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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous décrivons une stratégie de remplacement de gène robuste pour manipuler génétiquement le champignon Ustilago maydis. Ce protocole explique comment générer des mutants de deletion pour enquêter sur les phénotypes d'infection. Elle peut être étendue à modifier les gènes de manière quelconque, par exemple en ajoutant une séquence codant pour une étiquette de protéine fluorescente.

Résumé

Délétion du gène joue un rôle important dans l'analyse de la fonction génique. L'une des méthodes les plus efficaces pour perturber les gènes de manière ciblée est le remplacement de la totalité du gène avec un marqueur sélectionnable par recombinaison homologue. Au cours de la recombinaison homologue, l'échange d'ADN a lieu entre les séquences avec une grande similitude. Par conséquent, des séquences génomiques linéaires flanquant un gène cible peuvent être utilisés pour diriger spécifiquement un marqueur sélectionnable sur le site d'intégration souhaité. Des extrémités franches de la construction de deletion activent les systèmes de réparation d'ADN de la cellule et ainsi favoriser l'intégration de la construction, soit par l'intermédiaire d'une recombinaison homologue ou non homologue jonction bout. Dans les organismes avec efficacité la recombinaison homologue, le taux de délétion du gène réussi peut atteindre plus de 50%, ce qui cette stratégie, un système de dissociation génétique précieux. Le champignon Ustilago maydis est un modèle micro-organisme eucaryote montrant tel recombinat homologue efficaceion. Sur ses environ 6.900 gènes, beaucoup ont été caractérisé fonctionnellement avec l'aide de mutants de deletion, et répété échec des tentatives de remplacement de gènes points fonction essentielle du gène. Caractérisation ultérieure de la fonction du gène par le marquage avec des marqueurs ou des mutations des domaines prédits fluorescents repose également sur l'échange d'ADN par recombinaison homologue. Ici, nous présentons le U. maydis stratégie de génération de contrainte en détail en utilisant l'exemple le plus simple, la suppression du gène.

Introduction

Ustilago maydis est un champignon modèle phytopathogènes qui a été largement étudié depuis des décennies 1,2. Il existe en deux morphologies, une étape non pathogène type levure et une filamenteux, forme infectieuse 3. Découvertes révolutionnaires universelles telles que les mécanismes de recombinaison et de réparation de l' ADN homologues ont été faites à l'étape de ce champignon 4 croissance type levure. En outre, le commutateur morphologique des facteurs de filaments et de virulence infectieuses importantes pour l' infection sont bien caractérisés 5,6. La connaissance moléculaire de plus en plus sur la biologie et de la virulence de ce champignon du charbon repose sur une stratégie de remplacement de gène simple 7-9 soutenu par une excellente annotation du génome 10 et la facilité de génétique inverse en utilisant, par exemple, la collecte de plasmide bien organisé dans notre institut (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Normalisés, tests d'infection rapide dans le maïs seedlings permettent des études détaillées de pathogénicité facteurs 11.

Le génome de U. maydis contient environ 6.900 gènes 10. Pour étudier leur fonction, ils peuvent être supprimés individuellement ou en combinaison grâce à un système de recombinaison homologue efficace. Régions flanquantes d'environ 1 kb contenant des extrémités parfaitement homologues sont idéales pour les taux de recombinaison homologue supérieure à 50%, mais déjà 250 pb avec des extrémités non homologues permettent un certain degré d'intégration correcte de la construction 9. À l' heure actuelle, cinq cassettes de résistance différentes, Hygr, CBXR, NATR, G418R, et la médiation de la résistance contre phleoR hygromycine, la carboxine, la nourséothricine, G418 et phléomycine, sont utilisés pour sélectionner les transformants 7,9. En outre, la résistance à l'hygromycine a été développé dans une cassette recyclable (TRAF-Hygr) qui peut être éliminé par l'expression transitoire d'une recombinase FLP hétérologue 12. Ceci permet le retrait de la cassette de résistance et donc en théorie illimité des modifications génétiques. Phléomycine est mutagène 13, de sorte que les nouvelles cassettes, en particulier , la cassette Hygr recyclable, l'utilisation de phleoR diminue. Mutants quadruples peuvent ainsi être générés en utilisant les quatre autres cassettes, mais pour les mutants quintuples, le système FRT-Hygr est recommandé 14.

Cette stratégie générale de délétion du gène a été transféré avec succès à d' autres champignons du charbon tels que Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, ou U. esculenta 17 et donc offre la possibilité de nouvelles applications dans les organismes génétiquement encore intraitables avec un système de recombinaison homologue efficace. En outre, les organismes dépourvus de recombinaison homologue peuvent être modifiées pour améliorer le génie génétique comme en témoigne la suppression de gènes impliqués dans la non-homologue-end-assemblage dans Neurospora crassa 18,19.

Nous décrivons ici la stratégie de délétion du gène publié pour U. maydis 7,9 en détail expérimental avec un accent sur la vérification rapide et précise des candidats. A titre d'exemple, nous utilisons les chitinases fongiques et représentent la génération de mutants simples, ainsi que la suppression de multiples souches 20,21. Chitinases sont des exemples intéressants, car ils agissent sur chitine dans la paroi cellulaire rigide. le remodelage de la paroi cellulaire est nécessaire pour les changements morphologiques au cours de la division cellulaire, le commutateur de croissance filamenteuse et la formation de spores. Par conséquent, dans les mutants de deletion phénotypes au long du cycle peuvent être attendus.

Protocole

1. Génération de deletion Constructs

  1. Générer un plasmide contenant la construction de deletion (figure 1) comprenant un flanc respectif de 1 kb en amont (UF) et le flanc aval (DF) chacune et la cassette de résistance appropriée flanquée par des sites de restriction de coupe émoussés.
    NOTE: Toute stratégie de clonage peut être utilisé (pour le clonage voir référence 22) , nous recommandons Golden Gate clonage pour ces plasmides 9.
  2. Exciser la suppression construire à partir du plasmide en utilisant un couteau émoussé pour obtenir 1 pg d' ADN de la suppression de construire 9. Purifier la construction de suppression pour éliminer l' enzyme et le tampon 22 , par exemple en utilisant des réactifs commerciaux et suivre les instructions du fabricant.
    NOTE: Le squelette du vecteur peut rester dans le mélange de transformation.

2. Préparation de protoplastes

REMARQUE: Gardez des conditions stériles pendant toutes les périodes de l'eXperiment. La paroi cellulaire est une barrière de protection qui limite l'accès des molécules de la membrane plasmique. Pour permettre l'absorption de l'ADN contenant la construction de deletion, la paroi cellulaire doit être enlevé par la paroi cellulaire des enzymes dégradant dans une réaction de protoplastes. Les étapes critiques dans la préparation de protoplastes sont 1) la stabilisation osmotique du milieu et 2) en évitant le stress mécanique sur les protoplastes.

  1. Mark 2 ml tubes avec un fond rond de geler les protoplastes et les refroidir à -20 ° C. Démarrer une pré-culture dans 3 ml YEP-Light à partir d'une plaque fraîche de la souche avec le fond génétique désiré. Incuber sur une roue en rotation pendant 24 heures à 28 ° C.
    NOTE: La souche peut être la souche SG200 solopathogenic 10, les souches de type sauvage, souches d'essai tels que AB33 23, ou tout fond mutant pour la production de doubles mutants. Assurez-vous que la souche est libre de la résistance souhaitée.
  2. Diluer la culture dans 50 ml YEP-lumière dans un flas déconcertésk et laisser incuber sur un agitateur orbital à 28 ° C avec 200 tours par minute.
    NOTE: Le temps de doublement est d'environ 2 h pour les souches de type sauvage. Autoriser trois duplications minimum.
  3. Cultivez jusqu'à la phase exponentielle. Faire en sorte que la densité optique, mesurée à une longueur d' onde de 600 nm (DO 600) est d' environ 0,8 (0,6 et 1,0 est acceptable). Une DO600 de 1,0 correspond à environ 1 à 2 x 10 7 U. maydis cellules par ml.
  4. Vérifiez les cellules de contamination sous un microscope. Utilisez 40x. Sédimenter les cellules de la culture de 50 ml toutes les 5 min, 1500 x g et jeter le surnageant. Reprendre le culot dans 25 ml de citrate de sodium, solution de sorbitol (SCS), centrifuger 5 min, 1500 xg, et éliminer le surnageant.
    REMARQUE: les contaminations bactériennes peuvent être identifiées comme des cellules petites et souvent en mouvement. Contaminations fongiques peuvent être identifiés sur la base d' une forme de cellule ou une taille différente par rapport aux cellules en forme de cigare de U. maydis.
  5. Pendant centrifugation préparer une solution de protoplastes (12,5 mg / ml Trichoderma lyser enzymes, dans SCS, préparer 3 ml par culot cellulaire, filtre stériliser à travers un filtre 22 um; solution doit être frais pour l' activité enzymatique optimale). SCS est un stabilisant osmotique pour empêcher la rupture de protoplastes lors du retrait de la paroi cellulaire.
  6. Reprendre le culot dans 2 ml de solution de protoplastes. Incuber pendant 5 à 20 min à température ambiante et vérifier sous le microscope jusqu'à ce que 30 à 40% des cellules sont rondes ou comme pinheads (Figure 2).
    REMARQUE: Effectuez toutes les étapes de la glace à partir de maintenant et de gérer protoplastes avec soin!
  7. Laver 3x dans 10 ml froid (4 ° C) SCS, centrifuger à 1000 g pendant 5 min.
  8. Reprendre le culot dans 10 ml de sorbitol froid, TrisHCl, CaCl2 solution (STC), rotation à 1000 xg pendant 5 min, éliminer le surnageant. Reprendre le culot dans 1 ml de STC froid, faire 100 aliquotes ul dans les tubes refroidis. Congeler les aliquotes à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

3. Transformation de U. maydis

NOTE: La transformation de U. maydis protoplastes repose sur le polyéthylène glycol (PEG) de la méthode de transformation médiée, ce qui est techniquement simple et opposée à électroporation ou transformation biolistique ne nécessite pas d' équipement spécialisé.

  1. Préparer les plaques de sélection à deux couches (2 plaques par réaction de transformation). La couche inférieure contient l'antibiotique à une concentration doublé. Pipeter 12 ml de RegLight contenant 400 ug / ml d'hygromycine (ou 300 pg / ml de nourséothricine ou 4 ug / ml carboxine ou 1 mg / ml de G418) dans une boîte de Petri. Éviter les bulles.
    NOTE: plaques de couche inférieure peut être conservé quelques jours à 4 ° C, mais de préparer la couche supérieure fraîchement lors de la transformation (voir ci-dessous).
  2. protoplastes Décongeler sur la glace (1 tube / transformation). Ajouter 1 pi d'héparine (15 mg / ml). Ajouter 1 pg d' ADN (de construction linéarisé) ou 10 ul H 2 O (contrôle de l'eau). Incuber pendant 10 min sur la glace.
  3. Pendant ce temps, pour la couche supérieure se propager 12 ml liquéfiés RegLight (ébullition et laisser refroidir à 60 ° C) sur la plaque de fond de RegLight.
    NOTE: Cette couche ne contient pas d'antibiotiques.
  4. Ajouter 500 ul de STC / PEG (polyéthylène glycol) dans le tube de transformation (3 2) et mélanger soigneusement en inversant le tube. Incuber 15 min sur la glace.
  5. Distribuer chaque réaction de transformation sur deux des plaques d'RegLight deux couches. Etalez soigneusement et lentement avec une pipette en verre. Incuber les plaques en position verticale à 28 ° C pendant 5 à 7 jours jusqu'à ce que les transformants poussent comme des colonies. Obtenir environ 100-200 colonies par plaque.
    REMARQUE: Les nombres inférieurs pourraient être causés par des protoplastes «mauvais» qui soit contiennent paroi cellulaire trop et ne peut donc pas prendre l'ADN ou ne peut pas se régénérer. Le premier peut être testé par transformation avec un plasmide auto-réplication, ce dernier en testant la régénération sur des plaques sans antibiotiques.
  6. Préparer YEP-Light plaques contenant l'antibiotique approprié à 200 pg / ml d'hygromycine (ou 150 pg / ml de nourséothricine ou 2 ug / carboxine ml ou 500 pg / ml de G418, ces concentrations égales la moitié de celle utilisée pour les plaques de fond). Re-purifier au moins 24 colonies de transformants putatifs sur ces plaques. Des colonies isolées devraient être obtenues. Dans le même série de temps de la souche originale sur les médias non-sélective.
    REMARQUE: Les plaques peuvent être conservées à 4 ° C pendant 1-2 semaines.

4. Vérification des événements corrects deletion

NOTE: Les mutations sont vérifiées dans une procédure en trois étapes (Figure 1). Tout d'abord, les candidats contenant la copie de type sauvage du gène sont exclus par PCR. D'autre part, l'intégration de la cassette de résistance dans le locus est vérifiée par PCR. Troisièmement, l'intégration de la cassette de résistance que dans le locus désiré est vérifiée par analyse par transfert de Southern. vérification de la souche minutieuse est essential, de sorte que phénotypes mutants corréler vraiment avec la suppression.

  1. Premier diagnostic PCR 20
    1. Conception des amorces appariement dans le gène à supprimer dans ce résultat un produit de 250 à 600 pb (figure 1). Ces petits produits sont faciles à amplifier dans une colonie PCR, et assez longtemps pour la détection dans l'électrophorèse sur gel standard.
    2. Pour chaque candidat et la souche originale en tant que témoin positif, remettre en suspension un peu (quantité d'une tête d'épingle) d'un matériau cellulaire d'une seule colonie avec un cure-dent dans 20 ul de NaOH 0,02. Incubation à température ambiante pendant 30 min.
      REMARQUE: Utiliser des colonies fraîches. Si les plaques sont plus âgés de 1 semaine re-série pour obtenir une nouvelle colonie.
    3. En utilisant 1 pi de la suspension cellulaire pour la PCR immédiatement. Exécuter une réaction PCR standard et analyser les fragments résultants.
      NOTE: Ces échantillons ne peuvent pas être stockés.
      REMARQUE: les tests Cette PCR pour la présence du gène de type sauvage et de ce fait permet une identification rapide des cand négativeidates dans lequel le gène d'intérêt n'a pas été remplacé. Les clones produisant des bandes dans cette réaction PCR seront rejetées. Un tel clone négatif doit de toute façon être effectué le long comme un contrôle négatif supplémentaire. Les candidats sans un produit de PCR doivent être analysées plus loin. Pour les gènes sans effets négatifs d'environ la moitié des candidats doit contenir le gène de type sauvage, tandis que l'autre moitié ne devrait pas entraîner une bande. Cela correspond à un taux de recombinaison homologue de 50%.
  2. Deuxième PCR Diagnostic
    1. Préparation de l'ADN génomique.
      REMARQUE: L'ADN génomique (ADNg) peut être préparé en utilisant deux protocoles différents. Le premier concerne les réactifs toxiques comme le phénol et le chloroforme et, par conséquent, doivent être manipulés que par des chercheurs expérimentés (décrits dans 4.2.1.1 à 4.2.1.5) tandis que le second peut également être manipulé par des étudiants moins expérimentés (décrites dans 4.2.1.6 à 4,2. 1.11). Les deux protocoles fonctionnent de manière fiable. 4.2.1.1 étape est identique pour les deux protocols.
      1. Inoculer 5 ml YEP-Light avec chaque candidat et incuber sur une roue en rotation pendant 24 heures à 28 ° C. Goutte 2 ul de la culture sur une plaque de CM. Gardez la culture stérile.
        NOTE: A la suite est un protocole standard (ATTENTION: pas toxiques).
      2. Mettre 1 cuillère (~ 200 pi) de billes de verre HCl lavés à 2 ml tubes. Ajouter 2 ml de U. culture maydis. Spin 12.000 xg pendant 5 min. Rejeter le surnageant (culot peut être congelé à ce stade). Ajouter 500 ul de phénol / chloroforme / alcool isoamylique (25: 24: 1) pour la pastille. PRUDENCE! PHENOL EST TOXIQUE!
      3. Ajouter 500 ul Usti-lyse-tampon 1. Secouez pour 6 à 10 min sur un Vibrax à 1000 rpm. Vérifiez que le culot cellulaire est complètement remis en suspension, mais il faut éviter étendu secouer pour éviter le cisaillement du ADNg. Spin à 12.000 xg pendant 15 min. Transférer 400 ul de la phase aqueuse dans le nouveau tube de réaction (ne touchez pas l'interphase).
      4. Ajouter 1 ml de 100% (v / v) d'éthanol. Inversez les 3x tube pour mélanger, observer le cfort de l'ADN qui apparaît sous peu. Spin à 12.000 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant et laver avec 200 ul de 70% EtOH. Ne pas remettre le culot dans cette étape.
      5. Retirer le surnageant complètement (ne laissez pas le culot sécher complètement). Ajouter 50 ul de TE / RNase. Dissoudre ADNg par agitation à 400 tours par minute à 50 ° C pendant 10 min. Analyser 2 pi du ADNg sur un gel d'agarose à 0,8% 20.
        NOTE: Les étapes ci-dessous comprennent un protocole non toxique alternative.
    2. Autre préparation d'ADN génomique
      1. Mettre 1 cuillère (~ 200 pi) de HCl billes de verre lavées à 2 ml tubes. Ajouter 2 ml de U. culture maydis et de spin à 12.000 xg pendant 5 min. Rejeter le surnageant (pellets peuvent être congelés à ce stade).
      2. Ajouter 500 pi de tampon Usti Lysis 2 au culot. Agiter pendant 5 à 15 min sur un Vibrax à 1000 rpm. Vérifiez que le culot cellulaire est complètement remis en suspension.
      3. Incuber les tubes à 65 ° C pendant 15 à 20 min. Utilisation approincubateurs appropriés conçus pour accueillir 2 ml tubes est critique. Ensuite, placez-le sur la glace pendant 5 min.
      4. Ajouter 100 ul de 8 M d'acétate de potassium, le tourbillonnement ou inverser 8 à 10 fois. Essorer 12 000 xg pendant 15 min à température ambiante.
      5. Transfert de 500 ul du surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml et ajouter 400 ul d'isopropanol. Vortex ou inverser 8 à 10 fois. Essorer 12 000 xg pendant 15 min. Retirer le surnageant et laver avec 500 ul de 70% EtOH. Spin 12.000 xg pendant 5 min.
      6. Faire tremper le surnageant complètement! Finalement, ajoutez un essorage court (10 sec) pour éliminer le liquide résiduel. Laissez le culot d'ADN sec pendant 3 à 5 min. Ajouter 50 ul de TE / RNAse et incuber à 50 ° C pendant 10 à 15 min à 400 tours par minute.
    3. PCR
      1. Conception de deux paires d' amorces avec l' un d'eux se lier à l' extérieur des flancs et celle correspondante de liaison au sein de la cassette de résistance (UF-f RC-R; RC-f, DF-r, figure 1) 9.
      2. En utilisant 1 ul d'une dilution 1:10 de l'ADNg de chaque cCANDIDATS comme matrice dans des réactions PCR 2 vérification de l'insertion correcte amont et en aval 9.
      3. Utilisez des réactions classiques de PCR pour chaque candidat et analyser les fragments 22 résultant.
        REMARQUE: Ces PCR tester pour l'insertion de la cassette de résistance dans le locus génomique correcte. Si les produits sont obtenus pour les deux parties, le candidat est probablement une bonne insertion. Cependant, aussi candidats où un seul côté (en amont ou en aval) pourrait être confirmée doivent être effectuées le long d'une analyse plus approfondie dans le cas où les réactions PCR simplement échoué pour un flanc.
  3. Vérification de l' insertion génomique correcte par Southern Blot Analyse 22
    1. Digérer 15 ul d'ADNg (4.2.1) des candidats mutants et la souche de type sauvage / progénitrices correspondant avec une enzyme appropriée qui coupe à l'extérieur du locus / construction et, en outre, réduit soit dans le gène ou la cassette de résistance menant à bien distmotifs inguishable (figure 1) 8.
      NOTE: Aucun des bandes attendues devrait être supérieure à 10 kb, de sorte qu'ils se distinguent clairement de l'ADN non digérés.
    2. Utiliser l'amont et l'aval du flanc en tant que sondes. Pour les étiqueter par exemple utiliser le kit de marquage DIG PCR ou toute méthode standard similaire. Mélanger les sondes marquées dans un rapport de 1: 1 moléculaire et effectuer le transfert de Southern. Gardez au moins deux transformants corrects indépendants.
      NOTE: Le modèle de type sauvage doit être clairement détectable dans la souche d'origine et les clones corrects ne doit contenir que les bandes attendues. Des bandes supplémentaires seulement présentes dans les candidats indiquent d'autres insertions de la construction dans un lieu mal. Ces clones doivent être jetés. Le candidat négatif identifié dans le premier diagnostic par PCR doit contenir les bandes de type sauvage et les bandes de taille (imprévisibles) de la construction de deletion à tort intégré.
  4. Stocks de Glycérine
    REMARQUE: les stocks Glycérine servent à maintenir les clones pendant des années dans les collections de souches. Au moins deux transformants indépendants devraient être tenus pour chaque mutant. Cela permet à des phénotypes comparant qui devraient être identiques.
    1. Cultivez 5 ml de cultures de souches mutantes confirmés dans YEP-Light sur une roue en rotation pendant 24 heures à 28 ° C Mix 500 pi de chaque culture avec 500 ul NSY-Glycerol-moyen. Inversez tube jusqu'à ce milieu de culture et sont bien mélangés. Glycérol dans le milieu empêche la formation de cristaux de glace.
    2. Congeler à -80 ° C. Re-strie une partie de la culture congelée pour tester si le stock est fonctionnel.

5. Microscopic phénotypes

  1. Cultivez 5 ml de cultures de type sauvage et des souches mutantes dans YEP-Light sur une roue en rotation pendant 12 heures à 28 ° C.
  2. Le lendemain, la culture diluée à une DO600 d'environ 0,1 et il pousse jusqu'à ce qu'une DO600 comprise entre 0,5 et 0,7. Une DO600 de 1,0 correspcondes à environ 1 à 2 x 10 7 U. maydis cellules par ml.
  3. Inspecter la morphologie des cellules au microscope.
    NOTE: les cellules saines apparaissent en forme de cigare (figure 4, WT). vacuoles prononcés ou la formation des filaments indiquent que les cellules sont soulignées.
    REMARQUE: Selon le phénotype mutant attendu, l'analyse peut être adapté, par exemple, si des souches de rapporteurs sont utilisés le dosage approprié peut être effectuée à ce stade. Si la morphologie des cellules est une analyse statistique modifiée devrait être effectuée, par exemple, pour déterminer la longueur de la cellule moyenne.

6. Infection Assay

NOTE: Le test d'infection des semis a été visualisé précédemment dans ce journal 11. Il peut soit être réalisée à l' aide d' un haploïde, solopathogenic souche de fond tels que SG200 10 ou par mélange des partenaires d'accouplement compatibles qui à la fois porteurs de la mutation.

  1. Cultiver au moins 40 plants de maïs parsouche pendant 7 jours à un cycle lumineux de 16 h, 200 uE, 28 ° C / 22 ° C (jour / nuit). Ils devraient être au stade 3 feuilles et 10-15 cm de hauteur à jour de l'infection.
  2. Deux jours avant l'infection, démarrer une pré-culture des souches dans 5 ml YEP-Light sur une roue en rotation pendant 24 heures à 28 ° C. Cultiver une culture principale dans 50 ml YEP-Light jusqu'à DO 600 = 1,0 (division cellulaire rate = 2 h, 3 divisions permettent au minimum, peut être fait O / N).
  3. Centrifuger les cellules de culture de 50 ml à 1500 g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant. Laver 3 fois avec H 2 O. stérile Resuspendre les cellules dans H 2 O stérile à une DO 600 de 3,0. Si nécessaire, mélanger les partenaires d'accouplement.
  4. Injecter 250 - 500 pl de suspension cellulaire dans la tige de 7 jours plants âgés de maïs à l'aide d'une petite seringue. Utilisez H 2 O stérile comme témoin. Gardez les plants infectés pendant 7-14 jours supplémentaires dans les mêmes conditions de température et de lumière. Note du phénotype de chaque plante unelon en bonne santé, la chlorose, la formation des anthocyanes, les petites tumeurs, tumeurs de grande taille, les plantes mortes 10.
    NOTE: La notation peut être fait aussi tôt que 7 jours et répété à 14 jours pour suivre l'infection au fil du temps.

Résultats

Les constructions de deletion pour les quatre gènes codés dans chitinolytiques U. maydis génome a été généré par clonage Golden Gate utilisation de la cassette Hygr pour la suppression de CTS1, le NATR pour la suppression de CTS2, la cassette d'G418R pour la suppression de CTS3 et CBXR pour la suppression de CTS4 20. Une vue d' ensemble de la stratégie de remplacement de gène est...

Discussion

Ce protocole décrit comment générer des mutants de délétion pour les études de génétique inverse en U. maydis. Le point de départ est une construction de deletion qui contient des séquences flanquantes du gène d'intérêt contenant des séquences d'environ 1 kb en amont du début et en aval du codon d' arrêt ainsi que d' une cassette de résistance approprié , car il a déjà été optimisé 7,9 . Les constructions doivent être générées individuellement pour chaque g?...

Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose.

Remerciements

Remerciements particuliers à Dr. Benedikt Steuten pour la lecture critique du manuscrit. Le travail original sur les chitinases a été réalisée par le Dr Thorsten Langner. Le laboratoire du VG est pris en charge par le Pôle d'excellence en sciences végétales (CEPLAS, DFG EXC 1028) et ICSOB, le laboratoire de KS est soutenu par ICSOB. KB est soutenu par ICSOB. Les activités scientifiques du Centre des sciences de la bioéconomie (ICSOB) ont été soutenus financièrement par le Ministère de l'innovation, des sciences et de la recherche dans le cadre de la NRW Strategieprojekt ICSOB (n ° 313 / 323-400-00213). LF est soutenu par une bourse de doctorat du DFG Groupe international de formation de recherche 1525 iGRADplant.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Aminobenzoeic acid (Free Acid)Sigma AldrichA-9878
Bacto agar BD214010alternatively use local supplier
Bacto peptoneBD211677alternatively use local supplier
Bacto yeast extract BD212750alternatively use local supplier
CaCl2*2H2OGrüssing GmbH10234alternatively use local supplier
Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt)Sigma AldrichP-2250
Carboxin Sigma Aldrich45371
Casamino acids BD223050
CholinchloridSigma AldrichC-1879
Citric acidChemSolute24,321,000alternatively use local supplier
CuSO4*5H2OFluka61240alternatively use local supplier
D(+)Sucrose Roth4621.1alternatively use local supplier
DNA degr. free acid Sigma-AldrichD-3159
EDTASigma AldrichE4378
FeCl3*6H2OGrüssing GmbH10288alternatively use local supplier
Geneticin (G418) disulfate saltSigma AldrichA1720
Trichoderma lysing enzymesSigma AldrichL1412
D(+) GlucoseCaelo2580alternatively use local supplier
Glycerin Fisher ChemicalG065015alternatively use local supplier
H3BO3AppliChemA2940Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
Heparin sodium saltSigma AldrichH3393-50KU
Hygromycin B-solutionRoth1287.2Dangerous substance. 
KClVWR26764298alternatively use local supplier
KH2PO4AppliChemA3620alternatively use local supplier
MgSO4 waterfreeMerck7487-88-9Water free is critical. Alternatively use local supplier
MnCl2*4H2OAppliChemA2087alternatively use local supplier
myo-InositolSigma AldrichI-5125
Na2-EDTA*2H2OAppliChemA2937alternatively use local supplier
Na2MoO4*2H2ORoth0274.2alternatively use local supplier
Na2SO4Grüssing GmbH12174alternatively use local supplier
NaClFisher ChemicalS316060alternatively use local supplier
NaOHChemSolute13,751,000alternatively use local supplier
NH4NO3RothK299.1alternatively use local supplier
Nicotinic acid (Free acid)Sigma AldrichN-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate  Werner BioAgents5,001,000
Nutrient broth Difcolocal suppliers
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7Sigma AldrichP3803Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions.
polyethylene glycol (PEG)Sigma AldrichP-3640
Potassium acetateAppliChem121479alternatively use local supplier
Pyridoxin (monohydrochlorid)Sigma AldrichP-9755
Riboflavin Sigma AldrichR4500
RNaseASigma AldrichR5503
SDSRothCn30.3alternatively use local supplier
small syringeBD300300alternatively use local supplier
sterile filter, 22 µmVWR28145-477alternatively use local supplier
SorbitolRoth6213.1alternatively use local supplier
Thiamin-hydrochlorideServa36020.02alternatively use local supplier
tri-Na-CitrateFisher ChemicalS332060alternatively use local supplier
Tris- (hydroxymethyl) aminomethaneVWR103156Xalternatively use local supplier
Tris hydrochlorideRoth9090.4alternatively use local supplier
Triton X-100 Serva 37240alternatively use local supplier
ZnCl2Fluka96470alternatively use local supplier
Composition of solutions/preparation of materialComposition of solutions
CarboxinStock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml
CM plates0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose 
Geneticin (G418)Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml
HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm)Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. 
HeparinStock: 15 mg/ml
Holliday salt solution16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate
Holliday vitamin solution 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C
HygromycinStock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml
NourseothricinStock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml
NSY-glycerol-medium0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,  80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) 
RegLight1.0% (w/v) Yeast Extract  0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar
SCS, pH 5.8Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave
STC, pH 81 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile
STC/PEG40 % (v/v) PEG in STC-buffer 
TE buffer, pH 81.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase10 µg/ml RNaseA in TE buffer
Trace elements0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use
Tris-HCl pH 7.5806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave
Usti-lysis buffer 1, pH 810 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. 
Usti-lysis buffer 2mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio
YEPS-Light medium1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar

Références

  1. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
  2. Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
  3. Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
  4. Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
  5. Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
  6. Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
  7. Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
  8. Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
  9. Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
  10. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  11. Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).
  12. Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
  13. van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
  14. Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
  15. Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
  16. Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
  17. Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
  18. Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
  19. Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
  20. Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
  21. Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
  22. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloining: a laboratry manual. , (1989).
  23. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
  24. Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
  25. Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
  26. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  27. Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
  28. Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
  29. Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
  30. Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
  31. Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
  32. Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).

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