Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung

Zusammenfassung

Das Protokoll in dieser Studie präsentierten beschreibt Verfahren zur Echtzeit-Überwachung der Reprogrammierung Progression über die kinetische Messung von positiven und negativen pluripotenten Stammzellmarker Durchflusszytometrie-Analyse. Das Protokoll enthält auch die Imaging-basierte Beurteilung der Morphologie und Marker oder Reporter-Expression während der iPS-Generation.

Zusammenfassung

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources.

This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

Einleitung

Patienten stammende induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) sind vielversprechende Werkzeuge für Zelltherapie und Wirkstoff-Screening. Sie bieten eine autologe Quelle von Zellen für die Therapie. Darüber hinaus umfassen sie ein sehr breites Spektrum an genetischen Hintergründen, eine detaillierte In - vitro - Analyse von genetischen Erkrankungen jenseits dessen, was Strom an embryonalen Stammzellen (ESC) Linien erlauben würde , zu ermöglichen. Jüngste Fortschritte haben zur Entwicklung verschiedener Methoden geführt iPSCs zur Erzeugung, einschließlich Umprogrammierung mit Sendai - Virus, episomalen Plasmiden oder mRNAs ^1,2. Bemerkenswerterweise sind verschiedene Verfahren der Reprogrammierung zugeordnet Ebenen der Effizienz und Sicherheit Variation und sind wahrscheinlich auf andere Weise zu unterscheiden, die ihre Eignung für verschiedene Anwendungen beeinflussen. Mit der Verfügbarkeit von einer Vielzahl von Umprogrammierung Technologien hat es wichtig geworden, Methoden zu entwickeln, um die Reprogrammierung zu bewerten. Die meisten existierenden Verfahren stützen sich auf die qualitative Kontrolle der Morphologie oder Färbungmit Stammzell-spezifische Farbstoffe und Antikörper. Eine kürzlich entwickelte Methode nutzt lentiviralen Fluoreszenz - Reporter , die empfindlich auf PSC-spezifischen miRNAs oder differenzierte zellspezifischen mRNAs ^3. Eine solche Überwachungsmethoden, die Auswahl und Optimierung der Reprogrammierung Techniken für unterschiedliche Situationen erleichtern. Zum Beispiel wurde als fluoreszierende Sonde für frühe iPSCs um zu screenen für Umprogrammierung Modulatoren ⁴ CDY1 verwendet. Die Fähigkeit, zu beobachten und verschiedene Umprogrammierung Experimente vergleichen ist auch entscheidend für sich ein besseres Verständnis des Verfahrens zu gewinnen. Zum Beispiel ist es nun bekannt , dass einige somatische Zelltypen leichter sind als andere umprogrammieren ^5, und dass die Zellen gehen durch Zwischenzustände während ^6-8 Neuprogrammierung. Leider sind die Mechanismen, die die Reprogrammierung Verfahren zugrundeliegenden noch nicht vollständig verstanden und folglich bleiben die genauen Unterschiede zwischen Umprogrammierung Methoden auch als defined. So Methoden zur Überwachung, Bewertung und Neuprogrammierung Ereignisse Vergleich weiterhin für die Stammzell-Feld kritisch zu sein.

Die Verfahren in diesem Protokoll beschrieben ermöglichen die Überwachung und Beurteilung der Umprogrammierung und zeigen, wie diese Techniken verwendet werden können, verschiedene Sätze von Umprogrammierung Reagenzien zu vergleichen. Der erste Ansatz beinhaltet Durchflusszytometrie analysiert Kombinationen von Antikörpern gegen positive und negative pluripotenten Stammzellen (PSC) Marker. Der zweite Ansatz Paare Echtzeit-Bildgebung und die Messung der Gesamt Einmündung (die Fläche Prozent Oberfläche durch die Zellen bedeckt) und Einmündung der Markierungssignale (Bereich Prozent Oberfläche durch die fluoreszierenden Signale abgedeckt).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1.Solution und Medium Vorbereitung

1. Basalmembranmatrix (Gereinigt aus Engelbreth-Holm-Swarm - Tumor)
   1. tauen langsam Basalmembranmatrix (5 ml) auf Eis bei 4 ° C über Nacht.
   2. Von der Stammlösung 1: 1 mit 5 ml eiskaltem, sterilem DMEM / F-12-Medium in einem sterilen, vorgekühlte 15 ml konischen Röhrchen. Dispense Aliquots in vorgekühlte 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen und sofort bei -20 ° C.
   3. Vor Gebrauch, tauen die gefrorenen 1: 1 Basalmembranmatrix aliquoten über Nacht bei 4 ° C. Zur Zeit der Verwendung, verdünnt ferner das 1: 1-Aliquot ein anderes 50-fach mit eiskaltem, sterilem DMEM / F-12-Medium zu einer Endverdünnung von 1: 100.
   4. Fügen Sie die entsprechende Menge des 1: 100 verdünnt Basalmembranmatrix Lösung auf die entsprechende Gewebekultur (TC) Gefäße und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde. Normalerweise verwenden 3 ml der verdünnten Basalmembranmatrix Lösung zur Beschichtung eines TC Schale of 20 cm ² Oberfläche beschichten alle anderen Arten von TC Geschirr / Platten bei einem Verhältnis von 0,15 ml verdünntem Matrix pro cm ² Oberfläche. Aspirieren die verbleibende Lösung vor der Zugabe irgendeines Kulturmedium und Zellen.
2. Fibroblast Medium
   1. Tauen Sie eine 100 ml Flasche ES Qualified Fetal Bovine Serum (ES-FBS) bei 4 ° C über Nacht.
   2. 50 ml der aufgetauten ES-FBS und 5 ml MEM Non-Essential Aminosäurelösung (1x) zu 445 ml DMEM Medium. Sterilisieren der kombinierten Komponenten durch ein 0,22 um Filter und zu speichern, das Medium bei 4 ° C für bis zu 4 Wochen.
3. Imef Medium
   1. Tauen Sie eine 100-ml-Flasche von ES-FBS über Nacht bei 4 ° C.
   2. 50 ml des aufgetauten FBS, 5 ml MEM Non-Essential Aminosäurelösung (1x) und 500 ul 2-Mercaptoethanol bis 445 ml DMEM Medium.
   3. Sterilisieren der kombinierten Komponenten durch ein 0,22-um-Filter und speichern Sie die mirdium bei 4 ° C für bis zu 4 Wochen.
4. Basic Fibroblast Growth Factor - Lösung (b-FGF)
   1. In 10 ul Serumersatz bis 990 & mgr; l D-PBS und gründlich mischen durch Pipettieren von oben und unten.
   2. Fügen Sie die 1 ml der 1% (v / v) Serum Replacement-Lösung ein Fläschchen von 10 ug gefriergetrocknet, b-FGF. Gründlich mischen durch vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten.
   3. Aliquot der 10 ug / ml b-FGF-Lösung in 200 ul-Aliquoten in Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C bis zu bis zu 4 Wochen benötigt.
5. Humanen pluripotenten Stammzellen (HPSC) Medium
   1. Tauen über Nacht eine 100 ml Flasche Serumersatz bei 4 ° C.
   2. 100 ml der aufgetauten Serum Replacement, 5 ml MEM Non-Essential Aminosäurelösung (1x) und 500 ul 2-Mercaptoethanol bis 395 ml DMEM / F-12-Medium.
   3. Sterilisieren der kombinierten Komponenten durch ein 0,22 um Filter und speichern das Medium bei4 ° C für bis zu 4 Wochen.
   4. Zum Zeitpunkt der Verwendung, pre-warm das HPSC Medium auf 37 ° C und ergänzt mit 4 ng / ml bFGF.
6. Imef konditioniertem Medium (CM)
   1. Hinzufügen 18 ml 0,1% Gelatine zu einem T-175 Kulturkolben und inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde.
   2. Entfernen Sie die 0,1% Gelatine-Lösung nach einer Stunde Inkubation. In 9,1 x 10 ⁶ mitotisch inaktivierten embryonalen Maus - Fibroblasten (Imef) in 45 ml Imef Medium und Inkubation im 37 ° C - Inkubator über Nacht.
   3. Nach Inkubation über Nacht entfernen Sie die alte Imef Medium und waschen Sie einmal mit 25 ml D-PBS für 5 min bei Raumtemperatur.
   4. Absaugen der D-PBS waschen und 90 ml vorgewärmten HPSC Medium hinzufügen, mit 4 ng / ml bFGF ergänzt. Inkubieren in dem 37 ° C Inkubator für genau 24 Stunden.
   5. Nach 24 h Inkubation entfernen aseptisch das HPSC Medium aus dem Imef Kolben und zu sterilisieren durch einen 0,22 um-Filter. Aliquotieren in 50 ml konische Röhrchen und gefrier bei -20 ° C bis benötigt. Imef CM kann für bis zu 6 Monate bei -20 ° C gelagert werden.
   6. Fügen Sie weitere 90 ml vorgewärmten HPSC Medium mit 4 ng / ml bFGF zum Imef Kolben ergänzt. Inkubieren in dem 37 ° C Inkubator für genau 24 Stunden. Wiederholen Sie die Ernte von CM für bis zu 7 Tage.
   7. Zum Zeitpunkt der Verwendung, pre-warm die Imef-CM auf 37 ° C und ergänzt mit 4 ng / ml bFGF.
7. E8 Medium
   1. Tauen Sie über Nacht ein 10 ml E8 Zuschlag bei 4 ° C.
   2. Entfernen Sie 10 ml des E8 Basalmedium und aseptisch den Inhalt der aufgetauten E8 Ergänzung zu den übrigen Grundmedium. Gut mischen und zu sterilisieren durch ein 0,22-um-Filter. Lagern Sie das komplette Medium bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.
   3. Zum Zeitpunkt der Verwendung, vorge erwärmen das Aliquot des Mediums auf Raumtemperatur verwendet werden. Es ist nicht Vorwärmen E8 Medium bis 37 ° C empfohlen.
8. Zelle , sorting Buffer
   1. Vorbereitung frischen Sortierpuffer kurz bevor durch Zugabe von EDTA-Lösung (1 mM Endkonzentration), HEPES-Puffer (25 mM Endkonzentration) Penicillin / Streptomycin-Lösung (100 Einheiten / ml Endkonzentration) und Rinderserumalbumin (1% Endkonzentration) Zellsortierung in Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Calcium und Magnesium frei).
   2. Sterilisieren der Puffer durch einen 0,22 um Filter vor der Verwendung.
9. Zellsortierung Recovery - Medium
   1. Ändern 50 ml Fibroblast Medium durch Zusatz von Penicillin / Streptomycin (100 Einheiten / ml Endkonzentration) und Rock-Inhibitor Y-27632 (10 & mgr; M Endkonzentration). Vorwärmen dieses Medium auf 37 ° C vor der sortierten Zellen Animpfen.

2. Sendai Mediated Reprogrammierung von menschlichen Fibroblasten

1. 24 h vor den Sendai Viren Transduktion, die Fibroblasten bei einer Dichte von 2 × 10 ⁵ c Seedingells pro Vertiefung in die gewünschten Vertiefungen einer 6-Well-Platte TC.
2. Führen Sie die Übertragung am Tag 0 wie folgt.
   1. Vorwärmen 2 ml Fibroblast Medium in einem 37 ° C Wasserbad. Entfernen Sie einen Satz von Sendai-Virus-Röhrchen von -80 ° C Lagerung und auftauen jedes Rohr ein zu einer Zeit, indem zunächst in einem 37 ° C Wasserbad den Boden der Röhre eingetaucht wird 5 - 10 sec, und entfernen Sie den Schlauch aus dem Wasser Bad und lassen sie es bei Raumtemperatur auftauen. Nach dem Auftauen Zentrifuge kurz das Rohr und legen Sie sie sofort auf Eis.
   2. Verwenden Sie im Handel zweiten Generation Sendai-Viren durch die entsprechenden Volumina Zugabe (gemäß der COA) für jedes der Rohre, um die folgende Vielzahl der Infektion (MOI) auf 1 ml vorgewärmtes Fibroblast Medium zu erreichen pro Vertiefung werden transduzierten wie folgt : KOS = 5 x 10 ⁶ CIU, hc-Myc = 5 x 10 ⁶ CIU, hKlf4 = 3 x 10 ⁶ CIU.
   3. Gründlich mischen, um die Virus-Lösung durch Pipettieren der Mischung sanft auf und ab. complete den nächsten Schritt innerhalb von 5 min.
   4. Saugen Sie das Fibroblast Medium aus dem Brunnen der Fibroblasten neu programmiert werden, und 1 ml der viralen Lösung zu jedem Well. Legen Sie die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO ₂ Inkubator und Inkubation über Nacht.
3. das Übertragungsmedium und entsorgen Sie das alte Medium richtig (10% Bleichlösung für 30 min) Nach der Inkubation über Nacht absaugen. Ersetzen mit 2 ml vorgewärmtes Fibroblast Medium und weiterhin die transduzierten Zellen zur Kultur.
4. Kultur die Zellen für 6 Tage, jeden zweiten Tag das alte Medium mit frischem Fibroblast Medium zu ersetzen.
   Hinweis: Nicht Passage die umprogrammiert Zellen bis 7 Tage Übertragung stellen.
5. Tag 6: Bereiten Sie Geschirr für iPS - Generation
   1. Für Feeder-abhängige iPSC Generation, fügen Sie 1,5 ml 0,1% Gelatine-Lösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Gewebekultur (TC) Schale und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde.
   2. Entfernen Sie die 0,1% Gelatine solution nach 1 Stunde Inkubation. In 3 x 10 ⁵ mitotisch inaktivierten embryonalen Maus - Fibroblasten (Imef) in 2 ml Imef Medium pro Vertiefung und Inkubation im 37 ° C - Inkubator über Nacht.
   3. Für Feeder unabhängige iPSC Generation, fügen Sie 1,5 ml verdünntem Basalmembranmatrix (1: 100 Verdünnung) zu jeder Vertiefung einer 6-Well-Gewebekultur (TC) Schale und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde.
6. Sieben Tage nach der Transduktion, Ernte der transduzierten Fibroblasten und Wieder plattieren sie auf die vorgefertigten Kulturschalen für iPSC Kolonieerzeugung.
   1. Absaugen dem normalen Kulturmedium aus den Fibroblasten, und waschen Sie die Zellen einmal mit 2 ml D-PBS.
   2. Absaugen der D-PBS waschen und 0,5 ml vorgewärmten 0,05% Trypsin / EDTA hinzufügen. Inkubieren der Zellen für 3 bis 5 min bei 37 ° C.
   3. Wenn die Zellen abgerundet, 2 ml vorgewärmtes Fibroblast Medium in jede Vertiefung Trypsinierung zu stoppen. Vertreiben Sie die Zellen aus dem Bohrloch durch vorsichtiges Pipettieren ter Mediums über die Oberfläche der Schale. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen.
   4. Zentrifugieren der Zellen bei 200 · g für 2 min. Den Überstand aspirieren, und wieder die Zellen in 2 ml frisch, vorgewärmte Fibroblast Medium.
   5. Zählen Sie die Zellen die gewünschte Methode (Hämozytometer oder automatisierten Zellzähler) und Saatgut die vorbereiteten Kulturschalen mit 5 x 10 ⁴ Zellen für Feederabhängigen Bedingungen und 1 x 10 ⁵ Zellen für Feederunabhängigen Bedingungen pro Vertiefung einer 6 bei 37 ° C, 5% CO ₂ Inkubator über Nacht -Well Gericht und inkubiert.
   6. Nach der Inkubation über Nacht ändern, das Medium zu HPSC Medium, E8 Medium oder Imef-konditionierten Medien, je nach Anwendung. Ersetzen Sie das alte Medium mit frischem Medium jeden Tag danach.

3. Sendai Reprogrammierung von BGO1v hOct4-GFP-Reporter humanen embryonalen Stammzellen (hES) Abgeleitet Secondary Fibroblasten

1. derive sekundären menschlichen Fibroblasten aus dem BG01v hOct4-GFP - Reporter hESC Linie gemäß dem Verfahren beschrieben zuvor ^9.
2. Zwei Tage vor der Transduktion Platte BGO1v / HOG abgeleiteten Fibroblasten in zwei Vertiefungen einer 6-Well - Platte mit 2 × 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung unter Verwendung von Fibroblast Medium.
   1. Am Tag der Transduktion vorwärmen 2 ml Fibroblast Medium auf 37 ° C.
   2. Entfernen Sie eine Reihe von Sendai Röhrchen aus dem -80 ° C Lagerung. Entfernen der Fläschchen aus dem Beutel und auftauen jedes Rohr eine zu einem Zeitpunkt, indem zunächst in einem 37 ° C Wasserbad den Boden des Röhrchens für das Eintauchen von 5 bis 10 sec, wonach die Küvetten auf Raumtemperatur auftauen. Nach dem Auftauen Zentrifuge kurz das Rohr und legen Sie sie sofort auf Eis.
   3. Fügen Sie die angegebenen Mengen von jedem der drei Sendai Rohre (die CoA für das entsprechende Volumen zu sehen) auf 2 ml Fibroblast Medium, auf 37 ° C vorgewärmt und gründlich die virale Lösung mischen durch Pipettieren von oben und unten. Füllen Sie das nächste step innerhalb von 5 min.
      Anmerkung: Für dieses Experiment wurde eine MOI von 5: 5: 6 verwendet wurde.
   4. Absaugen Fibroblast Medium aus den Vertiefungen der Fibroblasten transduziert werden. 1 ml der Virussuspension auf jedes von zwei Vertiefungen transduziert werden. Legen Sie die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO ₂ Inkubator und Inkubation über Nacht.
   5. Nach Inkubation über Nacht, entfernen Sie das Übertragungsmedium und ordnungsgemäß entsorgen (10% Bleichlösung für 30 min). Ersetzen Sie jede Vertiefung mit 2 ml vorgewärmtes Fibroblast Medium und weiterhin die transduzierten Zellen zur Kultur.
3. Kultur die Zellen für 6 Tage, jeden zweiten Tag das alte Medium mit frischem Fibroblast Medium zu verändern.
   1. Sieben Tage nach der Transduktion, der transduzierten Fibroblasten ernten und neu plattieren sie auf die vorgefertigten Kulturschalen für iPSC Kolonie Generation.
   2. Absaugen dem normalen Kulturmedium aus den Fibroblasten, und waschen Sie die Zellen einmal mit 2 ml D-PBS.
   3. Absaugen DPBS waschen und 0,5 ml vorgewärmten 0,05% Trypsin / EDTA hinzufügen. Inkubieren der Zellen für 3 bis 5 min bei 37 ° C.
   4. Wenn die Zellen abgerundet, 2 ml vorgewärmtes Fibroblast Medium in jede Vertiefung Trypsinierung zu stoppen. Verdrängen die Zellen aus dem Bohrloch durch vorsichtiges Pipettieren des Mediums über die Oberfläche der Schale. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml konischen Zentrifugenröhrchen.
   5. Zentrifugieren der Zellen bei 200 x g für 2 min. die Zellen in einer geeigneten Menge frischen, vorgewärmten Fibroblast Medium ansaugen den Überstand und erneut suspendieren.
   6. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung des gewünschten Methode (Hämozytometer oder automatisierten Zellzähler).
   7. Samen der transduzierten Zellen bei einer Dichte von 1 x 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung einer Basalmembranmatrix -beschichteten 6-Well - Platte und Inkubation in einem 37 ° C, 5% CO ₂ Inkubator über Nacht.
4. Nach der Inkubation über Nacht das Medium ändern konditioniertem Medium zu Imef, ergänzt mit 10 ng / ml b-FGF. Ersetzen Sie das alte Medium mit frischem Imef CM jeden Tag danach.
5. Drei Wochen nach der Transduktion, mechanisch sezieren und die gewünschten Kolonien für klonalen Expansion übertragen oder für die Analyse verwendet werden.

4. Live Cell Imaging von Fibroblast Reprogrammierung

1. Echtzeitüberwachung
   1. 7 Tage nach der Transduktion mit der Neuprogrammierung Kit Sendai, die gewünschte Menge an Zellen auf 6-Well-Schalen mit den gewünschten mittleren und Matrixsystemen Samen wie zuvor beschrieben. Legen Sie die ausgesäten Gerichte in der Imager, befindet sich in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO _2.
   2. Legen Sie die Imaging-Software ganz gut Bilder jedes einzelnen gut in einem festgelegten Intervall zu erfassen (alle 6 - 8 h) kontinuierliches Bild für die nächsten 14 Tage die Erfassung nach dem Protokoll des Herstellers.
      Hinweis: Die Phasenkontrast-Bildeinstellungen für normale Umprogrammierung ausgewählt werden Kolonie Progression zu bewerten. Im Fallevon BG01v / hog Fibroblasten Umprogrammierung abgeleitet, ist es am besten Bilder im Phasenkontrast und in dem grün fluoreszierenden Kanal wie die erneute Aktivierung der endogenen OCT4-GFP-Reporter zu erfassen können während des gesamten Umprogrammierung verfolgt werden.
   3. Ändern des Mediums täglich, kann es HPSC Medium, E8 Medium oder Imef-cm, je nach Experiment, wie zuvor beschrieben von Tag 8-21 post-Transduktion. Die Vertiefungen können ferner zur Koloniebildung durch indirekte Immunofluoreszenz analysiert.
   4. Am Ende des Versuchs am Tag 19 bis 21, entfernen Sie das Kulturmedium aus jeder Vertiefung mit Antikörpern für Fibroblasten und Stammzellmarker der Wahl sondiert werden.
   5. Waschen Sie jede Vertiefung einmal mit 2 ml vorgewärmten DMEM / F-12-Medium.
   6. Bereiten Aliquots jeder positive / negative primären Antikörperpaare in 1 ml DMEM / F-12-Medium wie folgt: Anti-Maus SSEA4 (1: 200) und anti-Ratte-CD44 (1:50), anti-Maus-TRA-1- 60 (1: 200) und anti-Ratte-CD44 (1:50), und alkalische Phosphatase Live Stain (1:50) und anti-Ratte-CD44 (1:50). Fügen Sie die 1 ml primärer Antikörper-Lösungen in jede Vertiefung entspricht. für 45 min bei 37 ° C inkubieren.
   7. Absaugen der primären Antikörperlösung und wäscht zweimal mit vorgewärmten DMEM / F-12-Medium.
   8. Bereiten sekundären Antikörperlösungen (1 ml für jede Vertiefung) unter Verwendung von Ziege-anti-Maus-Alexa Fluor 488 konjugierten sekundären (1: 500) für grüne Fluoreszenz und Ziege-Anti-Ratten-Alexa Fluor 594 konjugierten sekundären (1: 500) für rote Fluoreszenz in DMEM / F-12-Medium. In jede Vertiefung nach der letzten Wäsche. Inkubieren der Sekundärantikörper für 30 min bei 37 ° C.
      Anmerkung: Wegen Alkaline Phosphatase Live-Stain des (APLS) transientes Signal, das anti-CD44 primären Inkubation zuerst von selbst durchgeführt werden sollte, und die APLS sollten mit den Sekundärantikörper zum Zeitpunkt der Inkubation zugegeben werden,
   9. Im Anschluss an den sekundären Antikörper Inkubation die Lösung absaugen und waschen zweimal mit DMEM / F-12-Medium. In frischem vorgewärmten DMEM / F-12Medium zu jeder Vertiefung vor der endgültigen Bildaufnahme.
   10. Stellen Sie den Scanner-Software zu erwerben ganze auch Bilder von jeder Vertiefung mit allen drei Scan-Parameter: Phasenkontrast, grüne Fluoreszenz und rote Fluoreszenz. Erstellen Sie Bilder mit verschiedenen Vergrößerungen und Zeitraffer-Filme mit der Software zu erstellen Wachstum und Marker Ausdruck zu überwachen. Verwenden Protokoll des Herstellers.
   11. Mit Hilfe der Analysesoftware auswerten Einmündung der auch im Laufe der Zeit im Phasenkontrast und in grün fluoreszierenden Einheiten für die BG01v / hog Neuprogrammierung.
2. Überwachung Reprogrammierung Intermediates mit Zelloberflächenmarker
   1. Überwachen Sie Umprogrammierung Ereignisse zu verschiedenen Zeitpunkten durch das Antasten der Umprogrammierung Gerichte zu verschiedenen Zeitpunkten mit Antikörpern gegen verschiedene Stammzell positive / negative Marker, um die Reprogrammierung zu überwachen. Probe Kulturen alle 2 bis 3 Tage, je nach Verfügbarkeit von Replikaten. Sonde, die die Reprogrammierung disvollständig umprogrammiert iPSC Kolonien zu identifizieren und teilweise neu programmiert Kolonien auf der Grundlage der Färbemustern hes am Tag 19 bis 21 die Doppelfärbung Strategie.
   2. Zum Zeitpunkt gewünscht absaugen normalem Wachstumsmedium aus jeder Vertiefung off mit Antikörpern für die Marker der Wahl sondiert werden.
   3. Waschen Sie jede Vertiefung einmal mit 2 ml vorgewärmten DMEM / F-12-Medium.
   4. Bereiten Aliquots jeder positive / negative primären Antikörperpaare in 1 ml DMEM / F-12-Medium wie folgt: SSEA4 dem grünen fluoreszierenden Fluorophor konjugiert ist (1: 200), TRA-1-60 konjugiert mit dem grün fluoreszierenden Fluorophor (1: 50), Alkaline Live-Stain (1: 500), konjugiert an ein CD24 green fluorescent Fluorophor (1:50), B2M konjugiert mit einem grün fluoreszierenden Fluorophor (1:50), EpCAM, konjugiert mit einem grün fluoreszierenden Fluorophor (1:50) , Maus CD73 (1: 100), die mit anti-Maus-Sekundär-Antikörper, konjugiert mit einem grün fluoreszierenden Fluorophor (1: 500) untersucht wurde, und Ratten-CD44 (1:50), die mit sondiertsekundäre anti-Ratte-Antikörper an die roten Fluoreszenz Fluorophor (500 1) konjugiert. Fügen Sie die 1 ml primärer Antikörper-Lösungen in jede Vertiefung entspricht. für 45 min bei 37 ° C inkubieren.
   5. Absaugen der primären Antikörperlösung und wäscht zweimal mit vorgewärmten DMEM / F12-Medium.
   6. Für unkonjugierten Antikörper, gehen über ein 2-Schritt-Verfahren, indem die entsprechenden Sekundärantikörperlösungen Herstellung und Inkubation für 30 min bei 37 ° C zu verwenden. Bestätigen Sie, dass Sekundärantikörper zu den primären Hosts sind und nicht kreuzreagieren. Führen zusätzliche Waschschritte wie zuvor beschrieben.
   7. Nach allen geeigneten Waschungen, fügen Sie frisch vorgewärmten DMEM / F-12-Medium zu jeder Vertiefung vor der endgültigen Bildaufnahme.
   8. Erfassen Sie die Fluoreszenzbilder unter dem entsprechenden Filter bei 100-facher Vergrößerung eines Fluoreszenzmikroskop und zu analysieren, die Bilder zur Verfügung Analyse-Software.

5. Messung der Reprogrammierung Kinetics Mit Flow-Cytometry

1. Quantitative Kinetische Messung der Reprogrammierung Zelloberfläche unter Verwendung von Antikörpern
   1. Vor der Umprogrammierung, stellen Sie die entsprechende Anzahl der Reprogrammierung Experimente für jeden Zeitpunkt auf. Für Kinetik der Reprogrammierung in den ersten 7 Tagen nach der Umprogrammierung der Messung einzelner Transduktionen sind für jeden gewünschten Zeitpunkt durchgeführt. Für Zeitpunkten nach der 7. Tag, Samen ausreichend Feeder-unabhängige Zeitpunkten fortzusetzen, um die Neuprogrammierung Ereignisse zu messen. Eine einzelne Vertiefung einer 6-Well-Platte werden ausreichende Mengen an Zellen liefern Durchflusscytometrieanalyse zur Durchführung.
   2. Messen Sie alle gewünschten Umprogrammierung Zeitpunkten aus einzelnen Vertiefungen, da dies ein Endpunkt-Assay ist. Absaugen Fibroblast Medium von der gewünschten gut. Wasche einmal mit D-PBS.
   3. Absaugen der D-PBS zu waschen. 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA Lösung der gut getestet werden. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
   4. Nach der Inkubation dissociaß die Zellen in einzelne Zellen durch die 1 ml Zellsuspension gegen die Oberfläche des Bohrloches Spülung und die Suspension in einem 15 ml konischen Röhrchen übertragen. Verwenden Sie 3 ml D-PBS alle verbleibenden Zellen aus dem Brunnen zu waschen und fügen Sie sie in den 15-ml-Erlen. Verwenden 10 ml zusätzlicher D-PBS, um die Zellösung in dem konischen Rohr verdünnen.
   5. Zentrifugieren der Zellen bei 200 · g für 2 min. Den Überstand aspirieren und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml DMEM / F-12-Medium. Durchführen einer Zellzahl je nach Bedarf eine Standard - Zellsuspension zu erzeugen , die kleiner als 1 x 10 ⁶ Zellen / ml.
   6. Bereiten Sie jede aliquote Menge von positiven / negativen direkt-konjugierten Antikörpern der Wahl in 1 ml DMEM / F-12 - Medium für weniger 1 x 10 ⁶ Zellen / ml unter Verwendung der folgenden Kombinationen: SSEA4 zu einem grün fluoreszierenden Fluorophor konjugiert ist (1: 200) mit CD44, konjugiert an PE-Cy5 oder CD44, konjugiert mit einem grün fluoreszierenden Fluorophor und SSEA4 zu einem weit rot fluoreszierendes Fluorophor konjugiert. bebrütendie Antikörper mit der Zellsuspension für 45 min bei Raumtemperatur.
   7. Saugen Sie das primäre Antikörperlösung und wäscht zweimal mit vorgewärmten DMEM / F-12-Medium.
   8. das Zellpellet in 1 ml D-PBS absaugen letzten Waschen und erneut suspendieren. Pipettieren der Inhalt jeder einzelnen Suspension in FACS-Röhrchen.
   9. Mit den entsprechenden Negativkontrollen (ungefärbten und Isotypkontrollen), bestätigen die richtige Vorwärts- und Seitenstreuprofil und Spannungen auf dem Zytometer. Stellen Sie die Spannungen für die entsprechenden Fluorophore nach ersten einzelnen Fleck Parameter, so dass die grüne Fluorophore durch die Blue Laser aktiviert werden und Signale im BL1 Kanal erworben, während weit rot fluoreszierendes Fluorophor und PE-Cy5-Fluorophor aktiviert werden durch den roten Laser-und Signale im RL1 Kanal erworben. Erwerben Sie die Dual-gefärbten Bevölkerung für jeden Zeitpunkt.
   10. Analysieren Sie die FCS-Dateien für jeden Zeitpunkt die entsprechende Analyse-Software und den Editor verwenden, um ARRAnge Daten der Bevölkerung Ausdruck Verschiebung im Laufe der Zeit zu beobachten.
   11. Führen Sie die Schritte 5.1.1 bis 5.1.6, wenn Zellsortierung zu verschiedenen Zeitpunkten erwünscht ist. Verwenden Sie die entsprechenden Fluorophors Kombinationen gemäß der Laserkonfiguration der Zellsortierer verwendet werden.
   12. Nach dem letzten Waschen resuspendieren das Zellpellet in 1 ml der Zellsortierungspuffer. Stellen Sie den Zellsortierer an die richtigen Vorwärts- und Seitenstreu Einstellungen mit Hilfe eines ungefärbten steuern. Verwenden Sie die einzelnen gefärbten Kontrollen, die richtigen Einstellungen für jedes Fluorophor einzurichten.
   13. Verwenden Sie eine kleine Probe der doppelt gefärbten Zellsuspension; Wählen Sie die 2 Populationen sortiert werden und weisen die jeweiligen Ladungs ​​korrekte Erhebung der sortierten Zellen zu gewährleisten.
   14. Zugabe von 200 ul der Zellrückgewinnungsmittel in die Sammelröhrchen, um sicherzustellen, dass die sortierten Zellsuspension abgefedert wird und zum Zeitpunkt des Sortierens geschützt. Ernten Sie den Wunsch Anzahl der Zellen und Übertragung auf neue Imef Gerichte mit frischemly vorbereitet Recovery Medium.
   15. Ändern Sie das Medium folgende Inkubation über Nacht mit dem Recovery-Medium. Die Kulturen müssen anschließend zugeführt und agierten routinemßig HPSC Medium, enthaltend Penicillin / Streptomycin (100 Einheiten / ml Endkonzentration) verwendet wird.

6. Endpoint Analysis

1. Terminal Alkalische Phosphatase (AP) Staining
   1. Verwenden Sie Terminal chromogenen AP-Färbung zu beobachteten kinetischen und morphologischen Ereignisse mit der endgültigen Umprogrammierung Effizienzen korrelieren.
   2. Nach 21 Tagen vor der Reprogrammierung, entfernen das Kulturmedium aus dem Brunnen mit Terminal AP Fleck und waschen Sie einmal mit 200 mM Tris-HCl (pH 8,0) gefärbt werden.
   3. Die geeignete Menge der Färbungslösung gemäß Herstelleranleitung in 200 mM Tris-HCl gerichtet.
   4. Saugen Sie das Waschen und 2 ml der vorbereiteten Färbungslösung in jede Vertiefung. Inkubieren für 20 bis 30 min bei Raumtemperatur und entfernt von the Licht.
   5. Saugen Sie die Färbelösung und waschen einmal mit 200 mM Tris-HCl. Entfernen Sie die Wäsche und mit destilliertem Wasser vor der Visualisierung.
   6. Nehmen Sie das kolorimetrisches Signal ein normales Bild Kamera. Zählen Sie die Anzahl der positiv gefärbten Kolonien von Hand. Visualisieren Sie den Fleck Fluoreszenzanalyse in der Trit-C-Kanal verwenden, da der Fleck in der Natur auch fluoreszierend ist, und führen Ganz gut Bildgebung und analysiert, um die Ganz gut Imager. Verwenden Protokoll des Herstellers.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Überwachung Reprogrammierung Kinetics Mit Flow Cytometry

CD44 ist ein Fibroblasten - Marker während SSEA4 ein PSC Marker ^6,10 ist. Wie aus diesem Expressionsmuster erwartet, Durchflusszytometrie von BJ Fibroblasten zeigt eine SSEA4 ^- CD44 ⁺ Population, die die Schaffung von Quadranten Toren in Kombination mit der ungefärbten Probe erleichtert. Während Reprogrammierung von DF1 Fibro...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

This study provides strategies for monitoring and tracking of the reprogramming process using flow cytometry and real-time imaging-based analysis. The critical steps in the protocol are initiating reprogramming, measuring reprogramming progression based on marker expression and real-time monitoring of reprogramming. Any reprogramming method of choice can be used but here we focus on Sendai based reprogramming of human fibroblasts. The advantage of this method is the ease of use and consistent high efficiency of reprogram...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	10569-010
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin	Thermo Fisher Scientific	16141-061
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300-054
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts	Thermo Fisher Scientific	A24903
Attachment Factor Protein (1x)	Thermo Fisher Scientific	S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	10565-018
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023
Collagenase, Type IV, powder	Thermo Fisher Scientific	17104-019
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12563-011
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Thermo Fisher Scientific	A1413302
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0264
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575-020
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)	Thermo Fisher Scientific	15260-037
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
InSolution Y-27632	EMD Millipore	688001
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit	Thermo Fisher Scientific	A1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit	Thermo Fisher Scientific	A16517
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal	ATCC	CRL-2522
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast	Thermo Fisher Scientific	N/A
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells	Thermo Fisher Scientific	R7799-105
IncuCyte ZOOM	Essen BioScience
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70)	Thermo Fisher Scientific	SSEA421
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70))	Thermo Fisher Scientific	A14810
SSEA-4 Antibody (MC813-70)	Thermo Fisher Scientific	41-4000
TRA-1-60 Antibody (cl.A)	Thermo Fisher Scientific	41-1000
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A27094
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging	Thermo Fisher Scientific	A25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7)	Thermo Fisher Scientific	RM-5700 (no longer available)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A-11029
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A-11007
Alkaline Phosphatase Live Stain	Thermo Fisher Scientific	A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging	Thermo Fisher Scientific	A25618
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate	Thermo Fisher Scientific	MHCD2401
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01)	Thermo Fisher Scientific	A15737
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9)	Thermo Fisher Scientific	A15755
CD73 / NT5E Antibody (7G2)	Thermo Fisher Scientific	41-0200
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope	Carl Zeiss	491912-0003-000
FlowJo Data Analysis Software	FLOJO, LLC	N/A
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser	Thermo Fisher Scientific	Use Attune NXT
S3e\ Cell Sorter (488/561 nm)	BIO-RAD	1451006
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap	Corning	352235
Falcon 15 ml, high-clarity, dome-seal screw cap	Corning	352097
Falcon T-75 Flask	Corning	353136
Falcon T-175 Flask	Corning	353112
Falcon 6-well dish	Corning	353046
Heraeus Heracell CO2 Rolling Incubator	Thermo Fisher Scientific	51013669
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 ml		AM12450
HulaMixer Sample Mixer		15920D