Method Article
Bu protokol, bir proteinin filamentli aktinle (F-aktin) birlikte sedimentasyon yeteneğini test etmek için bir yöntem ve bağlanma gözlemlendiğinde etkileşimin afinitesini ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.
Hücrelerin içinde filamentli aktin (F-aktin) organizasyonu, aktin nükleasyonu, büyümesi, çapraz bağlanma ve / veya demontajı kontrol eden çok sayıdaki aktin bağlayıcı proteinler tarafından düzenlenir. Bu protokol, bir protein veya protein alanının F-aktin'e bağlanıp bağlanmadığını belirlemek ve etkileşimin afinitesini ( yani, ayrışma dengesi sabiti) ölçmek için bir tekniği - aktin çöktürme veya topaklama testi - tanımlamaktadır. Bu teknikte, ilgilenilen bir protein önce çözeltide F-aktin ile inkübe edilir. Ardından, aktin filamanlarını tortulaştırmak için diferansiyel santrifüj kullanılmış ve topaklaştınlmış malzeme SDS-PAGE ile analiz edilmiştir. Eğer ilgilenilen protein F-aktini bağlarsa, aktin filamentleri ile birlikte çökecektir. Bağlanma tepkimesinin ( yani F-aktin ve ilgili protein) ürünleri etkileşimin afinitesini belirlemek için nicelleştirilebilir. Aktin peletleme tahlili, belirlenmesi için basit bir tekniktirEğer ilgilenilen bir protein F-aktini bağlar ve ligand bağlanması gibi o proteindeki değişiklikler F-aktin ile olan etkileşimini nasıl etkilediğini değerlendirir.
Aktin, motilite, kasılma, yapışma ve morfoloji gibi çok hücresel süreçlerde kritik bir rol oynayan temel bir sitoskeletal proteintir 1 . Aktin, iki biçimdedir: monomerik globüler aktin (G-aktin) ve polimerize filamentli aktin (F-aktin). Hücreler içinde F-aktin organizasyonu, aktin filamanlarının 2 , 3 , 4 nükleasyonunu, büyümesini, çapraz bağlanmasını ve sökülmesini düzenleyen geniş bir protein koleksiyonu tarafından kontrol edilir. Bununla birlikte, aktin ağı düzenlenmesini düzenleyen çoklu aktin-bağlayıcı proteinlerin nasıl işlediği hala net değildir.
Protein-protein etkileşimlerinin ölçümü, proteinlerin hücresel davranış üzerine etkilerini biyokimyasal düzeyde nasıl uyguladığını anlamada önemli bir yaklaşımdır. Saflaştırılmış proteinler arasındaki etkileşimleri saptamak için birçok farklı tahlil kullanılabilir.Çözünür proteinler için yaygın yaklaşımlar pull-down'lar, fluoresan polarizasyonu, izotermal titrasyon kalorimetresi ve yüzey plazmon rezonansıdır. Önemlisi, bu tahlillerin hepsi, proteinlerin çözünür olmasını gerektirir ve bu nedenle, F-aktin gibi bir polimerik, ipliksi protein ile kullanım için uyarlanmak zordur. Burada, bir protein veya protein alanının F-aktine bağlanıp bağlanmadığını belirlemek ve etkileşimin afinitesini ölçmek için bir teknik - aktin birlikte sedimentasyon veya topaklanma, tahlil tanımlıyoruz.
Aktin peletleme tahlili, bir ultra-santrifüjün yanı sıra özel ekipman gerektirmeyen nispeten basit bir tekniktir. Tüm reaktifler, temel biyokimya bilgilerini varsayarak veya satın alınarak yapılabilir. F-aktin'e bağlandıktan sonra, deney, görünür afiniteyi ( yani, ayrışma dengesi sabiti) ölçmek için kullanılabilir 5 . Ayrıca, bir kez bir afinite kurulduğunda, peletleme deneyi, Ilgi proteinindeki değişikliklerin ( yani , translasyon sonrası modifikasyonlar, mutasyonlar veya ligand bağlanması) F-aktin 6 ile olan etkileşimini nasıl etkilediğini ölçmek için yararlı bir araçtır. Tekniğin araştırmacının deneyi denemeden önce farkında olması gereken kısıtlamaları vardır (bkz. Tartışma ).
1. Malzemeleri hazırlayın
2. Deney için Test Proteinini Hazırlayın
3. F-aktini hazırlayın
4. Pelletleme Deneyi - Temel Protokol
NOT: Bölüm 4'te açıklanan temel protokol, ilgi konusu bir proteinin F-aktin ile birlikte sedimant olup olmadığını belirlemek için kullanılır. F-aktine bağlanma yapıldıktan sonra, bu etkileşimin afinitesi, bölüm 5'de açıklanan protokolü izleyerek ölçülebilir.
5. Peletleme Deneyi - Niceleme
Not: F-aktine spesifik bağlanma gözlemleniyorsa, t nin afinitesini ölçmekO etkileşim. Bu, 4. bölümde özetlenen protokole birkaç değişiklik ve ekleme yaparak gerçekleştirilir. Bağlama analizlerini tasarlamak ve yorumlamak için mükemmel bir kılavuz için bkz. Pollard 10 . Analiz ve miktar tayini için yardım için bir akış şeması ( Şekil 2 ) sağlanmıştır.
Ko-sedimantasyon deneyinde F-aktine karşı αE-katenin homodimer bağlanmasını inceledi. Geçmiş deneyler, F-aktin için αE-katenin homodimerinin afinitesi 1 uM civarında ve Bmax 1 11'e yakın olduğu gösterdiğinden, düşük bir F-aktin konsantrasyonuyla (2 uM'den ziyade 0.2 uM; tartışma). 0.2 uM kritik konsantrasyonun altında olduğu için, tavşan iskelet kasından G-aktin'den polimerize edilmiş F-aktini stabilize etmek için phalloidin ilave edildi (basamak 3.3). Artan konsantrasyonlarda αE-catenin homodimeri (0.125-12.0 uM) 0.2 uM F-aktin varlığında veya yokluğunda inkübe edildi. Numuneler santrifüje tabi tutuldu ve elde edilen pelletler analiz edildi ( Şekil 1A ). Beklendiği gibi, αE-katenin homodimeri, arka planın üstünde F-aktin ile birlikte çökeltildi ( Şekil 1A , F-aktin pelet numunelerinin no-F-ac'ye kıyaslaKalay pellet örnekleri). BSA, negatif bir kontrol olarak çalıştırıldı ( Şekil 1B ). Bağlanan protein nicelendirildi ve etkileşimin afinitesini hesaplamak için serbest protein üzerine çizildi ( Şekil 1C ). Planlanan veriler en iyi Hill denklemine uymaktadır. Hesaplanan K d 2.9 uM, Bmax 0.2 ve Hill katsayısı (h) 4.8 idi. Dolayısıyla, αE-catenin homodimeri F-aktini, önceki çalışmada (~ 1.0 uM'ye karşı 2,9 μM'nin bir Kd'si) tutarlı, düşük bir mikromolar afinite ile birlikte bağlar 11 .
Şekil 1: Yüksek hızlı F-aktin birlikte sedimentasyon testi. ( A ) Artan konsantrasyonlar (0.125-12.0 uM) αE-katenin homodimeri, sol panellerle veya sağ paneller olmadan (sağ paneller), phalloidi ile stabilize edilmiş 0.2 uM F-aktin ile kuluçkaya yatırıldın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi ve santrifüj edildi. Toplam (başlangıç maddesinin% 7.5'i) ve pelet haline getirilmiş malzeme (pellet haline getirilmiş malzemenin% 50'si) SDS-PAGE ile ayrılmış ve Coomassie boyasıyla lekelenmiştir. ( B ) 4 uM BSA negatif bir kontrol olarak çalıştırıldı. (+) Veya (-) F-aktin içeren toplam ve pellet örnekleri, SDS-PAGE ile ayrılmış ve Coomassie boyası ile boyanmıştır. ( C ) A'dan bağlanan αE-katenin (μM / μM aktin) serbest αE-katenin (μM) karşısında çizildi ve veriler bir Hill denklemine (kırmızı çizgi) sığdı. K d , B max ve Hill katsayısı (h) listelenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Aktin peletleme kantifikasyonu - akış şeması. Bu şema, Toplam ve Pelet örnekleri ( A , CE ) ve kantifikasyon için kullanılan standart eğri ( B ) örnekleriyle, bölüm 5'deki önemli adımları özetlemektedir. 5.13 adımlar: 1 ) Toplam örneklerde (A) ilgi protein miktarını ölçün. 2 ) Bant yoğunluğuna karşı protein kütlesi (B) çizerek standart bir eğri oluşturun. 3 ) F-aktin ( C ) ile çöktürülen ilgi protein miktarını ölçün. 4 ) F-aktin ( D ) yokluğunda peletlenen ilgi protein miktarını ölçün. 5 ) F proteinine bağlı protein miktarını belirlemek için C'den D çıkarın. 6 ) Her bir topakta (E) F-aktinin miktarını ölçün, numune başına F-aktinin ortalama miktarını hesaplayın ve her bir örneği ortalama olarak bölün (aşağıdaki sayılar oranı gösterelim). 7 )Her numune için, pelet içindeki farklılıkları ayarlamak için bağlanmış proteinin miktarını (5. adımda hesaplanan) F-aktin pelet oranı ile bölün (6. adımda hesaplanmıştır). 8 ) Her bir numunede normalize edilmiş bağlanmış proteinin miktarını (kütle) hesaplamak için standart eğriyi ( B ) kullanın (basamak 7). 9 ) Bağlayıcı bir eğri yaratmak için serbest protein ve bağlanmış protein konsantrasyonunu belirleyin. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Aktin birlikte sedimantasyon tahlili, bir proteinin F-aktine bağlanıp bağlanmadığını çabucak belirleyebilen basit bir tekniktir. Bazı değişikliklerle teknik, etkileşimin afinitesini ölçmek için de kullanılabilir. Yukarıdaki protokolde ortaya konulan hususlara ek olarak, tahlil tasarlanırken, iletilirken ve yorumlanırken aşağıdaki hususlar dikkate alınmalıdır.
İlgi Proteinleri
Yeni hazırlanmış veya dondurulmuş protein testte kullanılabilir. Dondurulmuş protein kullanılıyorsa, dondurmanın F-aktin bağlanmasını etkilemediğinden emin olmak için sonuçların taze (asla donmamış) protein ile karşılaştırılması önemle tavsiye edilir.
G-aktin Kaynağı
Birçok peletleme deneyinde göreceli bolluk nedeniyle kasdan izole edilen G-aktin kullanılır. Memelilerde - alfa, beta ve gamma - üç ana aktin izotipi vardır ki bunlar dikkat çekici derecede birbirine benzemektedir (>% 90 sekans tanımlamaty). Bununla birlikte, izotipler 12 , 13 arasında işlevsel farklılıklar vardır. Mümkünse, bağlanma tahlilinde kullanılan G-aktin izotipi in vivo izotipe uymalıdır. Örneğin iskelet kasında ifade edilen bir proteini test ederseniz alfa-aktin en iyi seçimdir; Fibroblastlarda eksprese edilen bir proteini incelemek için beta-aktin önerilir.
Phalloidin Kullanımı
Falloidin F-aktini bağladığından, bazı F-aktin bağlayıcı proteinlerin bağlanmasını ( örneğin, faloidin , cofilin bağlamadan aktin filamentlerine blokar) müdahale edebilir veya hatta engelleyebilir. Bu nedenle, phalloidin dikkatle kullanılmalı ve mümkün olduğunca phalloidin ile muamele edilmiş numunelerle karşılaştırılmalıdır.
Yüksek Arka Plan
Proteinlerin F-aktin yokluğunda tortulaşması nadir değildir ( Şekil 1A , hiçbir F-aktin pelet örneğis). Bununla birlikte, arka plan sedimentasyonunun yüksek seviyeleri, gerçek aktin çökelmesini maskeleyebilir ve imkansız olmasa da, bir proteinin F-aktini bağlayıp bağlamadığını veya etkileşimin afinitesini ölçmesini zorlaştırabilir. Polidicanol tepkime tamponuna ekleme (adım 4.1), arka planı önemli ölçüde azaltabilir ve kolay bir çözümdür. Bu, arka planı azaltmazsa, reaksiyon tamponu, tuz konsantrasyonu ve / veya inkübasyon sıcaklığı ayarlanması yardımcı olabilir.
Bağlanma Eğrisi
Bir bağlanma eğrisi üretmek için, bir dizi reaksiyon üzerinde ilgi protein veya F-aktinin konsantrasyonunu değiştirmek gereklidir. Pratikte F-aktini sabit bir konsantrasyonda tutmak ve ilgi protein konsantrasyonunu değiştirmek daha kolay ve tercih edilir. Peletleme deneyinde F-aktinin sabit konsantrasyonda ( örn., 2 uM) tutulması, daha yüksek konsantrasyonlarda F-aktin ile spesifik olmayan yakalama sayısını sınırlar veDüşük (<0.5 uM) F-aktin konsantrasyonlarında depolimerizasyon. Depolimerizasyon, phalloidin kullanılarak önlenebilir, ancak bu, sisteme potansiyel bir komplike edici faktör getirir (bkz. Adım 3.3 ve üstü). F-aktini sabit bir konsantrasyonda muhafaza etmek, numuneler boyunca F-aktin peletini karşılaştırabilir (ve normalleştirir) ve başarısız deneyleri tanımlamayı sağlar ( yani, F-aktin peletinin çok değişken olduğu, konsantrasyonlarda analizi önlediği durumda). Son olarak, F-aktini sabit bir konsantrasyonda tutmak, birinin aktin filamanına bağlanmanın birlikte çalışıp çalışmadığını belirlemesine izin verir ( Şekil 1C ).
Doymuş Bağlama
Bütün bağlanma deneylerinde olduğu gibi, F-aktine bağlanmanın doymuş olması ve protein artı F-aktin platolarının konsantrasyonunun kritik olması önemlidir ( Şekil 1C ). Bir plato olmadan doğru bir ayrışma denge sabitinin hesaplanması mümkün değildir. Böylece,Test edilecek seyreltme serisini dikkatlice planlamak ve her zaman daha yüksek konsantrasyonlarda protein ( yani, beklenen Kd'den en az 5-10 kat daha yüksek) içerdiği önemlidir.
Bağ Analizi
Ölçülen ayrışma sabitlerinin kesin olması için, analiz, ilgi proteinine yönelik olarak F-aktin üzerindeki bağlanma alanlarının konsantrasyonunun afiniteye göre daha düşük olmasına izin veren bir F-aktin konsantrasyonu kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Bu kriterin karşılanıp karşılanmadığını kontrol etmek için bağlama alanlarının B max konsantrasyonunu hesaplayın. Örneğin, eğer [F-aktin] 2 mcM ve B max = 0.5 ise, o zaman [bağlanma bölgeleri] ≈ 1 uM'dir. K d , [bağlanma yerlerinden] en az 5-10 kat daha büyük olmalıdır. Ölçülen Kd, [bağlanma alanları] ile aynı derecede ise, gözlemlenen bağlanma eğrisinin yüksek afiniteli bağlama titrini temsil etmesi mümkündürGerçek bir bağlayıcı izoterm yerine tes. Bu gözlemlenirse, doğru bir afinite ölçmek için tahlil 10 kat daha düşük bir F-aktin konsantrasyonu kullanılarak tekrarlayın. Yüksek afiniteli etkileşimler için afiniteyi doğru bir şekilde ölçmek için düşük bir F-aktin konsantrasyonu elde etmek için phalloidin stabilizasyonu (adım 3.3) gerekli olabilir.
Son olarak, araştırmacıların testi yaparken ve değerlendirirken farkında olmaları gereken birlikte sedimantasyon tahlilinde temel sınırlamalar vardır. En önemlisi, birlikte sedimentasyon tahlili gerçek bir denge sabiti oluşturmaz. Bağlanma ürünleri ( yani, protein artı F-aktin), santrifüj işlemi sırasında reaktanlardan ayrılır ve daha sonra ürünler, yeni bir denge yaratmak için ayrışabilir. Sonuç olarak birlikte çöktürme deneyi, düşük afiniteli etkileşimleri yanlış hesaplayabilir veya algılayamaz. Birçok aktin bağlayıcı proteinin F-aktin için düşük bir ( yani, mikromolar) afiniteye sahip olması nedeniyle, negatif bir sonuçtur ( yani herhangi bir tespit edilebilir bağlanma) bir proteinin F-aktini bağlamadığı anlamına gelmez. Alternatif olarak, TIRF mikroskopi tabanlı, tek filamentli bağlanma deneyleri, bir ayrışma sabitinin belirlenmesinde daha hassas ve daha doğrudur (bu tekniğe yönelik incelemeler için bkz. Referanslar 15,16 ). Bu kısıtlamalara rağmen, peletleme tahlili çoğu araştırmacı tarafından yapılmaktadır ve bir proteinin F-aktine bağlanıp bağlanmadığını belirlemek ve etkileşimin afinitesini ölçmek için etkili bir araçtır.
Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.
Bu çalışma Ulusal Sağlık Grant Enstitüleri tarafından AVK'ya HL127711 tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher Scientific | 46960 | |
S100-AT3 rotor | ThermoFisher Scientific | 45585 | |
Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL | ThermoFisher Scientific | 45233 | |
Actin, rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A8531 | |
Polidicanol (Thesit) | Sigma | 88315 | |
Phalloidin | ThermoFisher Scientific | P3457 | |
Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0862 | |
Adenosine triphosphate (ATP) | Sigma | A2383 | |
Imidazole | Fisher Scientific | O3196 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | M33 | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217 | |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | 3779 | |
Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | ||
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
Colloidal Blue Staining Kit | ThermoFisher Scientific | LC6025 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır