Murin Aort Kırma Yaralanması: Verimli<emIn vivo</em&gt; Düz Kas Hücresi çoğalması ve Endotel Fonksiyon Modeli

Özet

Kardiyovasküler prosedürleri takiben yapılan restenoz (baypas cerrahisi, anjiyoplasti veya stentleme) bu prosedürlerin dayanıklılığını azaltmakta önemli bir sorundur. İdeal bir terapi düz kas hücresi (VSMC) proliferasyonunu inhibe ederken endotelin rejenerasyonunu teşvik eder. VSMC çoğalması ve endotel fonksiyonunun in vivo olarak eşzamanlı olarak değerlendirilmesi için bir model tanımlıyoruz.

Özet

Arteryel rekonstrüksiyon, ister anjiyoplasti ister baypas cerrahisi olsun, iyatrojenik travmayı endotel hasarına ve vasküler düz kas hücresi (VSMC) proliferasyonuna neden olur. Ortak fare modelleri karotis ve femoral arterler gibi küçük damarları inceler. Burada hem VSMC çoğalması hem de endotel bariyer fonksiyonunun aynı anda büyük bir kapta değerlendirilebildiği bir in vivo sistem tanımlanmaktadır. C57BL / 6 farelerde yaralanmaya karşı infrarenal aortik tepki üzerinde çalıştık. Aort, sol böbrek veninden aortik bifurkasyona 5 saniyelik sürtünme ile pamuk uçlu aplikatör ile yaralandı. Morfolojik değişiklikler konvansiyonel histoloji ile değerlendirildi. Aort duvar kalınlığı lüminal yüzeyden adventi- teye kadar ölçüldü. VSUc çoğalmasını göstermek için DUI ve alfa-aktin ile EdU entegrasyonu ve sayaç boyama kullanıldı. İntimal hiperplazi oluşumunun bilinen bir düzenleyicisi olan ERK1 / 2'nin aktivasyonu caydırıcıydıWestern Blot analizi ile çıkarıldı. Enflamasyonun etkisi, B hücreleri, T hücreleri ve makrofajlar için immünhistokimyasal yöntemle belirlendi . Endotelin yüz bölümleri taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile görselleştirildi. Evans Blue boyama ile endotel bariyer fonksiyonu belirlendi. Transmural yaralanma aort duvarı kalınlaşmasına neden oldu. Bu hasar, VSMC çoğalmasını, en belirgin şekilde yaralanmadan 3 gün sonra indükledi ve ERK1 / 2'nin erken aktivasyonu ve p27 ^kip1 ekspresyonunu azalttı. Yaralanma, damar duvarında artmış B-hücreleri, T-hücreleri veya makrofaj infiltrasyonuyla sonuçlanmadı. Yaralanma, kısmi endotel hücresi soyulmasına ve hücre-hücre temasının kaybına neden oldu. Yaralanma, endotel bariyer fonksiyonunda belirgin bir kayıp ile sonuçlandı ve bu, yedi gün sonra başlangıç ​​noktasına döndü. Kemirgen transmüral künt aort yaralanması modeli, VSMC çoğalmasını ve endotel bariyer fonksiyonunu büyük bir kapta eşzamanlı olarak incelemek için etkili bir sistem sağlar.

Giriş

Restenoz (Bypass ameliyatı, anjiyoplasti veya stentleme) kardiyovasküler prosedürlerin ardından bu prosedürlerin dayanıklılığını azaltmakta önemli bir problemdir. Tüm revaskülarizasyon prosedürleri restenoz tarafından engellenmektedir. Restenozu (ilaç salınımlı stentler ve ilaç kaplı balonlar) önlemek için mevcut stratejiler hem vasküler düz kas hücresi (VSMC) hem de endotel hücre proliferasyonunu (EC) inhibe etmektedir. Sonuç olarak, bu müdahaleler VSMC aracılı restenozu engeller, aynı zamanda endotelin yenilenmesini önler. Sağlam bir endotel olmadan, hastaların, kanama komplikasyonları riski altında in situ tromboz riskini azaltmak için güçlü anti-platelet ajanlar üzerinde olması gerekmektedir. İdeal bir terapi, endotelin rejenerasyonunu teşvik ederken VSMC çoğalmasını inhibe eder. Bu nedenle, VSMC çoğalmasını ve endotel bariyer fonksiyonunu aynı anda çalışmak için bir vesikaya ihtiyaç vardır.

Halen, sever varRestenosis ¹ al fare modelleri. Bu modeller karotis ligasyonu ve femoral arter tel hasarı ^{2'yi içerir} . Aortik modeller arasında stent yerleştirme ³ , balon hasarı ⁴ ve aortik allograft ^{5 bulunur} . Mevcut modellerin tümü sınırlıdır. Karotis ligasyonu, akış aracılı bir neointimal lezyon oluşturur ve endotel hasarına sahip değildir. Buna ek olarak, hem karotis hem de femoral arterler, insan damarlarına göre çok daha az kat kat daha az hücre katına sahiptir ve translasyonel değerlerini sınırlar. Çapı yaklaşık 1.3 mm olan fare aortu, klinik açıdan alakalı (koroner) bir insan artere yaklaşık tek damartır (3).

Kemirgen aortik modellerin translasyonel potansiyeline rağmen, mevcut modellerin kısıtlamaları vardır. Bu modeller gelişmiş mikrocerrahi becerileri ve anjiyoplasti balonları ve stentler gibi özel ekipman gerektirir. Burada,Eşzamanlı olarak VSMC proliferasyonunu uyarmak ve endotel bariyer fonksiyonunu bozmak için yeni, tekrarlanabilir bir teknik.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Etik Beyanı: Hayvan taşıma protokolleri Maryland Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış (protokol numarası 0416009) ve AAALAC-Uluslararası standartlarına göre yürütülmüştür.

1. Cerrahi İşlem

1. Anestezi Tekniği
   1. Hayatta kalma cerrahisinde kullanılan tüm cihazları 121 ° C'de 30 dakika boyunca buhar sterilizasyonu ile sterilize edin.
   2. Anestezi indüksiyon tankı ile% 100 O ₂ ve% 2.5 izofluran hassas damla yoluyla sağlayın. İndüksiyon sonrası, izofloranın kesilmesi ve odacığın O ₂ ile yıkanması. Yüz maskesi yoluyla % 1.5-2 izofluran ve solunum yoluyla 1 L / dak O ile anestezi uygulayın.
   3. Personeli korumak için hem indüksiyon odasını hem de yüz maskesini atık gaz adsorpsiyonu için bir kömür toplayıcıya takın. Gösteriyle uygun bir anestezi düzlemi hazırlayınZehirli uyaranlara (toe pinch) tepki olmadığını söyler.
   4. Ameliyat sırasında termal destek sağlamak için izotermal pedli bir cerrahi tepsi içeren bir operasyon alanı oluşturun. Ek bir izotermik ped, kurtarma kafesindeki hayvanlara termal destek sağlayacaktır.
2. Hayvan Hazırlama
   1. Aşağıdaki araştırmayı 10-12 haftalık erkek C57BL / 6 fareler üzerinde gerçekleştirin.
   2. Hayvan ventral karın yüzeyindeki kılları sternumdan inguinal bölgeye bir kaşıntı ajanı veya 40 numaralı bıçaklı bir elektrikli kesiciyle çıkarın.
      1. Depilasyon ajanı durumunda bu bileşimi cerrahi alana 2-3 dakika uygulayın ve sonra pamukla çıkartın. Ticari olarak bulunan bir kalsiyum hidroksit ve sodyum hidroksit bileşiği kullanıyoruz.
   3. % 70 alkol ile omzun üzerinden alan hazırlayın ve 25 gauge veya daha küçük çaplı iğne ile karprofen (5 mg / kg) enjekte edin. BuTedavi hayvan için postoperatif analjezi sağlayacaktır.
   4. Hayvanı cerrahi alana aktarın ve sırt üstü yatma pozisyonuna getirin.
   5. Temiz bir pamuk aplikatörü veya pamuklu gazlı bez ile% 8-12 propidon iyodür fırçalayarak cerrahi alanı hazırlayın. Daha sonra cildi iki kez% 70 alkolle durulayın.
   6. Kornea kurutması insidansını azaltmak için her iki göze de oküler yağlayıcı yerleştirin. Cerrahi alanı steril bir örtüyle örtün.
3. Ameliyat tekniği
   1. Yaklaşık 2-2.5 cm uzunluğunda medial bir abdominal laparotomi insizyonu yapın, ksilofoid işlemi hemen kaudal başlayıp pelvise doğru uzanan bir neşterle yapın.
   2. İnce bağırsak ve duodenumu harekete geçirin ve sağa doğru yanlara doğru yansıtın. Sarılı steril pamuklu bir şerit sarın ve pozlamayı iyileştirmek için iç organın paketlenmesine izin vermek için enjeksiyon için steril salinle ıslatılır.
   3. Sağa doğru harekete geçirilen ince bağırsakRetroperitoneumu ortaya çıkarır ve abdominal aortayı sol böbrek veninden aort bifurkasyona maruz bırakır ( Şekil 1 ).
   4. Steril pamuk uçlu bir aplikatör ile, her biri beş saniye süresince 30 ardışık öğütme yapın.
   5. Ambalajı çıkarın ve iç organın yerlerine dönmesine izin verin.
   6. Çalışan 4-0 emilebilir bir monofilament 봉iyle (poldioksanon) kapatın. Deri 6-0 emilemeyen monofilament sütürle (naylon) kapatılır.
4. İyileşme ve Prosedür Sonrası Bakım
   1. Prosedürden sonra, hayvan normal şekilde ambulate gelene kadar, termal desteğini sürdürmek için, izotermal bir ped üzerinde temiz tabakalı bir kurtarma kafesine yerleştirin. Hayvanı sternal dinlenme kabiliyetini gösterene kadar gözetimsiz bırakmayın.
   2. Ameliyattan sonraki ilk 4 saat boyunca her saat hayvan izleyin. Hayvan normalde ambulasyon yaparak i T atanmış yetiştirme odasına. Hayvan, tamamen kurtarılana kadar bir başka hayvanın şirketinde bulunmaz.
   3. Hayvanı ameliyattan sonraki ilk 72 saat boyunca günde iki kez ve bundan sonra da haftada en az 3 kez izleyin. İzleme, haftanın üç günü hayvanın tartımını içerir.
   4. Ameliyattan sonraki ilk 72 saat boyunca günde iki kez subkütan carpofen (5 mg / kg) uygulayın.

2. Doku İhalesi

1. Ötenazi Yöntemi
   1. Hayvanları önceden belirlenmiş zaman noktalarından iniltin.
   2. Anestezi indüksiyon tankı ile% 100 O ₂ ve% 2.5 izofluran hassas damla yoluyla sağlayın.
      1. Endotelin bütünlüğünü incelemek için Evans Blue boyayı hayvana uygulayın.
         NOT: Evans Blue, albumin için yüksek bir bağlanma afinitesi olan negatif yüklü bir azo boya olup sadece bozulmamış bir endotelin yokluğunda kan damarlarını lekelemektedirS = "xref"> 6.
      2. Endotel bütünlüğü çalışmaları için, ötenazi anında 5 mL% 0.3 Evans Blue boyayla hayvanlara perfüze edilmeli ve bunu takiben 5 dakika için fizyolojik basınçta 5 mL PBS uygulayınız. Hayvan perfüzyon prosedürü sırasında cerrahi bir anestezi düzleminde muhafaza edilir.
   3. Derin anestezi düzlemine ulaştıktan sonra göğsünü bir sternotomi ile açın. Hayvandan kan drenajına izin vermek için sağ atriumda bir kesikleştirme yapın ve sol ventriküle erişmek için 21 G'lik bir iğne ile erişin ve sağ atriyumdan çıkan atık berrak olana kadar fosfat tamponlu salin (PBS) enjektörü uygulayın.
   4. PBS ile perfüzyondan sonra, karın orta hat kesi yoluyla girilir.
   5. Bir kez daha, ince barsağı infrarenal aortayı ortaya çıkaran karın sağ tarafına hareketlendirin, aortayı bitişik dokulardan keskin bir şekilde parçalayın ve sol böbrek veninden aort bifurkasyona geçirin.
   6. Kesilen aortayı% 4 paraformaldEhyde solüsyonu doku işleme oluşuncaya kadar çözülür.
      1. Endotel bütünlüğü çalışmaları için, aortu uzunlamasına açın ve lümen yüzeyinin ⁶ tamamını içine alan bir mum sayfasına tutturun. Evans Blue boyasıyla boyama derecesine göre endotel bütünlüğünü niteliksel bir değerlendirme yapın ⁶ .
      2. Diğer histolojik tahliller için aortanın enine kesitini alın ve kullanılacak histolojik yöntemle belirlendiği üzere en uygun kesme ısısı (OCT) bileşiklerine yerleştirin ⁷ .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

OCT'de gömülü transvers kesitler aort kesitlendirildi ve hematoksilen ve eozin ile boyandıktan sonra iç ve dış elastik tabakaları tanımlamak için Verhoeff-Van Gieson (VVG) lekesi ile sayaçla boyandı ⁷ . Bir dolandırıcılık işlemi ile tedavi edilen hayvanların aortalarına (laparotomi ve tek başına ince bağırsak mobilizasyonu) kıyasla yaralanmaya neden olan aort duvar kalınlaşmasını ezin. Adventitia lümene olan uzaklıkla değerlendir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Medial hiperplazi ve endotel bariyer disfonksiyonu ile sonuçlanan bir murin aort yaralanma modelinin etkilerini karakterize ettik. Aort intima boyunca kısmi AT dekolmanı, hücre-hücre teması kaybına ve hücre çıkıntılarının arttırılmasına eşlik etti. Buna paralel olarak, endotel bariyer fonksiyonu önemli ölçüde bozulmuş ve mitojen duyarlı sinyal yollarını uyarmış ve VSMC'lerin çoğalmasına ve damar duvarının kalınlaşmasına yol açmıştır. Bu modelin güçlü yönleri, hastalığın...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ocular lubricant	Dechra	17033-211-38	Pharmaceutical agents
Isoflurane	VetOne	502017	Pharmaceutical agents
Carprofen	Zoetis	26357	Pharmaceutical agents
Precision vaporizer	Summit Medical	10675	Surgical supplies
Charcoal scavenger	Bickford Inc.	80120	Surgical supplies
Isothermal pad	Harvard Apparatus	50-7053-R	Surgical supplies
Sterile cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-124	Surgical supplies
4-0 absorbable monofilament suture	Ethicon, Inc	J310	Surgical supplies
5-0 non-absorbable monofilament suture	Ethicon,Inc	1666	Surgical supplies
21-gauge x 1 inch needle	BD Biosciences	305165	Surgical supplies
25-gauge x 1 inch  needle	BD Biosciences	305125	Surgical supplies
Dry sterilizer	Cellpoint	7770	Surgical supplies
Fine scissors	Fine Science Tools	14058-09	Surgical instruments
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12	Surgical instruments
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	Surgical instruments
Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge	Fine Science Tools	15000-00	Surgical instruments
Needle driver	Fine Science Tools	91201-13	Surgical instruments
Scalpel handle #4	Fine Science Tools	10004-13	Surgical instruments
Scalpel blades #10	Fine Science Tools	10010-00	Surgical instruments
PBS	Lonza	17-516F	Reagents for tissue processing
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129	Reagents for tissue processing
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagents for tissue processing
Modeling wax	Bego	40001	Reagents for tissue processing
OCT compound	Tissue-Tek Sakura	4583	Reagents for tissue processing
Mayer's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	MHS16	Reagents for immunohistological analysis
Eosin Y solution alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110316	Reagents for immunohistological analysis
Elastin stain kit	Sigma-Aldrich	HT25A	Reagents for immunohistological analysis
Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit	Invitrogen	C10337	Reagents for immunohistological analysis
Anti-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4695	Reagents for immunohistological analysis
Anti-phospho-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4370	Reagents for immunohistological analysis
Anti-p27kip1 antibody	Cell Signaling Technology	3698	Reagents for immunohistological analysis
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	Reagents for immunohistological analysis