Murine Aortic Crush Injury: Eine effiziente<em&gt; In vivo</em&gt; Modell der glatten Muskelzellproliferation und Endothelfunktion

Zusammenfassung

Restenose nach Herz-Kreislauf-Verfahren (Bypass-Chirurgie, Angioplastie oder Stenting) ist ein wichtiges Problem der Verringerung der Haltbarkeit dieser Verfahren. Eine ideale Therapie würde die Proliferation der glatten Muskelzelle (VSMC) hemmen und gleichzeitig die Regeneration des Endothels fördern. Wir beschreiben ein Modell zur gleichzeitigen Beurteilung der VSMC-Proliferation und Endothelfunktion in vivo.

Zusammenfassung

Arterielle Rekonstruktion, ob Angioplastie oder Bypass-Operation, beinhaltet iatrogenes Trauma verursacht endotheliale Störung und vaskuläre glatte Muskelzelle (VSMC) Proliferation. Gemeinsame murine Modelle studieren kleine Gefäße wie die Carotis- und Oberschenkelarterien. Hier beschreiben wir ein in vivo- System, in dem sowohl die VSMC-Proliferation als auch die endotheliale Barrierefunktion gleichzeitig in einem großen Gefäß beurteilt werden können. Wir untersuchten die infrarenale Aortenreaktion auf Verletzungen in C57BL / 6 Mäusen. Die Aorta wurde von der linken Nierenvene zur Aortenbifurkation durch 30 transmurale Quetschungen von 5 Sekunden Dauer mit einem Baumwollspitzapplikator verletzt. Morphologische Veränderungen wurden mit konventioneller Histologie beurteilt. Die Aorta-Wanddicke wurde von der Lumenoberfläche bis zur Adventitia gemessen. EdU-Integration und Gegenfärbung mit DAPI und Alpha-Actin wurde zur Demonstration der VSMC-Proliferation verwendet. Die Aktivierung von ERK1 / 2, ein bekannter Moderator der intimalen Hyperplasiebildung, wurde abgebautAbgebaut durch Western-Blot-Analyse. Die Wirkung der Entzündung wurde durch Immunhistochemie für B-Zellen, T-Zellen und Makrophagen bestimmt . En- Gesichtsabschnitte von Endothel wurden mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM) visualisiert. Die endotheliale Barrierefunktion wurde mit Evans Blue Färbung bestimmt. Transmurale Verletzungen führten zu Aortenwandverdickung. Diese Verletzung induzierte die VSMC-Proliferation, am deutlichsten bei 3 Tagen nach Verletzung und die frühzeitige Aktivierung von ERK1 / 2 und verringerte die p27- ^kip1- Expression. Verletzung führte nicht zu erhöhten B-Zellen, T-Zellen oder Makrophagen Infiltration in der Gefäßwand. Verletzung verursacht partielle Endothelzell-Entblößung und Verlust von Zell-Zell-Kontakt. Verletzung führte zu einem signifikanten Verlust der endothelialen Barriere-Funktion, die nach 7 Tagen zur Grundlinie zurückkehrte. Das murine transmurale stumpfe Aortenverletzungsmodell bietet ein effizientes System, um gleichzeitig sowohl die VSMC-Proliferation als auch die endotheliale Barrierefunktion in einem großen Gefäß zu studieren.

Einleitung

Restenose Nach Herz-Kreislauf-Verfahren (Bypass-Chirurgie, Angioplastie oder Stenting) ist ein erhebliches Problem der Verringerung der Haltbarkeit dieser Verfahren. Alle Revaskularisierungsverfahren werden durch Restenose geplagt. Gegenwärtige Strategien zur Verhinderung von Restenose (Arzneimittel-eluierende Stents und drogenbeschichtete Ballons) hemmen sowohl die vaskuläre glatte Muskelzelle (VSMC) als auch die endotheliale Zellproliferation (EC). Folglich verhindern diese Interventionen eine VSMC-vermittelte Restenose, verhindern aber auch die Regeneration des Endothels. Ohne ein intaktes Endothel sind die Patienten verpflichtet, auf potenten Antithrombozytenagenten zu sein, um das Risiko einer in situ-Thrombose zu verringern, um die Komplikationen zu bluten. Eine ideale Therapie würde die VSMC-Proliferation hemmen und gleichzeitig die Regeneration des Endothels fördern. Somit besteht die Notwendigkeit, gleichzeitig die VSMC-Proliferation und die endotheliale Barrierefunktion i n vivo zu studieren.

Jetzt gibt es severAl Mausmodelle der Restenose ¹ . Diese Modelle beinhalten Karotisligatur und Femoralarterienverletzung ² . Aortenmodelle umfassen Stent-Platzierung ³ , Ballonverletzung ⁴ und Aortenallotransplantat ⁵ . Alle aktuellen Modelle sind begrenzt. Carotis-Ligation erzeugt eine fließvermittelte neointimale Läsion und hat keine endotheliale Verletzung. Darüber hinaus haben sowohl Carotis- als auch Oberschenkelarterien vielfach weniger Zellschichten als menschliche Gefäße, was ihren Translationswert begrenzt. Die Mausaorta, die etwa 1,3 mm im Durchmesser ist, ist das einzige Gefäß, das eine klinisch relevante (koronare) menschliche Arterie (3) annähert.

Trotz des translationalen Potenzials von murinen Aortenmodellen der Erkrankung haben aktuelle Modelle Einschränkungen. Diese Modelle erfordern fortgeschrittene mikrochirurgische Fähigkeiten und spezialisierte Ausrüstung wie Angioplastie Ballons und Stents. Hier präsentieren wirEine neuartige, reproduzierbare Technik, um gleichzeitig die VSMC-Proliferation zu induzieren und die endotheliale Barrierefunktion zu stören.

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Protokoll

Ethik-Statement: Die Protokolle für die Tierhaltung wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Maryland (Protokoll Nr. 0416009) genehmigt und nach AAALAC-International Standards durchgeführt.

1. Chirurgische Vorgehensweise

1. Anästhesietechnik
   1. Sterilisieren Sie alle Instrumente, die in der Überlebenschirurgie verwendet wurden, mit Dampfsterilisation bei 121 ° C für 30 min.
   2. Anästhesie über einen Induktionsbehälter mit 100% O ₂ und 2,5% Isofluran über Präzisionsverdampfer abgeben. Nachinduktion, das Isofluran abbrechen und die Kammer mit O ₂ spülen. Anästhesie mit 1,5-2% Isofluran über Gesichtsmaske und 1 l / min O ₂ durch Inhalation aufbewahren.
   3. Befestigen Sie sowohl die Induktionskammer als auch die Gesichtsmaske an einen Kohlefänger für die Abgasresorption, um das Personal zu schützen. Sorgen Sie für eine adäquate AnästhesieebeneDass es keine Antwort auf schädliche Reize gibt (Zehenknecht).
   4. Erstellen Sie ein operatives Feld, bestehend aus einem chirurgischen Tablett mit isothermen Pad, um thermische Unterstützung während der Operation zu bieten. Eine zusätzliche isotherme Auflage wird eine thermische Unterstützung für Tiere in ihrem Wiederherstellungskäfig bieten.
2. Tiervorbereitung
   1. Führen Sie die folgenden Untersuchungen an 10-12 Wochen alten männlichen C57BL / 6 Mäusen durch.
   2. Entfernen Sie die Haare auf der ventralen Bauchoberfläche des Tieres vom Sternum zum Leistenbereich mit einem Enthaarungsmittel oder einem elektrischen Klipper mit einer Klinge von 40 Ketten.
      1. Im Falle eines Enthaarungsmittels diese Verbindung für 2-3 Minuten in den chirurgischen Bereich geben und dann mit Baumwolle entfernen. Wir verwenden eine handelsübliche Verbindung aus Calciumhydroxid und Natriumhydroxid.
   3. Den Bereich über die Schulter mit 70% Alkohol vorbereiten und Carprofen (5 mg / kg) mit einer 25-Gauge oder einer kleineren Bohrnadel subkutan einspritzen. DiesBehandlung wird postoperative Analgesie für das Tier.
   4. Übertragen Sie das Tier auf das chirurgische Feld und Position in dorsal Recumbency.
   5. Bereiten Sie den chirurgischen Aufstellungsort vor, indem Sie 8-12% providone-Jod mit einem sauberen Baumwollapplikator oder Baumwollgaze schrubben. Dann die Haut zweimal mit 70% Alkohol abspülen.
   6. Legen Sie Augenschmiermittel in beide Augen, um die Häufigkeit der Hornhautentzündung zu reduzieren. Decken Sie die chirurgische Stelle mit einer sterilen Abdeckung.
3. Operative Technik
   1. Machen Sie einen medianen Bauch-Laparotomie-Inzision ca. 2-2,5 cm in der Länge mit einem Skalpell beginnend sofort kaudal der Xiphoid-Prozess und erstreckt sich auf das Becken.
   2. Mobilisieren Sie den Dünndarm und den Duodenum und reflektieren Sie sich seitlich nach rechts. Rollen Sie einen Streifen von sterilen Baumwolle gemeißelt und mit steriler Kochsalzlösung für die Injektion getränkt, um die Verpackung der Eingeweide zu ermöglichen, um die Exposition zu verbessern.
   3. Mit dem Dünndarm mobilisiert auf der rechten Seite derAbdomen, das Retroperitoneum freilegen und die Bauchaorta von der linken Nierenvene zur Aortenbifurkation aussetzen (Abbildung 1 ).
   4. Mit einem sterilen Baumwolltipp-Applikator, liefern 30 aufeinanderfolgende Crushs, jeweils fünf Sekunden in der Dauer.
   5. Entfernen Sie die Verpackung und lassen Sie die Eingeweide in ihre Heimatposition zurückkehren.
   6. Schließen Sie die Blende mit einem 4-0 resorbierbaren Monofilament Naht (Polydioxanon). Die Haut wird mit einem 6-0 nicht resorbierbaren Monofilament Naht (Nylon) geschlossen.
4. Recovery und Post-Procedure Care
   1. Nach dem Eingriff bringen Sie das Tier in einen Regenerationskorb mit sauberen Bettwäsche auf einem isothermen Pad, um die thermische Unterstützung fortzusetzen, bis das Tier normal in der Lage ist, Verlassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es die Fähigkeit zeigt, die Sternal Recumbency zu erhalten.
   2. Überwachen Sie das Tier jede Stunde für die ersten 4 Stunden nach der Operation. Sobald das Tier ist Ambulation normalerweise Rückkehr i T zum zugewiesenen Haushaltraum. Das Tier wird nicht in der Gesellschaft eines anderen Tieres untergebracht werden, bis es sich vollständig erholt hat.
   3. Überwachen Sie das Tier zweimal täglich für die ersten 72 Stunden nach der Operation und mindestens 3 Mal pro Woche danach. Die Überwachung umfasst das Drehen des Tieres dreimal pro Woche.
   4. Carpofen (5 mg / kg) subkutan zweimal täglich für die ersten 72 h nach der Operation verabreichen.

2. Beschaffung von Gewebe

1. Methode der Euthanasie
   1. Euthanisieren der Tiere zu vorgegebenen Zeitpunkten.
   2. Anästhesie über einen Induktionsbehälter mit 100% O ₂ und 2,5% Isofluran über Präzisionsverdampfer abgeben.
      1. Um die Integrität des Endothels zu studieren, verabreichet Evans Blue Farbstoff dem Tier.
         HINWEIS: Evans Blue ist ein negativ geladener Azofarbstoff mit einer hohen Bindungsaffinität für Albumin und kann nur Blutgefäße in Abwesenheit eines intakten Endothels färbenS = "xref"> 6
      2. Für endotheliale Integritätsstudien, zum Zeitpunkt der Euthanasie, perfundieren die Tiere mit 5 ml 0,3% Evans Blue Farbstoff gefolgt von 5 ml PBS bei physiologischem Druck für 5 min. Das Tier wird während des Perfusionsverfahrens in einer chirurgischen Ebene der Anästhesie gehalten.
   3. Nach dem Erreichen einer tiefen Anästhesie-Ebene, öffnen Sie die Brust mit einer Sternotomie. Machen Sie eine Verletzung im rechten Vorhof, um eine Drainage von Blut aus dem Tier zu ermöglichen und auf den linken Ventrikel zuzugreifen, wird mit einer 21 G-Nadel zugegriffen und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) injiziert, bis der Abfluss aus dem rechten Vorhof klar ist.
   4. Nach der Perfusion mit PBS, betreten Sie den Bauch durch einen Mittellinienschnitt.
   5. Wieder einmal mobilisieren Sie den Dünndarm auf die rechte Seite des Bauches, der die infrarenale Aorta aussetzt, scharf die Aorta aus benachbarten Geweben zerlegen und sie von der linken Nierenvene bis zur Aortenbifurkation ausgleichen.
   6. Die ausgeschnittene Aorta in einem 4% Paraformald aufbewahrenEhyde-Lösung, bis die Gewebeverarbeitung auftritt.
      1. Für endotheliale Integritätsstudien öffnen Sie die Aorta in Längsrichtung und stecken Sie sie auf ein Wachsblatt, das die Gesamtheit der Lumenoberfläche aussetzt ⁶ . Führen Sie eine qualitative Beurteilung der endothelialen Integrität durch den Grad der Färbung mit Evans Blue Dye ^{6 durch} .
      2. Für andere histologische Assays, die Aorta quer abschneiden und in optimale Schnitttemperatur (OCT) -Verbindungen einbetten, wie sie durch die zu verwendende histologische Methode bestimmt werden ⁷ .

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Ergebnisse

Transversale Abschnitte Aorta eingebettet in OCT wurden geschnitten, und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt dann Zähler gefärbt mit Verhoeff-Van Gieson (VVG) Fleck, um die interne und externe elastische Lamina identifizieren ⁷ . Crush-Verletzung induzierte Aortenwand Verdickung im Vergleich zu den Aorta von Tieren mit einem Sham-Verfahren behandelt (Laparotomie und Dünndarm Mobilisierung allein). Die Wanddicke, die durch den Abstand von Adventitia zum Lumen be...

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Diskussion

Wir haben die Auswirkungen eines murinen Aortenverletzungsmodells charakterisiert, das zu medialer Hyperplasie und endothelialer Barriere-Dysfunktion führt. Die partielle EC-Ablösung entlang der Aorta intima begleitete den Verlust des Zell-Zell-Kontakts und die Verbesserung der Zellvorsprünge. Entsprechend wurde die endotheliale Barrierefunktion signifikant beeinträchtigt, was die mitogenempfindlichen Signalwege stimulierte, was zur Proliferation von VSMCs und Verdickung der Gefäßwand führte. Die Stärken dieses ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ocular lubricant	Dechra	17033-211-38	Pharmaceutical agents
Isoflurane	VetOne	502017	Pharmaceutical agents
Carprofen	Zoetis	26357	Pharmaceutical agents
Precision vaporizer	Summit Medical	10675	Surgical supplies
Charcoal scavenger	Bickford Inc.	80120	Surgical supplies
Isothermal pad	Harvard Apparatus	50-7053-R	Surgical supplies
Sterile cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-124	Surgical supplies
4-0 absorbable monofilament suture	Ethicon, Inc	J310	Surgical supplies
5-0 non-absorbable monofilament suture	Ethicon,Inc	1666	Surgical supplies
21-gauge x 1 inch needle	BD Biosciences	305165	Surgical supplies
25-gauge x 1 inch  needle	BD Biosciences	305125	Surgical supplies
Dry sterilizer	Cellpoint	7770	Surgical supplies
Fine scissors	Fine Science Tools	14058-09	Surgical instruments
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12	Surgical instruments
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	Surgical instruments
Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge	Fine Science Tools	15000-00	Surgical instruments
Needle driver	Fine Science Tools	91201-13	Surgical instruments
Scalpel handle #4	Fine Science Tools	10004-13	Surgical instruments
Scalpel blades #10	Fine Science Tools	10010-00	Surgical instruments
PBS	Lonza	17-516F	Reagents for tissue processing
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129	Reagents for tissue processing
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagents for tissue processing
Modeling wax	Bego	40001	Reagents for tissue processing
OCT compound	Tissue-Tek Sakura	4583	Reagents for tissue processing
Mayer's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	MHS16	Reagents for immunohistological analysis
Eosin Y solution alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110316	Reagents for immunohistological analysis
Elastin stain kit	Sigma-Aldrich	HT25A	Reagents for immunohistological analysis
Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit	Invitrogen	C10337	Reagents for immunohistological analysis
Anti-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4695	Reagents for immunohistological analysis
Anti-phospho-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4370	Reagents for immunohistological analysis
Anti-p27kip1 antibody	Cell Signaling Technology	3698	Reagents for immunohistological analysis
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	Reagents for immunohistological analysis