Dinamik ışık saçılımı Mikroskopi Bulanık Çözümleri Tane Büyüklüğü Dağılımının Ölçümü

Özet

Dinamik ışık saçılım mikroskobu kullanılarak konsantre çözeltiler içindeki parçacık büyüklüğü dağılımının doğrudan ölçümü için bir protokol verilmektedir.

Özet

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope¹ helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 µm when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

Giriş

Particle size is one of the most fundamental properties of colloidal and polymer solutions. Numerous techniques are used to measure the particle size. Particle sizes of 1.0 µm or larger can be measured directly using an optical microscope. For smaller particles, alternative techniques, such as laser diffraction, electron microscopy, or atomic force microscopy, are used^2,3. Dynamic light scattering is a commonly-used technique for the measurement of particle size distributions in solutions⁴. The results obtained using this technique are not derived from images of the particles but from the characteristic time of the fluctuations in scattered light intensity. These fluctuations originate from Brownian motion, which is characterized by a diffusion constant. The size distribution is obtained from the distribution of diffusion constants using the Einstein-Stokes equation. Due to its simplicity, dynamic light scattering is widely used for the routine assessment of solutions, such as paints and food colloids.

Pretreatment is required for most of the techniques used for the particle size measurement of solution samples. In the case of electron microscopy and atomic force microscopy, the sample must be analyzed under vacuum conditions. Therefore, it is difficult to observe the samples in their native forms. Furthermore, for laser diffraction and dynamic light scattering, only diluted samples that are free from multiple scattering and light absorption can be measured. To overcome this difficulty, several new techniques have been proposed for the measurement of dynamic light scattering from undiluted, concentrated solutions, such as cross-correlation spectroscopy^5,6, low-coherence dynamic light scattering^7,8, diffusing-wave spectroscopy^9,10, and differential dynamic microscopy^11,12.

We have developed a new apparatus called a dynamic light scattering microscope¹. This apparatus enables us to measure turbid samples without dilution by means of a confocal optical system in which multiple scattering is eliminated using a pinhole. However, the measurement procedure and data analysis are slightly more complicated than those of commercially-available instruments. This video explains the measurement procedure and data analysis in detail using the analysis of the temperature-responsive polymer, poly(N-isopropylacrylamide), as an example.

Protokol

1. Numune Hazırlama

1. Sıcaklığa duyarlı monomerlerin saflaştırılması
   1. 100 mL tolüen içinde bir N -isopropylacrylamide 20 g (NIPA) içinde çözülür.
   2. toz ortadan kaldırmak için emme altında çözüm Filtre.
   3. petrol eteri, 500 mL ile süzüntü karıştırın.
   4. bir buz-su banyosu içinde, reaksiyon kabı yerleştirin.
   5. Monomerler (tipik olarak 30 dakika) çökeltilir kadar çözelti karıştırılır.
   6. Çöken monomerlerin elde etmek için emme altında çözüm Filtre.
   7. gece boyunca düşük basınç (100 Pa) altında monomerlerin kurutun.
2. Sıcaklığa duyarlı bir polimer çözeltisinin hazırlanması
   1. bir diyafram pompa ile 1.0 dakika boyunca iyonu giderilmiş su gazdan arındırın 20 mi.
   2. gazı alınmış ve deiyonize su, 9.5 mL saflaştırılmış NIPA arasında 780,8 mg çözülür.
   3. bir buz-su banyosu içinde, reaksiyon kabı yerleştirin.
   4. Reaksıyona kalkanalüminyum folyo ile kaplayan aparat ışık.
   5. yumuşak bir tüp ile gaz silindiri bağlanmış bir pipet ucu ile, Ar gazı orta akım eklenmesi, 10 dakika boyunca yavaşça çözelti karıştırılır.
   6. N, N, N 11.9 uL ', N', bir mikropipet vasıtasıyla çözeltiye tetrametiletilendiamin ekleyin.
   7. Ar, gazın ise adım 1.2.5 belirtildiği gibi, 1.0 dakika boyunca çözelti karıştırılır.
   8. örnek karıştırılırken, gazı alınmış ve deiyonize su, 0.5 mL amonyum persülfat 4,0 mg çözülür.
   9. ve (aşama 1.2.8 arasında) amonyum persülfat çözeltisi (aşama 1.2.7 gelen) örnek çözeltisi karıştırın.
   10. Ar, gazın ise adım 1.2.5 belirtildiği gibi, 30 s için çözelti karıştırılır.
   11. Alüminyum folyo ile çözelti örtün ve bir gece boyunca buzdolabında (4 ° C) 'de muhafaza edin.
3. Numune bağlar hazırlanması
   1. dan (örnek çözeltisi 60 uL yerleştirinbir boşluk slayt adım 1.2.11).
   2. dairesel cam kapak ile çözüm örtün. tuzak hava kabarcıkları için dikkatli olun.
   3. Mikropipet ve laboratuvar mendil kullanarak fazla çözüm çıkarın.
   4. yapıştırıcı ile örnek mühür. oda sıcaklığında (tipik olarak 6 saat) tutkal kurumasını bekleyin.
   5. adımları 1.3.1-1.3.4 izleyerek ağırlıkça% 0.1 polistiren lateks (100 nm partikül çapı) süspansiyonu ile doldurulmuş bir slayt hazırlayın. Bu slayt, bir standart olarak kullanılır.

Dinamik Işık Saçılma Mikroskop ile 2. Partikül Boyutu Ölçümü

1. Aygıtının optimizasyonu
   1. ters mikroskop sahnede (adım 1.3.5 itibaren) polistiren lateks süspansiyon slayt yerleştirin. cam kapak tarafı aşağı bakmalıdır.
   2. Dedektörün önünde bir ışın damperi (çığ fotodiyot ve bir autocorrelator) yerleştirin.
   3. Bir lazer ışını (solid-state lazer, λ = 488 nm, 30 mW uygulayın, sürekliobjektif lensi numuneye dalga) (10 x). Yansıyan ışığın bir kısmı mikroskop bir fırlatma ayna geçer ve bir CCD kamera ile gözlenen mikroskobu (Şekil 1) yan bağlantı monte edilir.
   4. düşük-yüksek konumdan objektif lens yüksekliğini kaydırarak örnek süspansiyon de odak noktasını ayarlamak için objektif lens yüksekliğini ayarlayın. Kapak cam ve numune arasındaki arayüz, cam kapak yüzeyinde ve numune ve delik slayt cam arasındaki arayüzde: Bu işlem sırasında, yansıyan görüntü üç kez odaklanmıştır. İkinci ve üçüncü nokta arasındaki odak noktası ayarlayın.
   5. lazer gücünü değiştirerek dağınık ışık yoğunluğunu hafifletir.
   6. Dedektörün önündeki ışın damperi kaldırarak dedektör içine dağılmış ışık tanıtmak. Bu birim ışık şiddeti zaman korelasyon ölçer.
   7. betw bir iğne deliği (φ = 50 mikron) Setkonfokal etkiyi elde etmek için mikroskop ve dedektör een. Dedektörün ışık yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için iğne deliği konumunu ayarlayın.
   8. Bir bilgisayar üzerinden korelatör çalışmasını başlatarak 30 saniye süreyle dağınık ışık şiddeti zaman korelasyon fonksiyonu ölçün. 1, t, korelasyon zaman ⁴ ve - ölçülen korelasyon fonksiyonu genellikle gr ^(2), (±) olarak ifade edilir . Burada, I (t) t zamanında ve (•••) _T zaman ortalama olan en dağınık ışık şiddetidir. çürüme süresi yaklaşık 0.1 ms olacaktır.
   9. Zaman korelasyon fonksiyonunun ilk genlik için geniş bir yelpazede elde etmek için odak noktası ayarlayın (g ⁽²⁾ (t = 0) - 1).
      NOT: İlk genlik kuvvetle yansıyan ışığın miktarına göre değişir. Odak noktası tow hareket ettirerekKapak cam ve numune, yansıyan ışık miktarında artma arasındaki arayüzü ard. polistiren lateks gibi güçlü bir ışık saçıcı için, başlangıç ​​genliği Ancak, 0 ile 1 arasında değiştirilebilir, yansıtılan ışığın yoğunluğu çok daha yüksek olduğu için daha yaygın polimer çözeltileri için 1 civarındadır başlangıç ​​genliğini ayarlamak zordur saçılan ışığın bu.
   10. Ters Laplace dönüşümü boyutu dağılımı fonksiyonunu elde etmek için elde edilen zaman korelasyon fonksiyonu (kısıtlı düzenlilestirme programı CONTIN ^13,14 kullanarak) uygulayın. Başlangıç ​​büyüklüğü en az 0.2 olarak ayarlanır durumlarda, hidrodinamik yarıçapının dağılım fonksiyonu iki gerçek yan çapı (ayrıntılar için tartışmaya bakınız) 100 nm civarında sivri bir tepe gösterir.
2. örnek ölçümü
   1. 25 ° C'ye sahne sıcaklığını ayarlamak.
   2. poli-NIPA (PNIPA) SOLUT ile hazırlanan bir slayt yerleştiriniyon mikroskobu sahnede (adım 1.3.4).
   3. adımları 2.1.4-2.1.8 izleyerek saçılan ışık şiddeti zaman korelasyon fonksiyonu ölçün. İlk genlik 0.2 büyükse, adım 2.1.9 takip ederek zaman korelasyon fonksiyonunun ilk genlik yapmak için en az 0.2 odak noktasını ayarlayın. Küçük bir başlangıç ​​genlik analizi kolaylaştırır.
   4. 35 ° C'ye sahne sıcaklığını ayarlamak ve çözüm bulanık dönene kadar bekleyin. PNIPA çözümün düşük kritik çözelti sıcaklığı (LCST'nin) C ¹⁵ 32 ° 'dir.
   5. Aşağıdaki adımlarla zaman korelasyon fonksiyonu ölçmek 2.1.4-2.1.8. Mümkünse, zaman korelasyon fonksiyonu az 0.2 başlangıç ​​genlik yapmak için odak noktası konumunu ayarlayın. bulanık çözeltiler için, başlangıç ​​genlikleri yansıtılan ışığın bu sabit kalmaktadır dağınık ışık artar yoğunluğu için, artma eğilimi gösterir.
   6. Ters Laplace transformati uygulaElde edilen zaman korelasyon fonksiyonları üzerinde boyut dağılım fonksiyonlarını elde etmek. gerçek boyut, ilk büyüklüğü 0.2'den daha az olduğu durumlarda yarısı elde edilen değer olduğuna dikkat edin.

Sonuçlar

Bir polistiren lateks süspansiyon için saçılan ışık yoğunluğunun zaman korelasyon fonksiyonları (partikül çapı: 50 nm), Şekil 2 'de gösterildiği gibi, farklı odak noktalarında ölçülmüştür (a) dır. Bu korelasyon fonksiyonları Ters Laplace dönüşümü ile hidrodinamik yarıçapı dağılımı fonksiyonları dönüştürülmüştür (bakınız Şekil 2 (b) ve (c)). Aynı prosedür kullanılarak, PNIPA çözeltisi hidrodinamik yarıçapının zaman korelasyon fonksiyonları ve dağılım fonksiyonları sırasıyla 25 ° C'de elde edildi ve 35 ° C idi. Şekil 3 (a) ve (b) dağınık ışık yoğunluğunun zaman korelasyon fonksiyonlarını yukarıda PNIPA aşağıdaki çözeltisi (25 ° C) ve (35 ° C) LCST'nin karşılık gelen boyutu dağılımı fonksiyonları gösterir. boyut dağılım fonksiyonları takip Ters Laplace dönüşümü ile elde edilmiştirKısmi Heterodyne düzeltilmesi. LCST'nin altında ortalama hidrodinamik çapı polimer çözeltileri için tipik olan nanometre onlarca vardır. Bunun aksine, yukarıda belirtilen LCST'nin hidrodinamik çapı yaklaşık 1.0 mm. Bu sonuç, çözüm LCST'nin üzerinde bulanık olduğu gerçeği ile tutarlıdır. Şekil 3'te kırmızı ve mavi çizgiler hemen sonra elde edilen ve çözümden sonra 20 dk sırasıyla bulanık hale PNIPA çözümleri büyüklük dağılımını temsil etmektedir. Şekil 3 (b) açık bir şekilde toplanmasının büyüme gösterir.

Şekil dinamik ışık saçılımı mikroskobunun 1. Şemalar. İğne Deliği (PH), ışın ayırıcı (BS), polarize (Pol), ve çığ fotodiyot (AKB). Görmek için buraya tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.

Polistiren lateks süspansiyon için 2. Temsilcisi sonuçları Şekil. (A) polistiren lateks süspansiyon için dağınık ışık yoğunluğu Zaman korelasyon fonksiyonları. Nominal çapı 50 nm, yoğunluğu 0.1 ila% 'dir. Iki gerçekleştirmede farklı saçılma noktaları elde edilmiştir. (B) ters Laplace dönüşümlerinin elde edilen polistiren lateks süspansiyon (c) 'e uygun boyut dağılımı işlevleri (a) dır. kırmızı çizgi olan ilk genliği yaklaşık 1.0 kez korelasyon fonksiyonuna karşılık gelir ve mavi çizgi, yaklaşık 0.2 olan bir ilk genlikli karşılık gelir. Yatay eksen kısmi heterodin (PHD) etkisini göz önünde bulundurarak, (b) olmadan ve (c) hesaplandı BIR << ; 1. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil, bir PNIPA çözeltisi 3. Örnek sonuçlanır. (A) PNIPA çözümü için dağınık ışık yoğunluğu Zaman korelasyon fonksiyonları. (B) (a) ters Laplace dönüşümlerinin elde PNIPA çözümü için uygun büyüklükte dağılım fonksiyonları. Yatay eksen her veri seti için kısmi heterodyning etkisi dikkate alınarak hesaplandı. siyah çizgi 25 ° C'de elde edilen verileri temsil eder. Kırmızı çizgi çözüm bulanık döndü hemen sonra elde edilen verileri (35 ° C) temsil etmektedir. mavi çizgi kırmızı çizgi bir 20 dk ölçümden sonra elde edilen verileri temsil eder./54885/54885fig3large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Zaman bağıntı fonksiyonunun başlangıç büyüklüğü büyük ölçüde Şekil 2'de gösterildiği gibi, bir odak noktasına bağlıdır: (a). Bu görünüşte çözeltisi (arabiriminde ince bir tabaka hariç) homojen olduğu gerçeğini ⁸ çelişmektedir. Başlangıç ​​genlik Bu değişim yansıtılan ışığın miktarı bir varyasyon ilişkilendirilir. Kısmi heterodyne teorisi ¹⁶ ilk genlik, A, dağınık ışık şiddeti, ben _s ve yansıyan ışık yoğunluğu, ben _r, aşağıdaki denklemi tatmin tahmin ¹

Bu denklem ı _r büyür olduğunu gösterir, daha küçük bir hale gelir. Bu nedenle, A arayüzü yakın fokal konumunun ayarlanması ile azaltılır. Görünür difüzyon sabiti D _A can, tek dağılımlı çözeltiler durumunda bu zaman bağıntı fonksiyonunu oturtulması ile elde edilebilir:

nerede . Burada, n çözücü (su, 1.33) kırılma indeksi olduğu, θ dağınık açısı (180 °), ve λ hafif (514.5 nm) dalga boyudur. Biz geri saçılma geometri uygulanan bu yana, q değeri sabittir. Bununla birlikte, bu nokta farklı dalga boylarında ışık kullanılarak çözülmüştür. Sürekli dalga lazer kaynağının her türlü DLS mikroskop inşa etmek mevcut olduğunu lütfen unutmayınız. Küçük ışınlanmış hacmi sayesinde, tutarlılık faktörü ¹⁷ den fazla 0.99 olacağı tahmin ve göz ardı edilebilir olduğunu. Polidispers çözeltiler, D, _A, dağılım fonksiyonu Ters Laplace transformasyonu ile elde edilir. Kısmi heterodyne incieory ayrıca D _Bir gerçek difüzyon sabiti D aynı değildir öngörür. Bu iki difüzyon sabitleri aşağıdaki denklemi karşılar:

-Sındaki geçiş sabiti D Einstein Stokes denklemi kullanarak ⁴ hidrodinamik çapı R, _H dönüştürülür. A = 1, bu ilişki D _A = D olduğunda. Bu durumda, veri dönüştürme işlemi ortak dinamik ışık saçılımı için aynıdır. Şekil 2 (b) 'de gösterildiği kırmızı çizgi, bu durumda karşılık gelir. Bunun aksine, bu ilişki sınırında D _A = 0.5 D olur → 0 küçük (pratik, daha az 0.2) olduğu zaman ile gösterildiği gibi nedenle, boyut, gerçek boyut olarak iki kat daha büyük olduğu tahmin edilmektedir Şekil 2 (b) 'nin mavi çizgi . Biz bir ölçüde küçük olduğunu biliyorsanız, Şekil 2 (c) 'de gösterildiği gibi, yatay eksen, itilebilir. Prensip olarak, biz A'nın herhangi bir değer için D içine D _A dönüştürebilirsiniz. Basit yaklaşım D _A ~ 0.5 D geçerlidir çünkü Uygulamada, ancak, 0.2 den ilk genlik küçük ayarlamak için daha iyidir.

dinamik ışık saçılımı mikroskop tekniği belirgin özellikleri PNIPA çözeltisi kullanılarak gösterildi. Aşağıda ve LCST'nin üstünde PNIPA konformasyon yoğun ^15,18 saçılma küçük açı nötron kullanılarak incelenmiştir. Bunun aksine, dinamik ışık saçılımı nedeniyle bulanıklık ¹⁹ LCST'nin üzerinde PNIPA analizi için kullanılan edilmemiştir. Şekil 3 'de gösterildiği gibi, bu sorun, dinamik ışık saçılımı mikroskobu ile çözülmüştür, (a) ve (b). Bu agrega büyüklüğü birkaç olup &181. m, küçük açı X-ışını / nötron saçılımı veya geleneksel ışık saçılma teknikleriyle ya ile elde edilemeyen. Bu sistemi kullanarak zamana bağımlı ölçümler sıcaklık değişimi sırasında toplama süreci hakkında bilgi vermek.

Dinamik ışık saçılım mikroskobu dezavantajı, Şekil 3 'de gösterilmiştir. LCST'nin altında sonuç için, zaman korelasyon fonksiyonu kuvvetle toz mevcut çok az miktarda (Şekil 3'te siyah çizgiler) tarafından etkilenir. Örneğin, zaman korelasyon fonksiyonu bile 1.0 sn sırasına göre korelasyon süreleri ile tamamen çürümez. Bu cihaz (yaklaşık 1.0 um) ışınlandı hacmi her zaman, dinamik ışık saçılımı cihazının (yaklaşık 100 um) olan bu ışınlanmış daha küçük olmasıdır. saçılan ışığın yoğunluğu zayıftır durumlarda, sinyal, s neden olduğu gibi, gürültü ile örtülü olduğuçözelti içinde toz merkezi miktarları. Boyutu genel sırası anlamlıdır sonucu, bu Şekil 3 (b) 'de gösterilen üç adet tepe noktası niceliksel bir öneme sahip olmayabilir. Bu zayıf saçıcı geleneksel bir dinamik ışık saçma cihazı ile ölçülebilir unutmayın.

Biz dinamik ışık saçılımı mikroskobu bize aynı kurulum ile şeffaf ve bulanık hem örnekleri ölçmek için olanak olduğunu göstermiştir. Örneklerde optik yol uzunluğu kısa olduğu için, bu yöntem, C-nanotüp süspansiyonlar ²⁰ kadar güçlü ışık emici örnekleri uygulanabilir. Buna ek olarak, yüksek uzaysal çözünürlüğü, bu teknik, biyolojik hücrelere uygulanabilir. biyoloji uygulanması için bu yöntem aynı zamanda, floresans ve Raman görüntüleme gibi görüntüleme teknikleri ile birleştirilebilir. Böylece, dinamik ışık saçılımı mikroskop araştırma alanları geniş bir yelpazede için güçlü bir araç olduğunu düşünüyoruz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-isopropylacrylamide, 98%	Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.	I0401
toluene, 99%	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	201-01876
petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 °C	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	169-22565
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, 99%	Sigma	T9281
ammonium persulfate, 98%	Sigma	248614
polystyrene latex suspension, 1 wt%	Duke Scientific Corporation	3500A
argon	Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.		purity > 99.999 vol.%
cavity slide	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	83-0336
inverted microscope	Nikon Instech Co., Ltd.	ECLIPSE Ti-U
Thermo Plate	Tokai Hit CO.,Ltd	TP-108R-C
Solid-state laser	Coherent	OBIS 488LX
avalanche photodiode	ALV-GmbH	ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode
correlator	ALV-GmbH	ALV-5000/EPP