JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Genetik Ustilago Maydis'in karalamak mantar işlemek için Biz sağlam bir gen değiştirme stratejisini açıklar. Bu protokol enfeksiyon fenotipleri araştırmak için silme mutantlarını üretmek açıklar. Bir floresan protein etiketi kodlayan bir sekansı ilave olarak, örneğin, arzu edilen herhangi bir şekilde, genleri değiştirme uzatılabilir.

Özet

Gen silinmesi gen fonksiyonu analizi önemli bir rol oynar. hedefli bir şekilde genlerin bozmaya en etkin yöntemlerden biri, homolog rekombinasyon yoluyla bir seçilebilir marker ile bütün gen yerine geçer. Homolog rekombinasyon sırasında DNA değişimi, yüksek benzerliğe sahip sekanslar arasında yer alır. Bu nedenle, hedef gene komşu lineer genomik diziler spesifik olarak arzu edilen entegrasyon sitesine bir seçilebilir işaret doğrudan kullanılabilir. Silme yapısının kör uçlar hücrenin DNA onarım sistemleri aktive edebilir ve böylece homolog rekombinasyon yoluyla ya da homolog olmayan uca birleştirilmesi yoluyla yapının entegrasyonu teşvik. verimli homolog rekombinasyon ile organizmalar, başarılı gen silme oranı% 50'den fazla, bu strateji değerli bir gen bozulması sistemi yapım ulaşabilir. Ustilago Maydis'in rastık mantarı gibi verimli homolog Rekombinant gösteren bir ökaryotik bir model mikroorganizmadıriyon. Bunu yaklaşık 6.900 gen dışında, bir çok işlevsel silme mutantları yardımıyla karakterize edilmiştir, ve gen temel işlevi de gen değiştirme girişimleri Puan yetmezliği tekrarladı. floresan işaretleri veya tahmin etki mutasyonlar ile etiketleyerek gen işlevi sonraki karakterizasyonu da homolog rekombinasyon yoluyla DNA değişimine dayanır. Burada, biz U. sunuyoruz En basit örnek, gen silme işlemini kullanarak detaylı Maydis zorlanma nesil stratejisi.

Giriş

Ustilago maydis yıllardır 1,2 yoğun çalışılmıştır bir fitopatojenik bir model mantardır. Bu iki morfoloji, bir maya gibi, patojenik olmayan aşamasında ve filamentli, enfeksiyöz bir şekilde 3 bulunmaktadır. Örneğin homolog rekombinasyon ve DNA tamir mekanizmaları gibi evrensel atılım bulgu, bu mantar 4 maya benzeri büyüme aşamasında yapılmıştır. Ayrıca, enfeksiyon için önemli bir enfeksiyon filament ve hastalık oluşturma faktörlerinin morfolojik anahtarı 5,6, iyi karakterize edilmiştir. Bu kurum mantar biyoloji ve virülans hakkında artan moleküler bilgi mükemmel bir genom açıklama 10 ve kullanılarak ters genetik kolaylığı, örneğin, bizim enstitüsünde iyi organize plazmid toplama (http tarafından desteklenen basit bir gen değiştirme stratejisi 7-9 dayanır : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). mısır s standartlaştırılmış, hızlı enfeksiyon deneylerieedlings patojenite detaylı çalışmalar 11 faktörleri tanır.

U. genomu maydis yaklaşık 6.900 gen 10 içerir. onların işlevini incelemek için, onlar nedeniyle etkin bir homolog rekombinasyon sistemi tek başına veya birlikte silinebilir. Mükemmel homolog uçlarını ihtiva eden yaklaşık 1 kb'lik yanında bulunan bölgeler% 50'den daha büyük, homolog rekombinasyon oranları için idealdir, ama homolog olmayan uç ile daha önce 250 bp yapının 9 doğru entegrasyon bir dereceye kadar izin verir. Şu anda, beş farklı direnç kaseti, higromisin, karboksin, nourseothricin, G418 ve fleomisin karşı direnç aracılık hygR, cbxR, NATR, G418R ve phleoR, transformantların 7,9 seçmek için kullanılır. Buna ek olarak, higromisin direnci, heterolog bir FLP yeniden bağlayıcı 12 geçici ifade ile çıkarılabilir geri dönüşümlü bir kaset (STT-hygR) olarak geliştirilmiştir. Bu direnç kasetin ve böylece teori sınırsız genetik modifikasyon olarak kaldırılmasını sağlar. Fleomisin yeni kasetler ile, geri dönüşümlü hygR kaseti, özellikle phleoR kullanımı azalmaktadır, böylece 13 mutajen. Dörtlü mutantlar, böylece, diğer dört kasetleri kullanılarak üretilebilir, ancak beşli mutantlar için, FRT-hygR sistemi 14 önerilir.

Bu genel gen silme stratejisi başarıyla gibi Sporisorium reilianum 15, U. gibi diğer karalamak mantarlara devredilmiştir hordei 16 veya A.B.D. esculenta 17 ve bu nedenle verimli bir homolog rekombinasyon sistemi ile henüz genetik dirençli organizmaların daha fazla uygulamalar için potansiyel sunmaktadır. yer alan genlerin silinmesi ile örneklendiği gibi Ayrıca, homolog yeniden birleştirmeye yoksun organizmaların genetik mühendisliği geliştirmek için modifiye edilebilir homolog olmayan-enD-katılmadan Neurospora crassa 18,19 yılında.

Burada U. için yayınlanan gen silme stratejisini açıklamak adayların hızlı ve doğru doğrulama odaklanarak deneysel detaylı 7,9 Maydis'in. Bir örnek olarak, mantar şitinaz Tek ve mutantların üretilmesinden oluşmaktadır ve birden fazla silme 20,21 suşları tasvir etmektedir. Onlar sert hücre duvarında kitin üzerinde hareket çünkü kitinazlarve ilginç örneklerdir. Hücre duvarı yeniden şekillenme hücre bölünmesi sırasında morfolojik değişiklikler için gerekli olan, ipliksi büyüme ve spor oluşumuna geçin. Dolayısıyla, silme mutantlar süresi boyunca fenotipleri beklenebilir.

Protokol

Silinti yapılan, 1. Üretim

  1. Ilgili bir 1 kb yukan kanadını (UF) ve alt kanadı (DF), her ve keskin kesme kısıtlama sahaları ile çevrili, uygun direnç kasedi içeren silinmesi yapısı (Şekil 1) ihtiva eden bir plasmid oluşturur.
    NOT: Herhangi bir klonlama stratejisi bu tür plazmidler 9 Golden Gate klonlama tavsiye (klonlama için referans 22) kullanılabilir.
  2. Silme 9 inşa silme 1 ug DNA elde etmek için bir künt kesici kullanılarak plazmid gelen inşa tüketim. Enzim ortadan kaldırmak ve ticari reaktifler kullanılarak 22 örneğin tampon ve üreticinin talimatlarına uyun için silme yapı arındırın.
    NOT: vektör omurga dönüşüm karışımı kalabilir.

Protoplast 2. Hazırlık

NOT: e tüm zamanlarda steril koşullar tutunXperiment. Hücre duvarı plazma zarına moleküllerin erişimi sınırlayan güçlü bir koruyucu engeldir. Silme yapısını içeren DNA alımını sağlamak için, hücre çeperi, bir protoplasting reaksiyonunda bozundurucu enzimler, hücre duvarı ile kaldırılması gerekir. protoplast hazırlanmasında kritik adımlar ortamın 1) ozmotik stabilizasyon ve 2) protoplastlar mekanik stres kaçınarak.

  1. Mark 2 protoplast dondurmak ve -20 ° C'de onları soğumasını yuvarlak dipli ml'lik tüpler. arzu edilen genetik kökenli soyunun taze plakadan 3 ml YEPS-Light bir ön kültür başlatın. 28 ° C'de 24 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin.
    NOT: zorlanma solopathogenic gerilme SG200 10, yabanıl tip suşları gibi AB33 23, ya da çift mutantların nesil için herhangi bir mutant arka plan olarak test suşları olabilir. suşu istenilen direnç serbest olduğundan emin olun.
  2. Bir şaşkın flas 50 ml YEPS-Light kültür seyreltink ve 200 rpm'de 28 ° C'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
    NOT: katlama zaman vahşi tipli suşları için yaklaşık 2 saattir. Üç duplikasyonlar az bekleyin.
  3. üstel faz kadar büyütün. (1.0 olarak kabul edilebilir olan 0.6) 600 nm'de (OD600) arasında bir dalga boyunda ölçülen optik yoğunluk, yaklaşık 0.8 olduğundan emin olun. OD 1.0 600 1 U. 7 10 ila 2 x tekabül ml başına hücreler maydis.
  4. Bir mikroskop altında kirlenme hücreleri kontrol edin. 40x büyütme kullanın. 5 dakika, 1.500 xg için tam 50 ml kültür hücreleri Pelet ve supernatant atın. 25 ml sodyum sitrat, sorbitol çözeltisi (SCS), santrifüj 5 dakika, 1.500 xg pelletini tekrar ve supernatant atın.
    Not: Bakteriyel kirlilikler, küçük ve çoğu zaman hareket eden hücreler olarak tespit edilebilir. Mantar kontaminasyonlar U. sigara şeklinde hücrelere göre farklı bir hücre şekil ya da boyutta göre tespit edilebilir maydis.
  5. cen sırasındatrifugation protoplasting solüsyon hazırlanır (12.5 mg / ml, Trichoderma SCS enzimler, lize hücre pelet başına 3 ml hazırlanması, filtre 22 um'lik bir filtreden steril, çözelti, uygun enzimatik aktivitesi için taze olmalıdır). SCS hücre duvarının kaldırılması üzerine protoplast delinmesine engel olmak için bir ozmotik dengeleyicidir.
  6. çözelti protoplasting 2 ml pelletini. Oda sıcaklığında 5 ila 20 dakika süreyle inkübe ve hücrelerin 30 ila 40% yuvarlak veya iğne topuzlarında gibi (Şekil 2) kadar mikroskop altında kontrol edin.
    NOT: Bundan sonra buz üzerinde tüm adımları uygulayın ve dikkatle protoplast ele!
  7. 10 ml soğuk (4 ° C) SCS yıkayın 3x, 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin.
  8. Süpernatan atılır, 5 dakika boyunca 1000 x g'de soğuk sorbitol TrisHCl, CaCl2 çözeltisi (STC) sıkma 10 ml pelletini. , 1 ml soğuk STC pelletini tekrar soğutulmuş tüplerde 100 ul alikotları olun. sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de alikot dondurun.

U. 3. dönüştürülmesi maydis

Not: U. dönüşümü maydis protoplastlar teknik olarak basit ve özel ekipman gerektirmez elektroporasyon ya biolistik transformasyon karşı olan polietilen glikol (PEG) aracılı dönüştürme yöntemi, dayanır.

  1. İki katmanlı seçme plakaları (transformasyon reaksiyon başına 2 levha) hazırlayın. buradaki alt kat, kat konsantrasyonda antibiyotik içerir. 400 ug / ml higromisin içeren RegLight pipetleyin 12 mi (ya da 300 ug / ml nourseothricin veya 4 ug / ml karboksin ya da 1 mg / ml G418), bir Petri kutusu içine. kabarcıkları kaçının.
    Not: Taban tabaka levhaları (aşağıya bakınız), 4 ° C de bir kaç gün saklanan ama dönüşümü sırasında taze üst tabaka hazırlamak olabilir.
  2. buz üzerinde çözülme protoplastlar (1 tüp / transformasyon). 1 ul heparin (15 mg / ml) eklenir. 1 ug DNA (doğrusallaştırılmış yapı) ya da 10 ul H 2 Ekle O (su kontrolü). Buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin.
  3. Bu süre boyunca üst tabaka için RegLight taban plakası üzerine (60 ° C kaynama ve serin) RegLight sıvılaştırılmış 12 ml yayıldı.
    NOT: Bu katman antibiyotik içermez.
  4. dönüşüm tüp (3. 2) 500 ul STC / PEG (polietilen glikol) ekleyin ve tersini tüp dikkatlice karıştırın. Buz üzerinde 15 dakika kuluçkalayın.
  5. İki tabakalı RegLight plakaların ikisinin her dönüşüm reaksiyonu dağıtın. . Bir cam pipet ile dikkatlice ve yavaşça yayılır transformantlar koloniler olarak büyümeye kadar 5 ila 7 gün süreyle 28 ° C'de dik inkübe edin. plaka başına yaklaşık 100-200 koloniler elde edin.
    NOT: Düşük sayılar ya çok fazla hücre duvarını içeren ve bu nedenle DNA'yı alamaz ya da yeniden edemez "kötü" protoplastlar neden olabilir. Eski kendi kendini kopyalayan bir plazmid, antibiyotikler olmadan plakalar üzerine rejenerasyonu test ederek ikinci ile dönüştürme ile test edilebilir.
  6. / ml higromisin 200 ug uygun antibiyotiği içeren YEPS Işık tabak hazırlayın (ya da 150 ug / ml nourseothricin ya da 2 ug / ml karboksin veya 500 ug / ml G418, bu konsantrasyonlar alt plakalar için kullanılan bir eşit yarısı). Bu plakalar üzerinde en az 24 varsayılan transformant koloniler yeniden arındırmak. Tek tek koloniler elde edilmelidir. seçici olmayan medya üzerinde orijinal zorlanma dışarı Aynı zamanda çizgi at.
    Not: Plakalar 1-2 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.

Doğru Silme Olaylar 4. Doğrulama

Not: mutasyonlar üç aşamalı bir prosedürde doğrulanır (Şekil 1). İlk olarak, genin vahşi tip kopyasını içeren adaylar PCR ile dışlanır. İkinci olarak, lokusuna direnç kasetinin entegre PCR ile doğrulanır. Üçüncü olarak, sadece arzu edilen lokusuna direnç kasetinin entegre Southern blot analizi ile doğrulanmıştır. Dikkatli gerilme doğrulama esse olduğununtial mutant fenotip gerçekten silinmesi ile ilişkili böylece.

  1. İlk Teşhis PCR 20
    1. Geninde tasarım primerler eşleştirme 250-600 bp (Şekil 1) sahip bir ürün ile sonuçlanan silinir. Böyle küçük ürünler bir koloni PCR yükseltmek kolay ve standart jel elektroforezinde tespiti için yeterince uzun olan.
    2. Her aday ve bir pozitif kontrol olarak, orijinal suşu için, 20 ul 0.02 M NaOH içinde bir kürdan ile tek bir koloni hücre malzemesinin biraz (bir toplu iğne başı miktarı) yeniden süspanse edin. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
      NOT: Taze koloniler kullanın. Plakalar 1 hafta yeniden çizgi daha eski ise yeni bir koloni elde etmek.
    3. Hemen PCR için hücre süspansiyonu 1 ul kullanın. Standart bir PCR reaksiyonu ve elde edilen fragmanlar analiz eder.
      NOT: Bu örnekler saklanamaz.
      Not: bu şekilde Bu PCR vahşi tipli geninin varlığı için test negatif cand hızla belirlenmesini sağlarilgi gen yerini henüz hangi idates. Bu PCR reaksiyonunda bantlar elde klonlar atılır. Bu tür bir negatif klon yine ek bir negatif kontrol olarak birlikte gerçekleştirilmelidir. Bir PCR ürünü olmayan adaylar daha analiz edilmesi gerekir. diğer yarısı bir bant neden olmamalıdır ise zarar vermeden gen adaylarından yaklaşık olarak yarısı, vahşi tipli genini içermelidir. Bu,% 50 homolog bir rekombinasyon oranına karşılık gelir.
  2. İkinci teşhissel PCR
    1. Genomik DNA hazırlanması.
      Not: Genomik DNA (gDNA), iki farklı protokolü kullanarak hazırlanabilir. İlk fenol ve kloroform ve dolayısıyla, sadece ikinci de 4.2 4.2.1.6 açıklanan az deneyimli öğrenciler (tarafından ele alınabilir ise (4.2.1.5 için 4.2.1.1 anlatılmıştır) deneyimli araştırmacılar tarafından ele alınmalıdır gibi toksik reaktif içerir. 1.11). Her iki protokol güvenilir çalışıyoruz. Aşama 4.2.1.1 iki protoc için aynıdırols.
      1. her bir aday ile 5 mi YEPS Işık inoküle ve 28 ° C'de 24 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin. Bir CM plaka üzerinde kültürün 2 ul bırakın. Steril kültür tutun.
        NOT: Aşağıdaki standart protokolü (: toksik adımlar DİKKAT) 'dir.
      2. 2 ml tüpler için 1 kepçe HCI yıkanmış cam boncuklar (~ 200 ul) yerleştirin. U. 2 ml ilave edilir maydis kültürü. 5 dakika boyunca 12.000 xg Spin. (Pelet, bu aşamada dondurulabilir) süpernatant atılır. (: 24: 1, 25) pelet 500 ul fenol / kloroform / izoamilalkol ekleyin. DİKKAT! PHENOL ZEHİRLİ IS!
      3. 1000 rpm'de bir Vibrax 500 ul Usti-lisis tampon 6 dakika 10 1. çalkalayın ekleyin. Hücre topağı tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olun, ama gDNA ve kesme önlemek için sallayarak genişletilmiş kaçının. 15 dakika boyunca 12.000 xg'de Spin. Yeni reaksiyon tüpüne sulu fazın 400 ul aktarın (interfaz dokunmayın).
      4. 1 mi, 100% (v / v) etanol ekleyin. c gözlemlemek, mix tüp 3x haricindekilerikısa bir süre görünen DNA'nın yüksek sesle. 5 dakika boyunca 12.000 xg'de Spin. Süpernatantı ve 200 ul% 70 EtOH ile yıkayın. Bu aşamada pelletini etmeyin.
      5. (Pelet tamamen kurumasını izin vermeyin) tamamen süpernatantı. 50 ul TE / RNAaz ari ekleyin. 10 dakika boyunca 50 ° C'de 400 rpm'de çalkalanarak gDNA'sından eritin. % 0.8 agaroz jeli 20 gDNA 2 ul analiz edin.
        Not: Aşağıdaki adımlar, alternatif bir toksik-olmayan protokol içermektedir.
    2. Genomik DNA Alternatif Hazırlanması
      1. HCI 2 ml tüpler cam boncuk yıkanmış 1 kepçe (~ 200 ul) yerleştirin. U. 2 ml ilave edilir 5 dakika boyunca 12.000 xg'de maydis kültür ve spin. (Granüller bu aşamada dondurulabilir) süpernatant atın.
      2. pelet 500 ul liziz tamponu Usti 2 ekleyin. 1000 rpm'de bir Vibrax ile 5 ila 15 dakika boyunca çalkalayın. Hücre topağı tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olun.
      3. 15 ila 20 dakika boyunca, 65 ° C'de inkübe edin. beğenme kullanma2 ml tüpler barındırmak için tasarlanmış zemelerle kuluçka önemlidir. Daha sonra, 5 dakika buz üzerine yerleştirin.
      4. 100 ul 8 M potasyum asetat, vorteks ekleyin ya da 8 ila 10 kez ters çevirin. Oda sıcaklığında 15 dakika için 12,000 xg dönerler.
      5. Aktarım 500 yeni bir 1.5 ml'lik tübe süpernatan ul 400 ul izopropanol ekleyin. Vortex veya invert 8 ila 10 kat. 15 dakika için 12,000 xg dönerler. Süpernatantı ve 500 ul% 70 EtOH ile yıkayın. 5 dakika boyunca 12.000 xg Spin.
      6. tamamen süpernatant emmek! Sonuç olarak, artık sıvıyı ortadan kaldırmak için kısa bir sıkma (10 sn) ekleyin. 3 ila 5 dakika süreyle DNA pelet kurumasını bekleyin. 50 ul TE / RNAaz ekleyin ve 400 rpm hızda 10 dakika 15 için 50 ° C'de inkübe edin.
    3. PCR
      1. Tasarım bunlardan biri (UF-f, RC-R, RC-f DF-R, Şekil 1) dış yan yüzleri dışında bağlanması ve direnç kaseti içinde bağlayıcı bir karşılık gelen iki primer çiftleri 9.
      2. Her c gDNA 1:10 seyreltmesinin 1 ul kullanınandidate 2 PCR reaksiyonlarında şablon olarak yukarı ve aşağı doğru 9 doğru takılmasını teyit etti.
      3. Her bir aday için standart PCR reaksiyonları kullanın ve parçaları 22 sonuçlanan analiz eder.
        NOT: Bu PCR doğru genomik direnç kasetinin eklenmesi için test edin. ürünler her iki taraf için elde edildiği takdirde, adayın doğru yerleştirilmesidir. Bununla birlikte, (alt yukan ya da) sadece bir tarafı teyit edilebilir da aday PCR reaksiyonları sadece tek bir kanat için başarısız olması durumunda, daha fazla analiz için birlikte gerçekleştirilmelidir.
  3. Southern Blot Analizi 22 tarafından doğru Genomik Takma doğrulanması
    1. geninde veya açıkça dist yol açan direnç kaseti ya keser, inşa ve ek olarak / lokus dışında keser uygun bir enzim ile 15 mutant adayların gDNA ul (4.2.1) ve ilgili wild tip / progenitör gerginlik Digestinguishable desenler (Şekil 1) 8.
      NOT: sindirilmemiş DNA açıkça ayırdedilebilmektedir böylece, beklenen şeritleri hiçbiri, daha büyük olan 10 kb olmalıdır.
    2. kaynak tarafı ve sondalar olarak aşağı kanadını kullanın. örnek PCR DIG etiketleme Kit veya benzeri bir standart yöntemi kullanmak için onları etiketlemek için. 1 etiketli problar karıştırın: 1 moleküler oranına ve Güney leke yürütmek. en az iki bağımsız doğru transformantları tutun.
      NOT: Vahşi tipli model orijinal zorlanma açıkça tespit olmalı ve doğru klonlar sadece beklenen bantları içermelidir. adayların sadece mevcut ek bantları yanlış lokusunda yapının diğer eklemeleri göstermektedir. Bu gibi klonlar atılmalıdır. İlk tanı PCR tanımlanan olumsuz aday yanlış entegre silme yapısının wild tip bantları ve (boyut olarak öngörülemeyen) bantlar içermelidir.
  4. gliserol stokları
    NOT: Gliserol stokları Strain collections'da yıllardır klonlar muhafaza ederler. en azından iki bağımsız transformant, her mutant için tutulmalıdır. Bu aynı olmalıdır karşılaştırarak fenotipi sağlar.
    1. 500 ul NSY-gliserin-ortamı her kültür 28 ° C Karışım 500 ul 24 saat süre ile dönen bir tekerlek üzerinde YEPS-Light teyit mutant 5 ml kültür büyütün. Kültür ve orta iyice karıştırılır kadar Tüpü ters çevirin. ortam içinde gliserol, buz kristallerinin oluşmasını önler.
    2. -80 ° C'de dondurun. stok fonksiyonel olup olmadığını yeniden çizgi dondurulmuş kültürünün bir parçası test etmek.

5. Mikroskobik fenotipler

  1. 28 ° C'de 12 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde YEPS-Işık vahşi tip ve mutant 5 ml kültür büyütün.
  2. Ertesi gün, yaklaşık 0.1 OD 600 kültür sulandırarak 0.5 ve 0.7 arasında bir OD 600 kadar büyümek. 1.0 Nominal değerden uygun bir OD 600İlik yaklaşık 1 7 10 x 2 U. ml başına hücreler maydis.
  3. mikroskobik hücre morfolojisi kontrol edin.
    NOT: Sağlıklı hücreler puro biçimli (Şekil 4, WT) görünür. Seslendirilmiş vakuoller veya filament oluşum hücreleri vurguladı olduğunu göstermektedir.
    Not: haberci soylarının Uygun tahlil bu aşamada gerçekleştirilebilir kullanıldığında beklenen mutant fenotipinin bağlı olarak, analiz, örneğin, adapte edilebilir. Hücre morfolojisi değişti istatistiksel analiz yapılmalıdır ise, örneğin, ortalama hücre uzunluğunu belirlemek için.

6. Enfeksiyon Deneyi

NOT: fide enfeksiyon tahlil bu dergide 11 daha önce görüntülenmiştir edilmiştir. Bu Ya örneğin SG200 10 veya her iki mutasyonu taşıyan uyumlu geçme karışım eşleri, bir haploid, solopathogenic suş zemini kullanılarak gerçekleştirilebilir.

  1. başına en az 40 mısır fideleri büyütün16 saat, 200 μE / 22 ° C (gündüz / gece) 28 ° C'lik bir ışık döngüsü 7 gün boyunca soyu. Bu 3-yaprak aşamalı ve 10-15 cm enfeksiyonun gün boyunda olmalıdır.
  2. Enfeksiyondan iki gün önce, 28 ° C'de 24 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde, 5 ml YEPS ışıkta suşlarının kültür öncesi başlar. YEPS Işık 600 = 1.0 OD 50 ml bir ana kültür büyütün (hücre bölünmesi oranı = 2 ila 3 saat bölümler en az izin O / N yapılabilir).
  3. 5 dakika boyunca 1.500 xg'de 50 ml kültür hücreleri aşağı Spin ve süpernatant atın. Steril H 2 O ile yıkayın 3x OD 3,0 600 steril H 2 O hücreleri tekrar süspansiyon. Gerekirse, çiftleşme ortakları karıştırın.
  4. küçük bir şırınga ile 7 gün eski mısır fidelerinin kök içine hücre süspansiyonları 500 ul - 250 enjekte edilir. Bir kontrol olarak steril H 2 O kullanın. aynı ışık ve ısı koşullarında, ek 7-14 gün boyunca enfekte fide tutun. Her bitki a fenotip PuanSağlıklı, kloroz, antosiyanin oluşumu, küçük tümörler, büyük tümörler, ölü bitki 10 şeklinizi ona göre.
    NOT: Puanlama gibi erken 7 gün olarak yapılır ve zamanla enfeksiyon takip 14 gün tekrar edilebilir.

Sonuçlar

U. kodlanmış dört chitinolytic genler için silinti yapılan, Maydis genom cts1 silinmesi için hygR kaseti kullanarak Golden Gate klonlama tarafından oluşturulan, NATR cts2 silinmesi için, cts3 silinmesi ve cts4 20 silinmesi için cbxR için G418R kaseti. Gen değiştirme stratejisinin genel bir bakış cts3 silinmesi (Şekil 1) ile tarif edilmektedir. Iki...

Tartışmalar

Bu protokol U ters genetik çalışmalar için silme mutantlar oluşturmak açıklamaktadır maydis. Başlangıç noktası bir önceki 7,9 optimize gen-faiz 1 başlangıç yukan ve durdurma kodonundan aşağı doğru kb olarak uygun bir direnç kaseti sekanslarını ihtiva eden kuşatıcı sekanslar içeren bir silme konstruktu olup . yapıları tek tek her gen için oluşturulan ve dikkatle geni silmeden önce dizi hatalar için doğrulanacak var. dış yan yüzleri komşu gen içine ulaşm...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

yazının eleştirel okuma Dr. Benedikt Steuten özel teşekkürler. kitinazlarve orijinal eser Dr. Thorsten Langner tarafından yürütülmüştür. VG laboratuvar Bitki Bilimleri Mükemmellik (CEPLAS, DFG EXC 1028) ve BioSC ve Cluster tarafından desteklenen, KS laboratuvar BioSC tarafından desteklenmektedir. KB BioSC tarafından desteklenmektedir. Bioeconomy Bilim Merkezi (BioSC) bilimsel faaliyetleri maddi NRW Strategieprojekt BioSC (No 313 / 323-400-00213) çerçevesinde Yenilik, Bilim ve Araştırma Bakanlığı tarafından desteklendi. LF DFG Uluslararası Araştırma Eğitim Grubu 1525 iGRADplant bir doktora burs tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Aminobenzoeic acid (Free Acid)Sigma AldrichA-9878
Bacto agar BD214010alternatively use local supplier
Bacto peptoneBD211677alternatively use local supplier
Bacto yeast extract BD212750alternatively use local supplier
CaCl2*2H2OGrüssing GmbH10234alternatively use local supplier
Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt)Sigma AldrichP-2250
Carboxin Sigma Aldrich45371
Casamino acids BD223050
CholinchloridSigma AldrichC-1879
Citric acidChemSolute24,321,000alternatively use local supplier
CuSO4*5H2OFluka61240alternatively use local supplier
D(+)Sucrose Roth4621.1alternatively use local supplier
DNA degr. free acid Sigma-AldrichD-3159
EDTASigma AldrichE4378
FeCl3*6H2OGrüssing GmbH10288alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate saltSigma AldrichA1720
Trichoderma lysing enzymesSigma AldrichL1412
D(+) GlucoseCaelo2580alternatively use local supplier
Glycerin Fisher ChemicalG065015alternatively use local supplier
H3BO3AppliChemA2940Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium saltSigma AldrichH3393-50KU
Hygromycin B-solutionRoth1287.2Dangerous substance. 
KClVWR26764298alternatively use local supplier
KH2PO4AppliChemA3620alternatively use local supplier
MgSO4 waterfreeMerck7487-88-9Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2OAppliChemA2087alternatively use local supplier
myo-InositolSigma AldrichI-5125
Na2-EDTA*2H2OAppliChemA2937alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2ORoth0274.2alternatively use local supplier
Na2SO4Grüssing GmbH12174alternatively use local supplier
NaClFisher ChemicalS316060alternatively use local supplier
NaOHChemSolute13,751,000alternatively use local supplier
NH4NO3RothK299.1alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free acid)Sigma AldrichN-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate  Werner BioAgents5,001,000
Nutrient broth Difcolocal suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7Sigma AldrichP3803Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG)Sigma AldrichP-3640
Potassium acetateAppliChem121479alternatively use local supplier
Pyridoxin (monohydrochlorid)Sigma AldrichP-9755
Riboflavin Sigma AldrichR4500
RNaseASigma AldrichR5503
SDSRothCn30.3alternatively use local supplier
small syringeBD300300alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µmVWR28145-477alternatively use local supplier
SorbitolRoth6213.1alternatively use local supplier
Thiamin-hydrochlorideServa36020.02alternatively use local supplier
tri-Na-CitrateFisher ChemicalS332060alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethaneVWR103156Xalternatively use local supplier
Tris hydrochlorideRoth9090.4alternatively use local supplier
Triton X-100 Serva 37240alternatively use local supplier
ZnCl2Fluka96470alternatively use local supplier
Composition of solutions/preparation of materialComposition of solutions
CarboxinStock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose 
Geneticin (G418)Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm)Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. 
HeparinStock: 15 mg/ml
Holliday salt solution16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
HygromycinStock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
NourseothricinStock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) 
RegLight1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 81 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG40 % (v/v) PEG in STC-buffer 
TE buffer, pH 81.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 810 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. 
Usti-lysis buffer 2mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar

Referanslar

  1. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
  2. Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
  3. Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
  4. Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
  5. Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
  6. Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
  7. Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
  8. Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
  9. Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
  10. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  11. Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
  12. Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
  13. van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
  14. Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
  15. Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
  16. Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
  17. Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
  18. Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
  19. Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
  20. Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
  21. Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
  22. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloining: a laboratry manual. , (1989).
  23. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
  24. Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
  25. Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
  26. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  27. Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
  28. Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
  29. Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
  30. Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
  31. Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
  32. Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GenetikSay 115Ustilago maydisGenetik m hendisli isilme mutant genetik mutant fenotiphomolog rekombinasyonmodel rast k mantarbitki patojenigerilme do rulama ters

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır