JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Özet

kanser hücreleri ve çevresindeki kanserli olmayan stroma arasındaki erken heterotypic etkileşimleri anlamak stromal aktivasyonu ve tümör mikro-(TME) kurulmasına yol açan olaylar durulaştırmada önemlidir. In vitro ve TME vivo modellerde çeşitli geliştirilmiştir; Bununla birlikte, genel olarak bu modeller hali hazırda daha fazla çalışma, bozucu olmayan koşullar altında, tek tek hücre popülasyonlarının izole izin vermez. Bu zorluğu aşmak için, uzun bir co Ucun zarın her iki tarafında ayrı ayrı iyice büyümüş zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarının kolay üretilmesi, fakat izin veren bir geçirgen mikro gözenekli membran geçme oluşan bir hücre büyütme alt-tabaka kullanılarak bir in vitro TME modeli kullanmışlardır -Kültür kez. Bu modelin kullanımı sayesinde, normal diploid insan fibroblastlarında den (CAF) popülasyonu aşağıdaki önemli ölçüde zenginleştirilmiş kanserle ilişkili fibroblast üretme yeteneğine sahiptirFloresan etiketleme ve / veya hücre sıralama kullanılmadan yüksek düzeyde metastatik insan göğüs karsinom hücreleri ile birlikte-kültür (120 saat). Ayrıca, ekin gözenek boyutu modüle ederek, biz gelişimini altında yatan mekanizmaların soruşturma izin iki heterotypic hücre popülasyonları arasındaki hücrelerarası iletişimi (örneğin, boşluk kavşak iletişim, salgılanan faktörler) modu için kontrol edebilirsiniz gap junction geçirgenliği rolü de dahil olmak üzere TME,. Bu model kanser stroma başlatılması, TME erken evrimi ve terapötik ajanlar kanser hücrelerinin yanıtları stroma modüle etkisi yol açan ilk olayların anlayışımızı arttırmak değerli bir araç olarak hizmet vermektedir.

Giriş

tümör mikro (TME) arada var ve ev sahibi stroma yanında gelişmeye karsinom hücreleri oluşan son derece karmaşık bir sistemdir. Bu stromal bileşeni, tipik olarak fibroblastlar, miyofibroblastlar, endotel hücreleri, çeşitli bağışıklık bileşenlerinin, hem de hücre dışı bir matris 1 oluşur. Önemli bir bileşen, bu stroma genellikle çoğu, aktive edilmiş fibroblastlar, sıklıkla kanserle ilişkili fibroblast veya karsinoma ile ilişkili fibroblastlar (CAF) 2,3 olarak adlandırılır. Normal, aktif olmayan fibroblastlar aksine cafs meme, prostat, akciğer, pankreas, deri, kolon, özofagus olmak üzere karsinom, çok çeşitli tümör başlaması, ilerlemesi, anjiyogenez, invazyon, metastaz ve nüks 4-11 katkı ve 5,6,12-17 yumurtalık. Oysa, kanser patogenezinde boyunca cafs katkısı kesin doğası yetersiz tanımlanmış kalır. Ayrıca, klinik kanıtlar cafs bir prognostik değeri göstermiştirYüksek dereceli maligniteler, tedavi yetmezliği ve genel olarak kötü prognoz 10,18,19 kendi varlığını ilişkilendirilmesi.

Açıkçası, CAF geliştirme başlatılması olaylar yanı sıra TME içindeki rollerini aracılık hücrelerarası iletişim anlayışımızı geliştirerek, hasta sonuçlarını geliştirmek heyecan verici yeni tedavi hedefleri ve gelişmiş stratejileri sağlayabilir. Bu amaca yönelik olarak, in vivo ve in vitro modellerde çok geliştirilmiştir. In vivo yaklaşımlar hastaların TME daha yansıtıcı olmakla birlikte, içinde ve tümörler arasında hem muazzam karmaşıklığı ve heterojenliği dahil sınırlamalar sahiptirler. Ayrıca, insan denekler tümör örnekleri genellikle oldukça TME geliştirilen temsil ve TME başlatılması olayların bir anlayış izin vermez. Deneysel hayvan çalışmaları nedeniyle fiziksel durumları farklılıklardan ancak insanlara hayvan verilerinin genelleme dikkatli yapılmalıdır bazı avantajlar sunarBu tür kemirgenlerde (örn tiyol kimya 20, metabolizma hızı 21 tolerans vb 22 vurgulamak) olarak insanlar ve hayvanlar arasında ology. Ayrıca, doğada genetik olarak heterojen olan insan nüfusunun, aksine, laboratuvar hayvanları genellikle homojenlik için yetiştirilmektedir. Ayrıca, geçici fizyolojik değişimleri ve hücre fenotip değişiklikleri incelemek için, yanı sıra, kemirgenler gibi hayvan kullanarak belirli deneysel parametrelerin kontrol etmek için çoğu zaman zordur. Bu nedenle, in vitro, 2- ve 3-boyutlu (2D ve 3D) doku kültürü modelinde sık TME gelişmenin temel anlayışı ilerletmek için kullanılmaktadır. In vivo sistemlerinin karmaşıklığı doğru bir canlandırdığı onların eksikliği rağmen, bu modeller büyük ölçüde mekanik soruşturma kolaylaştırmak avantajlar sunmaktadır. In vitro modeller TME daha basitleştirilmiş odaklı ve uygun maliyetli analizi için, bu sayede istatistiksel olarak anlamlı izin veri oluşturulabilirhayvanlarda ortaya çıkan sistemik varyasyonlar serbest hücreleri.

In vitro sistemlerinde birçok çeşidi vardır. En sık kullanılan iki TME in vitro model karışık tek tabaka ya da sferoit hücre kültürleri içerir. Hem kültür yöntemleri arası etkileşimleri ve çeşitli TME spesifik hücre fenotipi değişikliklerin analizi için (tümör hücreleri ile, örneğin, normal hücreler) temel çalışmaları için avantajlıdır (örneğin normal fibroblastlardan kanserle ilişkili fibroblastlar ortaya çıkması). Ayrıca, küremsi TME daha yansıtıcı doku benzeri bir yapı oluşturmak edebiliyoruz, ve tümör heterojenliği 23 temsilcisi olabilir. Ancak sferoidler genellikle deneysel sonuçlar 24 zorlaştırabilir katmanlar arasında büyük ölçüde değişen oksijen basıncı geçişlerini, üretirler. Ne yazık ki, iki model son derece ko- aşağıdaki ileri karakterizasyon ve çalışma için saf hücre popülasyonlarının izole etme yeteneği sınırlıdırkültür. bu nedenle floresan etiketli veya tespit makinesi ile etiketlenmiş ve daha sonra hücre popülasyonları ayırmak için ayırma geniş işleme ve hücreye ko-kültür karıştırılır tabi olması için en azından bir hücre tipi gerektirecektir yapmak. Hücre sıralayıcı oldukça saf bir hücre popülasyonu izole edebilen birlikte, bir selüler stres ve muhtemel mikroplu kirliliklere farkında 25 riski olmalıdır.

Hücrelerarası iletişimi anlaşılmasını kolaylaştırmak için, büyük çabalar geliştirmek ve basitleştirilmiş bir yaklaşım izin yakından, in vivo ortamda taklit in vitro sistemlerde optimize edilmesine yönelik tahsis edilmiştir. Böyle bir alet geçirgen mikro gözenekli insert, ilk 1953 26 yılında geliştirilen ve daha sonra farklı uygulamalar ve çalışmalar (örneğin, hücre polarite 27 endositoz 28, uyuşturucu taşımacılığı 29, doku modelleme 30, fert için adapte edilmiş bir zar substratyonu 31 seyirci kalma etkisi 32,33, vs.). Bu sistem geçirgen olmayan plasticware üzerinde kültürlendiklerinde gözlenmez 34,35 işaretleyicileri in vivo birçok in vivo benzeri anatomik ve fonksiyonel farklılaşma hücrelerin büyümesini, hem de ifadeyi verir. Ayrıca, son derece ince gözenekli membran (10 mikron kalınlığında) in vivo ortamda taklit ve hem üst ve taban hücre etki bağımsız hücre işleyişini izin moleküller ve dengeleme kez hızlı difüzyon izin verir. zar, gözenekler içinden içi çeşitli iletişim modu koruyarak TME sistemi olarak ucun yardımcı ilave bir avantajı, aynı çevre koşulları zarın her iki tarafında yetiştirilen iki heterotipik hücre popülasyonlarının fiziksel olarak ayrılmasıdır. Fiziksel olarak ayrılmış olmasına rağmen, iki hücre popülasyonları metabolik de olduğu gibi, salgılanan elemanları üzerinden bağlandığı veAyrıca boşluk kavşak kanallardan, burada tarif. Ayrıca, in vivo kısmi oksijen basıncı da ekler (PO 2) sürdürerek, model diğer sistemlerde gözlenen oksijen ve kimyasal geçişlerini komplikasyonlarını azaltır. Aksine, bu TME kontrol doğal mekanizmaların anlaşılması artırır. Özellikle, iki hücre popülasyonları kolaylıkla eş-kültür uzun süreler aşağıdaki flüoresan etiketleme ve / veya hücre sıralama olmaksızın, yüksek saflıkta izole edilebilir.

Burada membran gözenekleri sayesinde, sürekli iki-yönlü iletişim henüz insan meme karsinoma hücreleri ve geçirgen bir mikro gözenekli membran geçme her iki tarafında sırasıyla yetişkin insan fibroblastlarında oluşan bir in vitro TME protokol açıklar ama. Biz gösteriyor ki gelişimine farklı gözenek boyutları ile, hücrelerarası iletişimi belirli bir tip katkısı (gap junction karşı, örneğin salgılanan faktörler) membranlar kullanılarakTME araştırılabilir.

Protokol

Kültür Medya ve Hücre 1. Hazırlık

  1. Eagle minimum zorunlu% 12.5 (hacim / hacim) ile desteklenen ortamda ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 2 mM L-alanil-L-glutamin ve penisilin 100 birim 500 ml ml streptomisin, 100 ug hazırlayın.
    Not: büyüme ortamı ve ek (ler) i, kolayca diğer hücre suşlan veya hücre hatları büyüme gereksinimleri için değiştirilebilir.
  2. her bir ek (6-çukurlu format insert) hücre kültür ortamının 70 ul hazırlayın: bir Eagle minimum zorunlu ortam% 50 (hacim / hacim) ısı ile inaktive edilmiş FBS, 2 mM L-alanil-L-glutamin ve 100 birim ile desteklenmiş penisilin ve ml streptomisin, 100 ug.
    Not: orta parçanın alt tarafında (yani, alt) hücre bağlanmasını kolaylaştırmak için% 50 FBS ile takviye edilmektedir. Büyüme ortamı, ve ek (ler) i, kolayca diğer hücre suşlan veya hücre hatları büyüme gereksinimleri için değiştirilebilir.
  3. parçanın alt tarafında kaplama olan tahsis edilmiş hücrelerin bir hücre süspansiyonu.
    NOT: Burada, sonuçları AG1522 75 cm 2 hücre kültürü şişeleri yetiştirilen normal insan fibroblastlar kullanılarak elde edildi ve bu hücreler bu nedenle hücre süspansiyonu hazırlık açıklamasının odak noktası olacaktır.
  4. hücreleri toplamak için, büyüme ortamı çıkarın ve 5 mi 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ile hücre mono tabakasının 2x yıkayın.
  5. PBS çıkarın ve RT (oda sıcaklığı), 2 dakika için bir hücre boyunca oda sıcaklığında (RT) önceden ısıtılmış 2.21 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), tripsin,% 0.25 (hacim / hacim) 1 ml yayın.
  6. (Adım 1.1 hazırlandı) tam büyüme ortamında 9 ml tripsin aktivitesinin sönmesi yavaşça şişeye 10x yüzeyi üzerine hücre süspansiyonu pipetle hücreleri toplamak.
  7. Hemasitometre veya elektronik sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin ve provid olacak hücre süspansiyonu hacmi pipetE, bir steril 15 ml santrifüj borusu ile ekleme başına 250.000 hücre.
  8. Santrifüjle hücre süspansiyonu (800 xg, 2 dakika) sonra pelet. 70 ul başına 250.000 hücre konsantrasyonu elde etmek için (adım 1.2 'de elde edilmiş) büyüme ortamı hücre pelletini süspanse edin.
    Not: geçiren mikro gözenekli membran uçlar hücre kültürü 2B alt tabakalar göre gibi hücreleri başlangıçta bağlanmasını kolaylaştırmak için% 50 (hacim / hacim) FBS ihtiva eden bir ortam içinde askıya alınmalıdır hariç Hücre Serpilmesi benzer şekilde gerçekleştirilir.

Ek'lerin 2. Hazırlık

NOT: hücre kültürüne adanmış bir laminer akış biyolojik güvenlik kabininde steril koşullar, çalışmasını sağlamak için.

  1. 0.4 um membran gözenek boyutu, 1 mikron ya da 3 uM seçin uçlar ile (gözenek büyüklüğü deney çıkar (ler) ile tespit, hücreler arası iletişim farklı mod rolünü araştırmak için kullanılabilir).
    NOT: 0,4 mikron gözenek smal olduğunuYeterince l uç zarın her iki tarafında hücreler arasında işlevsel boşluk bağlantıları oluşumunu sınırlamak ve salgılanan faktörlerle arası iletişim incelemek için kullanılabilir. Oysa, 1 um ile 3 um gözenekler, fonksiyonel boşluk bağlantıları oluşumuna izin verecek kadar büyüktür ve boşluk bağlantıları ve salgılanan faktörler hem arası iletişim incelemek için kullanılabilir.
  2. ambalajından bireysel ekler çıkarın ve eşit büyüklükteki çok iyi çanak içine yerleştirin.
    NOT: Uçlar belirli uygulama ihtiyaçlarını karşılamak üzere çeşitli membran yüzey alanları mevcuttur (örneğin, 6-kuyu, 12-kuyu ve 24 kuyu ekler.). Burada, sonuçlar 6-kuyu insert kullanılarak elde edildi ve bu nedenle modeli açıklaması odak noktası olacaktır.
  3. çanak kapaklı ekler içeren, çanak örtün. Iki eliyle çok iyi yemek Holding, yavaşça ekleme dipleri (yani, alt) artık yukarı bakacak şekilde çanak ters çevirin.
  4. th kaldırinsertlerin alt tarafına maruz bırakılması çok çukurlu tabak E taban. Bir defada bir ekleme ile çalışarak, forseps steril bir çifti kullanmak ve yavaşça yerine insert tutun. serbest el ile 250,000 hücre ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (adımları 1.3-1.8 hazırlandı) 70 ul çekmek için bir geniş ağızlı uç, bir pipet kullanın.
  5. Hücreleri plaka, Ucun zarının ortasına hafifçe pipet ucu yerleştirin ve yavaş yavaş zarın yüzeyi etrafında pipet hareket ederken yavaş yavaş hücre süspansiyonu 70 ul pipet. ucun kenarına pipet ve hücre süspansiyonu uzatmak için dikkatli olun.
    Not: ekleme kenarına temas birleştirilmesi esnasında kurutma hücrelerine yol açmakta ve hücre süspansiyonu kapiler gerilimi kaybına neden olabilir.
  6. bakım icra olmamak olası mikrobiyal kontaminasyonu önlemek maruz kalan uçlar üzerinde doğrudan çalışmak için birlikte kalan uçlar için tekrarlayın.
  7. Yavaşça çok-iyi dönüşçanak alt ekler kapsayacak. Ters uçlar ile çanak tutulması, 30-45 dakika süreyle 37 ° C de% 5 (hacim / hacim) CO2 bulunan nemli bir hava atmosferinde inkübe edin.
    NOT: insert temas kuyunun alt hücre süspansiyonu, dikkatle çanak altını kaldırın ve hafif bir açı oluşturur ve çanak yüzeyi arasında daha fazla ayrılık yaratır, böylece yemeğin üstüne kenarında onu dinlenme halinde ve (hücreler numaralı seribaşı) ekler alt tarafı. Bu yerine geçmenin gözlerin yüzlerine takılarak hücreleri engeller.
  8. 30-45 dk inkübasyon süresi sonrasında nazikçe ekler içeren çanak kaldırmak ve laminer akış biyolojik güvenlik kabini yerleştirin.
  9. İki elleri ve sıkı çanak kapağı tutulması ile yavaşça ekli hücreleri içeren ekler alt tarafı şimdi aşağı bakacak şekilde çanak yeniden ters çevirin.
  10. 3 mikron gözenek Migrati önlemek için ekler için yavaş ve dikkatli 2 ml (1 ml ekleyinekin alt kısmı batırılır ve böylece önceden ısıtılmış tam ortam insert gözenek) içinden hücre ile (her bir oyuğa adım 1.1), bkz.
  11. ekler içeren tüm kuyularda büyüme ortamı ekledikten sonra, nemlendirilmiş bir inkübatör geri çanak yerleştirin.
  12. uçlar 48 saat boyunca inkübatör rahatça durmasına izin verin. 48 saat sonra, kuyunun dibinden ortam 2 ml aspire ve taze büyüme ortamına 2 ml ekleyerek hücreleri beslenir.
  13. Bunlar için (daha önce alt tarafta artan ilk hücre nüfusu insert, üst tarafında ikinci hücre popülasyonunun süspansiyonu (~ 250,000 hücre / ml) de, tohum, 1 ml alt taze ortam ilave edildikten sonra deneyler, AG1522 (kontrol) hücreleri veya kanser (deney) hücreleri) eklentilerin alt tarafında büyüyen, cafs olmaya aday önce AG1522 hücrelerine sahip ekler, üst üste yerleştirilir. nemlendirilmiş bir inkübatör geri tabak koyun.
    NOT: Eğer işekin alt de uygun olmayan hücrelerle ing, bu hücreler sokma üst tarafında yetiştirilebilir.
  14. de insertinin alt ve üst, orta aspire ucun üst tarafına hücre popülasyonu ikinci bir tohumlama sonra 24, 72, orta ve 96 saat değiştirin. Yavaşça, çukurun tabanına ucun üst tarafına taze ortam 1 ml ve 2 ml ekleyin. İki hücre popülasyonları 120 saat boyunca geçirgen, mikro gözenekli membran çanağı her iki tarafında ko-kültür kalmasına izin verir.

3. Trypsinization tarafından Ekle gelen Hücreleri Toplama

Not: zenginleştirilmiş hücre popülasyonu elde etmek kolaylığı ek olarak, uç TME modeli aynı zamanda benzer bir deneysel tedavi için (örn, kimyasal maddeler, yukarıda belirtilen ya da çevre atmosferinde aşağıdaki oksijen koşullarına maruz, iyonize radyasyon tedavisi, vb inkübasyon) halinde diğer in vitro TME ko-kültür modelleri. Ayrıca, geçirgen uç ko-kültür substratı önce standart 2D doku kültürü modelleri için gelişmiş işlemler ile analiz edilebilir. Örneğin, hücreler (in situ imüno-algılama, Batı beneklenmesinde örneğin) daha sonra bitiş noktası analizi için kullanılabilir zenginleştirilmiş popülasyonları elde etmek üzere uç zarın her iki tarafında hasat edilebilir ve daha sonraki deneyler 36 için yayılabilir.

  1. hücreleri toplamak için, büyüme ortamından parçayı çıkarın ve 1 ml PBS içeren 35 mm hücre kültürü çanak içine yerleştirin. 1 ml PBS ile uç 1x alt ve üst tarafı yıkanır.
  2. PBS çıkarın ve% 0.25 2.21 mM EDTA, tripsin (hacim / hacim), 200 ul, oda sıcaklığına kadar ön ısıtılmıştır.
    1. parçanın alt tarafında yetiştirilen hücreler toplanması için, 35 mm çanak içine tripsin solüsyonu yerleştirin ve yavaşça oda sıcaklığında 2 dakika boyunca tripsin solüsyonu içine ucun alt tarafının.
    2. hücrenin toplanması halindeekin üst tarafında yetiştirilen s, 35 mm tabak içine ekleme yeri ve ekin üstüne tripsin solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edilir.
  3. tam büyüme ortamında 800 ul ekleyerek tripsin aktivitesinin sönmesi.
    1. ekin alt yetiştirilen hücreler toplanması için, 35 mm çanak büyüme ortamı ilave edin ve yavaşça Hafifçe tutulmakta olan, ucun 10 kat yüzeyi üzerine hücre süspansiyonu 1 ml pipetleme hücreleri toplamak açı, hücre süspansiyonu çanak içine toplar şekilde.
    2. ucun üst tarafından hücrelerin toplanması, üst tarafına bir büyüme ortamı ilave edin ve yavaşça insertin 10x yüzeyi üzerine hücre süspansiyonu 1 ml pipetle.

Akış Sitometrisi ile Hücre Saflık 4. Karakterizasyonu

Not: t saflığını korumak için geçirgen, mikro gözenekli membran ekler karakterize etme kabiliyetini120 saat kadar bölümler 1-3, yeşil floresan protein (GFP) ile yapıldı (yani üst ve alt), iki hücre popülasyonları MDA-MB-231 hücreleri ucun üst tarafına kaplanan etiketli ve olmayan GFP etiketli AG1522 hücreleri, 0.4 μm- alt tarafındaki 1 μm- veya 3 mikron gözenek uçlar kaplanan.

  1. Parçanın alt taraftan hücreleri (yöntem Bölüm 3'te tarif edilmiştir) toplandı bir kez santrifüj ile hücre süspansiyonu (500 g, 30 sn) pelet.
  2. Süpernatantı ve% 1 (hacim / hacim) FBS ile desteklenmiş Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde 400 ul hücre pelletini askıya.
  3. GFP ve GFP foton emisyonu 37 algılamak için 530/30 bir bant geçirici filtresi heyecanlandırmak için sitometresinde bir 488 nm lazer ile donatılmış bir akış sitometrik analizi yapın.
  4. Hücre tanımlama amacıyla, akış sitometresinde ileri ayarlamak için AG1522 kontrol hücre popülasyonları ve yan dağılım gerilimleri kullanın. ayarlamakGFP kanal voltaj GFP sinyali için alt saptama eşiği olarak hücresel otofloresans değerini ayarlamak için.
  5. Kontrol hücreleri kullanılarak eşik yolluk belirleyin. kontrole karşı GFP pozitif hücrelerinin varlığı göre her hücrelerinin saflığı değerlendirmek.
    NOT: Saf nüfus tespit hiçbir GPF-pozitif hücrelerin yansıtıcı olacaktır.

Yerinde imünofloresansta tarafından Hücreleri 5. Karakterizasyonu

  1. Ekin hücreleri tripsinizasyon sonra (bölüm 3) hücreleri toplamak, levha 5 x 10 4, steril cam kapak slipleri 250 ul büyüme ortamı (adım 1.1) hücreleri ve bir nemli hava atmosferinde 1 st için takmak için izin 37 ° C inkübatör% 5 (hacim / hacim) CO2.
  2. İnkübasyonun sonunda, yumuşak lamel ihtiva eden tabağı çıkarın ve bir laminer akış biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin.
  3. Dikkatle (adıma bakın önceden ısıtılmış tam orta 2 ml ekleyin1.1) tabakların her birine, böylece lamel batırılır.
  4. Lamelleri içeren tüm yemekler için büyüme ortamı ilave edildikten sonra, 48 saat için bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de% 5 (hacim / hacim) CO2 nemlendirilmiş hava atmosferine geri yemekler döndürür.
  5. 48 saat inkübe edildikten sonra, PBS ile örnek 3x yıkama ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde% 4 (ağırlık / hacim) formaldehid ile tespit edin.
  6. Tris tamponlu tuz (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCI) ile 5x yıkayın ve daha sonra 5 dk için 0.25,% (hacim / hacim) Triton X-100,% 0.1 (ağırlık / hacim) bir saponin ile geçirgen hale RT.
  7. spesifik olmayan% 2 (hacim / hacim) normal keçi serumu (NGS),% 1 (ağırlık / hacim) sığır serum albümini (BSA),% 0.1 (hacim / hacim) TBS içinde Triton X-100 ile bağlanma sitesi bloğu (bloke oda sıcaklığında 1 saat için çözelti).
  8. gece boyunca 4 ° C'da, çözelti engelleme: birincil antikor (1.000 anti-Caveolin 1 (CAV1), 1) kuluçkalayın.
  9. % 0.2 NGS (hacim / hacim),% 1 (ağırlık / hacim) BSA,% 0.1, bağlanmamış birincil antikor (3x, 5 dak / yıkama) yıkayın (voL / hacim) TBS içinde Triton X-100 (yıkama çözeltisi).
  10. bloke etme çözeltisi 1 saat süre ile, oda sıcaklığında, ikincil antikor ile inkübe (bölüm 5.4).
  11. ilişkisiz ikincil antikor yıkama solüsyonu ile (3x, 5 dakika / yıkama) yıkayın (adım 5.6).
  12. Dağı 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bir anti-solmaya montaj orta ile bir slayt lamelleri ve tırnak cilası ile mühür.
  13. floresans uyarma için harici bir ışık kaynağı ile donatılmış bir inverted mikroskop üzerinde 63X petrol büyütme objektif kullanarak hücrelerin gözlemlemek ve sonraki analiz için bağlı bir dijital kamera kullanarak görüntü yakalamak.

Western Blot ile hücrelerin 6. Karakterizasyonu

NOT: Western blot süreciyle başka 38 tarif edilmiştir. Kısa bir anahat burada tarif edilir:

  1. Trypsinization tarafından Ovülden hücrelerin ayrılmasını takiben, (bkz bölüm 3) santrifüj (500 gr, 30 sn) ile hücre süspansiyonu pelet.
  2. Süpernatantı ve 100 ul PBS ile hücre topağı 2x askıya.
  3. değiştirilmiş Radyoimmunopresipitasyon tahlilinde 50 ul süpernatan ve lize hücreleri çıkarın (RIPA) tamponu (Tris pH 7.5, 50 mM NaCl 150 mM, NP-40,% 1 (hacim / hacim), sodyum deoksikolat monohidrat (DOC)% 0.5 (hacim / hacim), sodyum dodesil sülfat (SDS),% 0.1 (hacim / hacim)), proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyl ihtiva etmektedir.
  4. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 19,000 g'de buz ve santrifüj 20 dakika boyunca inkübe edin.
  5. RIPA tamponu içinde deterjan uyumlu bir protein optik yoğunluk deneyi kullanılarak süpernatan protein konsantrasyonunu belirleyin.
  6. 0.2 um nitroselüloz zar üzerine elektroblot, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) tarafından ayrı proteinler.
  7. % 0.1 (hacim / hacim) Tween-20 (TBST) ve% 4 (ağırlık / hacim) içeren TBS içerisinde zarlar inkübe 60 dakika süre ile, süt (engelleme çözelti) yağsız ve (bir gece boyunca 4 ° C'de ana antikorla reaksiyona antiCAV1, 1: 1,000).
  8. RT (5 dk / yıkama) de TBST ile zar 3x yıkayın.
  9. yaban turpu peroksidazı (HRP) (: 5.000: 1) ile konjuge edilmiş bir anti-fare ikincil antikoru içeren çözelti bloke 30 dakika boyunca zarların inkübe edin.
  10. RT (5 dk / yıkama) de TBST ile zar 3x yıkayın.
  11. Bir Western lekeleme algılama sistemi kullanarak kemilüminesans ile reaksiyon ürünleri gözünüzde canlandırın.

Akış Sitometrisi ile Hücreler arası İletişimin 7. Karakterizasyonu

NOT: geçirgen mikro gözenekli membran uyum karakterize etmek için hücreler arası iletişimi (örneğin, salgılanan faktörler, gap junction) farklı mod incelemek için ekler. Bölümler 1-2,12 floresan olmayan AG1522 hücreleri 0.4 μm- alt tarafı, 1 μm- veya 3 um gözenekli ekler ile kaplanan ile yapıldı.

  1. Kültür, Bölüm 1.1'de tarif edilen ortam kullanılarak% 90 konfluansa kadar 35 mm çanak AG1522 hücreleri etiketli olmayan.
  2. RINSE hücreleri HBSS 1 ml 1x.
  3. Kalsein AM ile 30 | im ihtiva eden HBSS içinde hücrelerin inkübe edilmesi ile Calcein AM Yük hücreleri.
  4. 37 ° C de% 5 (hacim / hacim) CO2 bulunan nemli bir hava atmosferinde 15 dakika boyunca inkübe edin.
  5. Yıkama hücresi HBSS 1 ml 2x.
  6. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 2.21 mM EDTA,% 0.25 tripsin 200 ul çözelti (hacim / hacim) ilave edilerek Hücreleri tripsinize edin.
  7. % 12.5 içeren tam bir ortam (hacim / hacim) FBS, 800 ul ekleyerek tripsin aktivitesinin sönmesi.
  8. tekrarlanan pipetleme süspansiyon içine hücreleri getirin.
  9. Hemasitometre veya elektronik sayaç kullanılarak hücre konsantrasyonunu belirlemek önce alt tarafta büyüyen AG1522 hücrelerine sahip eklerin üst tarafına kalsein AM ile yüklendi 250.000 hücre plaka.
  10. 37 ° C de% 5 CO2 bulunan nemli bir hava atmosferinde uçlar inkübe 6 saat.
  11. tarif edildiği gibi 6 saat sonra, ara parça alt tarafından hücreleri toplamak3. bölümde.
  12. santrifüjle hücre süspansiyonu (500 g, 30 saniye) sonra pelet.
  13. Süpernatantı ve% 1 (hacim / hacim) FBS ile desteklenmiş HBSS 400 ul hücre pelletini askıya.
  14. lazer ile donatılmış bir sitometresindeki hücreleri analiz ve heyecan verici yeteneğine sahip filtre ve üretici protokol uyarınca, Calcein (496 nm ve 516 nm, sırasıyla) emisyonunu tespit.
  15. Hücre tanımlama amacıyla, akış sitometresinde ileri ve yan dağılım gerilimleri ayarlamak için bir lekesiz AG1522 kontrol hücre popülasyonu kullanın. Calcein sinyali için alt saptama eşiği olarak hücresel otofloresans değerini ayarlamak için Calcein kanal gerilimini ayarlamak.
  16. Calcein yüklü kontrol hücreleri kullanılarak üst eşik sınırını belirleyin. kontrole karşı Kalsein-pozitif hücrelerinin varlığı temelinde her bir hücre ekleme için iletişim değerlendirmek.

Sonuçlar

Burada in vivo tümör mikro-(Şekil 1) taklit eden bir in vitro heterotipik hücresi eş-kültür sistemi geliştirmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran inserti adapte. İki farklı hücre popülasyonları (eden kullanım sırasında, 120 saat kadar) uzun zaman süreleri için ucun gözenekli membranın her iki tarafındaki yetiştirilmeye Bu sistem sağlar. 0.4-, 1- veya 3 m gözenekli eklerin üst tarafında GFP etiketli, MDA-MB-231 hücre...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol geçirgen bir mikro gözenekli membran geçme heterotipik hücre ko-kültür zenginleştirilmiş bir hücre popülasyonlarının üretmek için kullanıldığı bir basit, in vitro prosedür adapte edilebilir (Şekil 1). Belirgin bir şekilde, örnek arası çeşitli iletişim modu araştırılması için uygundur. kritik adımlar üst tarafında ikinci bir hücre popülasyonu tohumlama,% 50 FBS ile takviye edilmiş ortam içinde parçanın alt tarafında, ilk hücre...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip veya çakışan çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

This research was supported by grants from the New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), the National Institutes of Health (CA049062), and the National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblastCoriell107661Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell linePerkinElmer119261Parental line: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell lineCell BiolabsAKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)Corning Cellgro15-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), QualifiedSigmaF6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine)Corning Cellgro25-015-Cl
Penicillin Streptomycin Solution, 100xCorning Cellgro30-002-Cl
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore)Costar3450
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore)Greiner bio-one657610
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore)Costar3452
6-well Culture PlateGreiner Bio-One Cellstar657160-01
75 cm2 cell culture flaskCellStar658 170
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1xCorning Cellgro21-040-CVwithout calcium & magnesium
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1xCorning Cellgro25-053-Cl
15 ml Centrifuge TubeCellTreat229411
35 mm x 10 mm Cell Culture DishGreiner bio-one627 160
NameCompanyCatalog NumberComments
For Immunofluorescent Microscopy
Mouse anti-Caveolin 1BD Transduction Laboratories610406In situ Immunofluorescence - 1:5,000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugateThermoFisher ScientificA-11029In situ Immunofluorescence - 1:2,000
Bovine Serum Albumin - Fraction VRocklandBSA-50Immunoglobulin and protease free
16% (wt/vol) Formaldehyde SolutionThermoFisher Scientific28908Dilute to 4% with 1x PBS
Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1)Fisher12548B
Triton X-100SigmaT8787-50ML
SlowFade Gold antifade reagent with DAPIInvitrogenS36938
NameCompanyCatalog NumberComments
For Flow Cytometric Analysis
Calcein, AMMolecular ProbesC3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14025-076
NameCompanyCatalog NumberComments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1BD Transduction Laboratories610406Western Blot - 1:1,000
Tween-20BioRad170-6531
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm)BioRad162-0112
Western Lightning Plus-ECLPerkinElmerNEL104001EA
BioRad DC Protein AssayBioRad500-0116
Sodium dodecyl sulfate (SDS)BioRad161-0302
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC)SigmaD5670
IGEPAL CA-630 (NP40)SigmaI8896
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1BioRad161-0158

Referanslar

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
  3. Pandol, S., Edderkaoui, M., Gukovsky, I., Lugea, A., Gukovskaya, A. Desmoplasia of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clinical Gastroenterology and Hepatology: the Official Clinical Practice. Journal of the American Gastroenterological Association. 7 (11 Suppl), S44-S47 (2009).
  4. Dabbous, M. K., Haney, L., Carter, L. M., Paul, A. K., Reger, J. Heterogeneity of fibroblast response in host-tumor cell-cell interactions in metastatic tumors. Journal of Cellular Biochemistry. 35 (4), 333-344 (1987).
  5. Olumi, A. F., Grossfeld, G. D., Hayward, S. W., Carroll, P. R., Tlsty, T. D., Cunha, G. R. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59 (19), 5002-5011 (1999).
  6. Orimo, A., Gupta, P. B., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
  7. Schürch, W., Seemayer, T. A., Lagacé, R., Gabbiani, G. The intermediate filament cytoskeleton of myofibroblasts: an immunofluorescence and ultrastructural study. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 403 (4), 323-336 (1984).
  8. Nakagawa, H., Liyanarachchi, S., et al. Role of cancer-associated stromal fibroblasts in metastatic colon cancer to the liver and their expression profiles. Oncogene. 23 (44), 7366-7377 (2004).
  9. Choi, Y. P., Lee, J. H., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
  10. Ito, M., Ishii, G., Nagai, K., Maeda, R., Nakano, Y., Ochiai, A. Prognostic impact of cancer-associated stromal cells in patients with stage I lung adenocarcinoma. Chest. 142 (1), 151-158 (2012).
  11. Gaggioli, C., Hooper, S., et al. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature Cell Biology. 9 (12), 1392-1400 (2007).
  12. Navab, R., Strumpf, D., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7160-7165 (2011).
  13. Hwang, R. F., Moore, T., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
  14. Sneddon, J. B., Zhen, H. H., et al. Bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1 is widely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumor cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14842-14847 (2006).
  15. De Wever, O., Nguyen, Q. -. D., et al. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (9), 1016-1018 (2004).
  16. Zhang, C., Fu, L., et al. Fibroblast growth factor receptor 2-positive fibroblasts provide a suitable microenvironment for tumor development and progression in esophageal carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (12), 4017-4027 (2009).
  17. Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M. CLIC4 mediates TGF-β1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. , (2009).
  18. Crawford, Y., Kasman, I., et al. PDGF-C mediates the angiogenic and tumorigenic properties of fibroblasts associated with tumors refractory to anti-VEGF treatment. Cancer Cell. 15 (1), 21-34 (2009).
  19. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Seminars in Cancer Biology. 25, 61-68 (2014).
  20. Messina, J. P., Lawrence, D. A. Effects of 2-mercaptoethanol and buthionine sulfoximine on cystine metabolism by and proliferation of mitogen-stimulated human and mouse lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 14 (7), 1221-1234 (1992).
  21. Ames, B. N. Endogenous oxidative DNA damage, aging, and cancer. Free Radical Research Communications. 7 (3-6), 121-128 (1989).
  22. Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
  23. Upreti, M., Jamshidi-Parsian, A., et al. Tumor-endothelial cell three-dimensional spheroids: new aspects to enhance radiation and drug therapeutics. Translational Oncology. 4 (6), 365-376 (2011).
  24. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  25. Muraki, Y., Hongo, S., Ohara, Y. Contamination of the cell sorter fluidics system with the water-borne bacterium Burkholderia cepacia. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (2), 105-107 (2012).
  26. Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
  27. Tan, S., Tompkins, L. S., Amieva, M. R. Helicobacter pylori usurps cell polarity to turn the cell surface into a replicative niche. PLoS Pathogens. 5 (5), e1000407 (2009).
  28. Hyman, T., Shmuel, M., Altschuler, Y. Actin is required for endocytosis at the apical surface of Madin-Darby canine kidney cells where ARF6 and clathrin regulate the actin cytoskeleton. Molecular Biology of the Cell. 17 (1), 427-437 (2006).
  29. Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (80), e50638 (2013).
  30. Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (104), e53084 (2015).
  31. Bath, M. L. Inhibition of in vitro fertilizing capacity of cryopreserved mouse sperm by factors released by damaged sperm, and stimulation by glutathione. PLoS ONE. 5 (2), e9387 (2010).
  32. Zhao, Y., De Toledo, S. M., Hu, G., Hei, T. K., Azzam, E. I. Connexins and cyclooxygenase-2 crosstalk in the expression of radiation-induced bystander effects. British Journal of Cancer. 111 (1), 125-131 (2014).
  33. Buonanno, M., de Toledo, S. M., Azzam, E. I. Increased frequency of spontaneous neoplastic transformation in progeny of bystander cells from cultures exposed to densely ionizing radiation. PLoS ONE. 6 (6), e21540 (2011).
  34. Byers, S. W., Hadley, M. A., Djakiew, D., Dym, M. Growth and characterization of polarized monolayers of epididymal epithelial cells and Sertoli cells in dual environment culture chambers. Journal of Andrology. 7 (1), 59-68 (1986).
  35. Pitt, A., Gabriels, J. Epithelial cell culture on microporous membranes. American Biotechnology Laboratory. 4 (5), 38-45 (1986).
  36. Buonanno, M., de Toledo, S. M., Pain, D., Azzam, E. I. Long-term consequences of radiation-induced bystander effects depend on radiation quality and dose and correlate with oxidative stress. Radiation Research. 175 (4), 405-415 (2011).
  37. Ducrest, A. -. L., Amacker, M., Lingner, J., Nabholz, M. Detection of promoter activity by flow cytometric analysis of GFP reporter expression. Nucleic Acids Research. 30 (14), e65 (2002).
  38. Mercier, I., Casimiro, M. C., Wang, C. Human breast cancer-associated fibroblasts (CAFs) show caveolin-1 down-regulation and RB tumor suppressor functional inactivation: implications for the response to hormonal therapy. Cancer Biology & Therapy. , (2008).
  39. Martinez-Outschoorn, U. E., Pavlides, S., et al. Tumor cells induce the cancer associated fibroblast phenotype via caveolin-1 degradation: implications for breast cancer and DCIS therapy with autophagy inhibitors. Cell Cycle. 9 (12), 2423-2433 (2010).
  40. Witkiewicz, A. K., Dasgupta, A., et al. Loss of stromal caveolin-1 expression predicts poor clinical outcome in triple negative and basal-like breast cancers. Cancer Biology & Therapy. 10 (2), 135-143 (2014).
  41. Zhao, X., He, Y., et al. Caveolin-1 expression level in cancer associated fibroblasts predicts outcome in gastric cancer. PLoS ONE. 8 (3), e59102 (2013).
  42. Shaul, P. W., Anderson, R. G. Role of plasmalemmal caveolae in signal transduction. The American Journal of Physiology. 275 (5 Pt 1), L843-L851 (1998).
  43. Fujimoto, T., Kogo, H., Nomura, R., Une, T. Isoforms of caveolin-1 and caveolar structure. Journal of Cell Science. 113 (Pt 19), 3509-3517 (2000).
  44. Wartiovaara, J., Lehtonen, E., Nordling, S., Saxen, L. Do Membrane Filters prevent Cell Contacts. Nature. 238 (5364), 407-408 (1972).
  45. Tyan, S. -. W., Kuo, W. -. H., et al. Breast cancer cells induce cancer-associated fibroblasts to secrete hepatocyte growth factor to enhance breast tumorigenesis. PLoS ONE. 6 (1), e15313 (2011).
  46. Xu, J., Lu, Y., Qiu, S., Chen, Z. -. N., Fan, Z. A novel role of EMMPRIN/CD147 in transformation of quiescent fibroblasts to cancer-associated fibroblasts by breast cancer cells. Cancer Letters. 335 (2), 380-386 (2013).
  47. Hoffman, R. M. Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for the promised niche. Breast Cancer Research : BCR. 15 (3), 310 (2013).
  48. Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
  49. Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50 (4), 243-248 (1985).
  50. Vaupel, P., Schlenger, K., Knoop, C., Höckel, M. Oxygenation of human tumors: evaluation of tissue oxygen distribution in breast cancers by computerized O2 tension measurements. Cancer Research. 51 (12), 3316-3322 (1991).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Cancer ResearchSay 115Kanser BiyolojisiSayT m r Mikro evreKanser li kili fibroblastlarH creler aras ileti imGap Kav aklarEkstrasell ler Salgge irgen Mikro Membran tak nIn vitro K lt r Modelihipoksi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır