JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada in vitro NKX6-1 + pankreas atalarıdır insan embriyonik kök hücreleri ayırt etmek için 4 aşamalı bir protokol açıklar. Bu protokol, insan pluripotent kök hücre hatları çeşitli uygulanabilir.

Özet

Pluripotent kök hücreleri, kendine yenilemek ve bunların çalışma ve diyabet gelecekteki tedavisi için kullanılabilir pankreatik progenitör hücrelerinin üretimi için cazip bir kaynak yapma, birden fazla soy ayırt yeteneğine sahiptir. Bu makale, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) pankreas progenitör hücreleri üretmek için tasarlanmış bir dört aşamalı farklılaşma protokolü özetliyor. Bu protokol, insan pluripotent kök hücre (hPSC) hatları, bir dizi uygulanabilir. pankreatik progenitör hücreleri üretmek için alınan yaklaşım doğru pankreas gelişiminin temel aşamaları modellemek için hESC ayırt etmektir. Bu Aktivin A, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve CHIR990210 mevcudiyetinde hücrelerin kültürlenmesi ile elde edilir kesin endoderm, indüksiyonu ile başlar. Fibroblast Büyüme Faktörü 10 (FGF10) ve Dorsomorphin ile daha fazla farklılaşma ve desenlendirme arka foregut benzeyen hücreler üretir. Retin eklenmesioik asit, noggin, SANT-1 ve FGF10 pankreas endoderm karakteristik hücrelerine arka foregut hücreleri ayırır. Son olarak, epidermal büyüme faktörü (EGF) kombinasyonu, nikotinamid ve Noggin PDX1 + / NKX6-1 + hücreleri etkin bir şekilde oluşmasına sebep olur. Akım sitometri pankreas gelişimin temel aşamalarında spesifik belirteçler ifadesini teyit etmek için yapılır. Evre 4 sonunda PDX1 + / NKX6-1 + pankreas progenitörler bağışıklık yetersizliği olan farelere transplantasyonu sırasında olgun β hücreleri üretme yeteneğine sahiptir ve daha fazla in vitro insülin üreten hücreleri üretmek için ayırt edilebilir. Böylece, PDX1 verimli nesil + / NKX6-1 + pankreas ataları, bu protokolde gösterdiği gibi, bu in vitro insan pankreas gelişimini incelemek için bir platform sağlar olarak büyük önem taşımaktadır ve farklılaşma potansiyeli olan hücre kaynağı sağlar EV olabilir β hücrelerientually diyabet tedavisi için kullanılabilir.

Giriş

Diyabet prevalansı artmakta ve Kanada Diyabet Derneği göre, tip 1 diyabet (T1D) 1 olan bu bireylerin% 5-10 ile, Kanada'da 11 milyon kişi diyabet ya da prediyabetik olduğu tahmin edilmektedir. T1D'nin Langerhans adacıklarında içinde bulunan insülin üreten β hücrelerinin yok neden olduğu bir otoimmün hastalıktır. Şu anda, T1D ile yaşayan bireylerin insülin 2 eksojen kaynakları gerektirir. insülin tedavisi gelişmelere rağmen, T1D hastalarının kan şekeri düzenleyen zor bir zaman var ve hipo ve hiperglisemi hem acı çekmeye devam devam ediyor. Bir tedavi umut verici şekilde, tip 1 diyabetin bölgesindeki normogliseminin in vivo ve in vitro 3 hem β hücreleri üretmek insülin sınırsız kaynağı oluşturmak için kullanılabilecek insan embriyonik kök hücreleri (hESC) kullanılmasıdır geri 4, 5, 6, 7 kadar. HESC Farklılaşan ß-benzeri hücreler mümkün tip 2 diyabet için yeni tedavi hedeflerinin belirlenmesi için izin in vitro diyabet eğitim ve T1D'nin hastalara transplantasyon için hücrelerin sağlamak için yapabiliriz.

In vitro hESC insülin üreten hücrelerin üretilmesi en başarılı girişim pankreas gelişimi 4, 5 sırasında meydana gelen embriyonik olayları özetlemek etmektir. Bu doğru gelişen pankreas kilit aşamaları modellemek için farklı sinyal yollarının manipülasyonu içerir. Pankreas gelişimi CXCR4 ve CD117 (c-kit) 8, 9 sentezlenmesi ile karakterize kesin endoderm, indüksiyonu ile başlar. definit kesin düzenlemeive endoderm organizasyonu daha sonra ön-arka ve ventral-dorsal desenlendirme uğrar bağırsak tüpü, oluşumu için gereklidir. Dorsal ve ventral pankreas tomurcukları pankreas gelişimi 10 için gerekli olan pankreas ve duodenum homeobox geni (Pdx1), ifade arka foregut bölgesinden çıkmaktadır. Dorsal ve ventral tomurcukları sigorta ardından geniş epitel biçimlenme ve genişleme 11 uğrar pankreası oluşturmak için. Endokrin ve ekzokrin soy bağlılık ifade eden multipotent progenitör hücreleri (MPCs) üretimi eşlik eder, diğerlerinin yanı sıra, transkripsiyon Pdx1, Nkx6.1 ve Ptf1a 12, 13 faktörleri. Endokrin ve duktal hücreleri olacak MPCs Ptf1a ifadesini düşürürken Nkx6-1 ifade etmeye devam. Bunun aksine, ekzokrin kökenli hücreler expressio kaybedersinizNkx6-1 N ve Ptf1a ifade 12 korur.

Transkripsiyon faktörü Nkx6-1, özellikle hücre kaynaşmasına karşı endokrin progenitör hücrelerin farklılaşması sırasında, pankreas gelişiminde önemli bir rol oynar. Daha önce pankreas gelişimi 14 sırasında β hücrelerinin bozulmuş oluşumuna Nkx6-1 sonuçları, silme açıklandığı gibi,. Bu nedenle, in vitro ve in vivo olarak ensülin üreten β hücrelerin üretilmesi Nkx6-1 etkin indüksiyon gerektirir.

Biz son zamanlarda verimli hPSCs gelen PDX1 + / NKX6-1 + pankreas atalarıdır üretmek için bir protokol geliştirmiştir. Bu hPSC türetilen pankreas ataları bağışıklık yetersizliği olan farelere 3 transplantasyon sırasında olgun β hücreleri oluşturur. 1) kesin endoderm indüksiyon: farklılaşma protokolü 4 ayrılabilir karakteristik aşamaları2) arka foregut desenleme, 3) pankreas şartname ve 4) NKX6-1 indüksiyon. Burada yönettiği farklılaşma her adımı ayrıntılı bir açıklama sağlar.

Protokol

Çözümler ve Medya 1. Hazırlık

NOT: steril bir ortamda hücre kültürü için tüm medya hazırlayın. Ortam yapılmış ve hemen kullanılmalıdır. Reaktif bilgilerini malzemeler Tablo l'de verilmiştir.

  1. farklılaşma Medya
    1. % 1 glutamin, 2 uM CHIR 99.021, 100 ng / ml Aktivin A, 10 4 M MTG ile RPMI ortamı: Gün 0 Farklılaşma Ortam hazırlayın.
    2. % 1 glutamin, 100 ng / ml Aktivin A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 ug / ml askorbik asit ile RPMI ortamı: Gün 1-2 Farklılaşma ortamı hazırlayın.
    3. % 1 glutamin,% 1 B27, 10 4 M MTG, 0.75 uM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10 ile RPMI ortamı: Gün 3-5 Farklılaşma ortamı hazırlayın.
    4. Gün 6-7 Farklılaşma ortamı hazırlayın: DMEM,% 1 glutamin,% 1 B27, 50 ug / ml askorbik asit, 50 ng / ml FGF10, 0.25 uM SANT-1, 2 uM retinoik asit, 50 ng / ml Noggin ile.
      NOT: RetinoikAsit geçen ortama ilave edilmesi gereken ve ortam oksidatif bozunmasını 15 önlemek için ışıktan korunmalıdır.
    5. Günlük 8-12 Farklılaşma ortamı hazırlayın: DMEM,% 1 glutamin,% 1 B27, 50 ug / ml askorbik asit, 50 ng / ml noggin, 100 ng / ml hEGF, 10 mM nikotinamid.
  2. PBS içinde% 10 FBS, eksi kalsiyum ve magnezyum: FACS tamponu hazırlayın.

2. HESC Farklılaşma

NOT: HESC, çözülmüş geçirildi ve bFGF 16 ile desteklenmiş bir KOSR tabanlı medya varlığında ışınlanmış fare embriyonik fibroblast genişletilir. Hücreler% 80-95 confluency ulaştığında hESC farklılaşma için hazırız. Bu zamanda koloniler tanımlanmış sınırlar ve bir "domelike 'yapısı (Şekil 1A) ile büyük olmalıdır. Tüm hücre kültürü düz tabanlı,% 0.1 jelatin ile kaplanmış doku kültür levhaları muamele gerçekleştirilir. Tipik olarak, hücreler 6 yetiştirilen veyasırası ile, 2 ml veya 1 ml'lik ortam hacminde 12 oyuklu plakalar.

  1. 0. günde, Gün 0 Farklılaşma Medya ile KOSR tabanlı medya değiştirerek farklılaşma başlar.
  2. gün 1 ve 2, yavaşça aspire önce tek tabaka herhangi bir ölü hücreleri çıkarmak için plakayı sallayın. Gün 1-2 Farklılaşma Medya ile değiştirin.
  3. 3 gün, flow sitometri için hasat hücreleri. Hücreler% 90'dan fazla CXCR4 + / CD117 + ifade ederse, 2.4 adıma geçin.
  4. gün 3 ve 5, nazikçe önce aspire için tek tabaka herhangi bir ölü hücreleri çıkarmak için plakayı sallayın. Gün 3-5 Farklılaşma Medya ile değiştirin.
  5. gün 6 ve 7, Gün 6-7 Farklılaşma Medya ile değiştirin.
  6. gün 8, 10 ve 12 üzerinde, Gün 8-12 Farklılaşma Medya ile değiştirin.
  7. günde 13, akış hasat hücreleri sitometri PDX1 ve NKX6-1 ifadesini belirler.

Sitometrisi Analizi 3. Hasat Hücreleri

  1. olan hücreleri ayırmaküreticinin protokolü ve 3 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe e göre 1x ticari tripsin çözeltisi.
  2. 30 ul DNaz I ile 1000 ul FACS Tampon tek hücreleri ticari tripsin çözüm çıkarın ve tekrar süspansiyon
  3. Bir mikrosantrifüj tüp 35 mikron naylon örgü hücre süzgeç ve transfer kullanarak filtre hücreleri.
  4. 5 dakika boyunca 455 xg'de Santrifüj hücreleri. Canlı veya sabit boyama için hücreleri hazırlayın.

Akım Sitometrisi 4. Boyama

  1. Günde 3 canlı boyama hazırlık Akış
    1. 1000 ul FACS Tampon yeniden süspanse hücreleri. Aktarım 200 ul (her ikisi de lekesiz ve lekeli örnekler için), 96 oyuklu bir plaka, iki kuyulara (yaklaşık 1-3 x 10 5 hücre).
    2. 2 dakika süreyle 931 xg'de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı.
    3. APC ve CD117: Primer-konjuge antikor, CXCR4 ile Leke PE 3 için (MALZEMELERİNİN Tablo bakınız)Oda sıcaklığında 0 dak ışıktan korunması.
    4. 2 dakika süreyle 931 xg'de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı.
    5. 100 ul FACS Tampon yeniden süspanse örnekleri.
    6. 2 dakika süreyle 931 xg'de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı.
    7. 1 ml mikro test tüpleri ya da 5 mL'lik yuvarlak dipli bir tüpler 300-500 ul FACS tampon toplam hacimde her bir örnek ve transfer yeniden süspanse edin.
    8. 17 akış sitometresinde Run örnekler. Numuneler hemen çalıştırmak mümkün değilse, 4 ° C'de mağaza ışıktan koruyarak.
  2. Günde 13 sabit boyama hazırlık Akış
    1. 4 ° C'de 24 saat süre ile, ticari sabitleme / permeabilizasyon çözeltisi içinde hücre pelletini.
    2. 5 dakika boyunca 455 xg'de santrifüjleyin. 400 ul Perm / Wash çözeltisi içinde süspanse.
    3. Tw için numune (yaklaşık 0.5-1 x 10 6 hücre) 200 ul aktarın(IgG kontrol ve PDX1 / NKX6-1 boyama için), 96 oyuklu plakanın O kuyu. 2 dakika süreyle 931 xg'de santrifüj.
    4. Anti-PDX1 ve anti-NKX6-1 birincil veya izotop kontrol antikorları ihtiva eden 100 ul Perm / Wash çözeltisi içinde hücre pelletleri yeniden süspanse edin (Malzeme Tablo). 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir.
    5. 2 dakika süreyle 931 xg'de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı. 100 ul Perm / Wash çözeltisi içinde süspanse örnekleri.
    6. 2 dakika süreyle 931 xg'de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı.
    7. ışıktan korunan, 1 saat boyunca, oda sıcaklığında, ikincil antikorlar ihtiva eden 100 ul Perm / Wash örnekleri yeniden süspanse edin.
    8. 2 dakika süreyle 931 xg'de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı.
    9. 100 ul Perm / Yıkama Çözeltisi yeniden süspanse örnekleri.
    10. 2 dakika süreyle 931 xg'de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı.
    11. temsilciadım 4.2.9 ve 4.2.10 yemek.
    12. 1 ml mikro test tüpleri ya da 5 mL'lik yuvarlak dipli bir tüpler 300-500 ul FACS tampon toplam hacimde her bir örnek ve transfer yeniden süspanse edin.
    13. 17 akış sitometresinde Run örnekler. Numuneler hemen çalıştırmak mümkün değilse, 4 ° C'de mağaza ışıktan koruyarak.

Sonuçlar

Şekil 1A şemada gösterildiği gibi pankreas progenitörlerin verimli üretimi, farklılaşma protokolü esnasında özel sinyal molekülleri tam olarak ilave edildikten sonra farklılaşmamış hücrelerin uygun büyüme ve bakım dayanır. 0. günde, farklılaşmamış hücreler% 80-95 konfluent olmalı ve koloniler tanımlanan kenarları (Şekil 1A) sahip olmalıdır. hücre ölümü bu aşamada oldukça yaygındır beri Aşama 1 sırasında, medya ...

Tartışmalar

Başarıyla in vitro hPSCs gelen NKX6-1 + pankreas progenitörlerin üreten pankreatik gelişimi sırasında önemli gelişim aşamaları yöneten belirli bir sinyal yollarının doğru düzenlenmesini kapsayan hPSCs yüksek kalitede kültürleri ve yönlendirilmiş farklılaşma kullanımına dayanır. Daha önce aşağıdaki hususlar yapılmalıdır etkin NKX6-1 üretimi sağlamak için, 3 gösterildiği gibi bu protokol hPSC hatlarının çeşitli çapında NKX6-1 sağlam e...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu yazının Toronto Genel ve Batı Vakfı ve Banting ve En İyi Diyabet Merkezi-Üniversite Sağlık Ağı Lisans Ödülü fon tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Media and cytokines
1-Thioglycerol (MTG)SigmaM6145
Activin AR&D338-AC/CF 
Ascorbic AcidSigmaA4544
B-27 SupplementLife Technologies12587-010 
BD Cytofix/Cytoperm BufferBD Bioscience554722
BD Perm/Wash buffer, 1xBD Bioscience554723
bFGFR&D233-FB
CHIR990210Tocris4423a
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies11995
DNase IVWR80510-412 
DorsomorphinSigmaP5499
EGFR&D236-EG
Fetal Bovine Serum (FBS)Wisent88150
FGF10R&D345-FG
Gelatin from porcine skinSigmaG1890
GlutamineLife Technologies25030
NicotinamideSigmaNO636
NOGGINR&D3344-NG
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15070-063
Retinoic acidSigmaR2625
RPMI Medium 1640Life Technologies11875
SANT-1Tocris1974
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol redLife Technologies12605-010
NameCompanyCatalogue NumberComments
Antibodies for flow cytometry (working dilutions)
CD117 PE (1:100)Life TechnologiesCD11705
CXCR4 APC (1:50)BD  Bioscience551966
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400)Life TechnologiesA-31571
Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.705-546-147
Isotype Control Mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 015-000-003
Isotype Control Goat IgGR&D  AB-108-C
NKX6-1 (1:2,000)DSHBF55A10
PDX1 (1:100)R&DAF2419

Referanslar

  1. Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
  2. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  3. Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  4. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
  5. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
  6. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  7. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  8. Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
  9. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  10. Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
  11. Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
  12. Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
  13. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
  14. Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
  15. Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
  16. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  17. Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
  18. Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 121DiyabetPankreasnsan Embriyonik K k H crelerinsan pluripotent k k h creleriRejeneratif T pPankreas Progenit rlerBeta H creFarkl la maSitometrisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır