve 15 ml konik bir tüp içine süspansiyon aktarın. kuyudan kalan hücrelerin yıkayın ve 15 ml konik eklemek için D-PBS 3 ml kullanın. daha konik bir tüp hücre çözeltisi seyreltilmesi için ek D-PBS, 10 ml kullanın.
   5. 2 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ve DMEM / F-12 orta 1 ml pelet yeniden askıya. Az ⁶ ila 10 x 1 den hücre / mi olan standart bir hücre süspansiyonu elde etmek gerektiğinde bir hücre sayımı gerçekleştirin.
   6. SSEA4 yeşil flüoresan flüorofor (1: 200) ile konjuge: aşağıdaki kombinasyonları kullanılarak en az 1 x 10 ⁶ hücre / ml DMEM / F-12 ortamı, 1 ml seçim pozitif / negatif doğrudan konjüge edilmiş antikor her bir sıvı bölüntü hazırlanması CD44-Cy5 PE konjüge ya da CD44, bir uzak-kırmızı bir fluoresan florofora konjüge edilmiş bir yeşil floresan florofor ve SSEA4 konjüge. tasarlamakOda sıcaklığında 45 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu antikorlar.
   7. Primer antikor solüsyonu aspire ve önceden ısıtılmış DMEM / F-12 ortamı ile iki kez yıkanır.
   8. Nihai yıkama aspire D-PBS, 1 ml hücre pelletini yeniden askıya. Pipet bireysel FACS tüpler her süspansiyon içeriği.
   9. Uygun negatif kontroller (lekesiz ve izotip kontrolleri) kullanılarak, sitometresindeki uygun ileri ve yan dağılım profili ve gerilimleri onaylayın. Yeşil fluorophores Mavi Lazer ve BL1 kanalında edinilen sinyallerle aktive edilir şekilde ilk tek leke parametrelerine göre ilgili fluorophores için gerilimleri Set kadar kırmızı floresan florofor ve PE-Cy5 fluorofor Kırmızı Lazer ile aktive ederken ve RL1 kanalında alınan sinyaller. Her zaman noktası için çift lekeli nüfus edinin.
   10. Uygun analiz yazılımı kullanılarak her zaman noktası için FCS dosyaları analiz ve arra için editörü kullanmaknge veri zamanla nüfus ifade vardiya gözlemlemek.
   11. Hücre sıralama farklı zaman noktalarında isteniyorsa, 5.1.6 adımları 5.1.1 izleyin. kullanılacak hücre sıralayıcı lazer yapılandırmasına göre uygun fluorofor kombinasyonlarını kullanın.
   12. Nihai yıkamayı takiben, hücre tasnifi, ayırma tamponu 1 ml hücre pelletini yeniden askıya. Bir Lekesiz kumanda kullanılarak uygun ileri ve yan dağılım ayarlarına hücre sıralayıcı ayarlayın. Her fluorofor için uygun ayarları kurmak için tek lekeli kontrolleri kullanın.
   13. Çift lekeli hücre süspansiyonu küçük bir örnek kullanın; sıralanması için 2 popülasyonları seçmek ve sıralanmış hücrelerin düzgün toplanmasını sağlayacak ilgili ücret atayın.
   14. kriteri hücre süspansiyonu minderli ve sıralama zamanında koruma sağlamak için toplama tüpleri içine, hücre geri kazanım aracına 200 ul ekle. Hücrelerin arzu numarasını hasat ve taze içeren yeni IMEF yemekleri üzerine aktarmakly kurtarma ortamı hazırladı.
   15. Kurtarma ortamı ile gecelik inkübasyon aşağıdaki orta değiştirin. Kültürler, daha sonra beslenen ve rutin Penisilin / Streptomisin (100 birim / ml nihai konsantrasyon) ihtiva eden hPSC ortamı kullanılarak geçişli olması gerekir.

6. Endpoint Analizi

1. Terminal Alkalen Fosfataz (AP) Boyama
   1. Nihai yeniden programlama verimliliği ile gözlenen kinetik ve morfolojik olayları ilişkilendirmek terminal kromojenik AP boyama kullanın.
   2. yeniden programlama 21 gün sonra, kuyu kültür ortamı, terminal AP lekesi ile boyandı çıkarın ve 200 mM Tris-HCl (pH 8.0) ile bir kez yıkanır.
   3. 200 mM Tris-HCl, üreticinin kılavuzuna yönettiği olarak boyama çözeltisi uygun miktarda hazırlayın.
   4. yıkama aspire ve her bir oyuğa hazırlanan boyama çözeltisi 2 ml ekleyin. Oda sıcaklığında 20 ile 30 dakika boyunca inkübe edin ve uzak The ışık.
   5. boyama çözeltisi aspire 200 mM Tris HCI ile bir kez yıkanır. yıkama çıkarın ve görselleştirme önce distile su ekleyin.
   6. Normal bir resim kamera kullanarak kolorimetrik sinyali yakalamak. elle pozitif boyanan koloni sayısını sayın. leke da doğada floresan olduğu gibi Trit-C kanalında floresan analizi kullanılarak leke görselleştirmek ve tam kuyu görüntüleme gerçekleştirmek ve tam kuyu görüntüleyici kullanılarak analiz edildi. Üreticinin protokolü kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Akım Sitometri kullanarak yeniden programlanması Kinetiği İzleme

SSEA4 PSC işaretleyici ^6,10 iken CD44 bir fibroblast belirtecidir. Bu ifade modelinden beklendiği gibi, sitometri BJ fibroblast akış bir SSEA4 gösterir ^- boyanmamış numune ile birlikte kadran kapıları oluşturulmasını kolaylaştırır CD44 ⁺ nüfusu. SSEA4 yavaş yavaş ifade edilirken Sendai virüsler ile ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

This study provides strategies for monitoring and tracking of the reprogramming process using flow cytometry and real-time imaging-based analysis. The critical steps in the protocol are initiating reprogramming, measuring reprogramming progression based on marker expression and real-time monitoring of reprogramming. Any reprogramming method of choice can be used but here we focus on Sendai based reprogramming of human fibroblasts. The advantage of this method is the ease of use and consistent high efficiency of reprogram...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	10569-010
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin	Thermo Fisher Scientific	16141-061
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300-054
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts	Thermo Fisher Scientific	A24903
Attachment Factor Protein (1x)	Thermo Fisher Scientific	S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	10565-018
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023
Collagenase, Type IV, powder	Thermo Fisher Scientific	17104-019
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12563-011
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Thermo Fisher Scientific	A1413302
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0264
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575-020
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)	Thermo Fisher Scientific	15260-037
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
InSolution Y-27632	EMD Millipore	688001
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit	Thermo Fisher Scientific	A1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit	Thermo Fisher Scientific	A16517
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal	ATCC	CRL-2522
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast	Thermo Fisher Scientific	N/A
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells	Thermo Fisher Scientific	R7799-105
IncuCyte ZOOM	Essen BioScience
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70)	Thermo Fisher Scientific	SSEA421
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70))	Thermo Fisher Scientific	A14810
SSEA-4 Antibody (MC813-70)	Thermo Fisher Scientific	41-4000
TRA-1-60 Antibody (cl.A)	Thermo Fisher Scientific	41-1000
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A27094
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging	Thermo Fisher Scientific	A25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7)	Thermo Fisher Scientific	RM-5700 (no longer available)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A-11029
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A-11007
Alkaline Phosphatase Live Stain	Thermo Fisher Scientific	A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging	Thermo Fisher Scientific	A25618
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate	Thermo Fisher Scientific	MHCD2401
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01)	Thermo Fisher Scientific	A15737
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9)	Thermo Fisher Scientific	A15755
CD73 / NT5E Antibody (7G2)	Thermo Fisher Scientific	41-0200
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope	Carl Zeiss	491912-0003-000
FlowJo Data Analysis Software	FLOJO, LLC	N/A
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser	Thermo Fisher Scientific	Use Attune NXT
S3e\ Cell Sorter (488/561 nm)	BIO-RAD	1451006
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap	Corning	352235
Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap	Corning	352097
Falcon T-75 Flask	Corning	353136
Falcon T-175 Flask	Corning	353112
Falcon 6-well dish	Corning	353046
Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator	Thermo Fisher Scientific	51013669
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml		AM12450
HulaMixer Sample Mixer		15920D