Vivo Aksonal uyarılabilirlik test ile sıçan Ulnar sinirin Elektrofizyolojik ölçüm

Özet

Aksonal uyarılabilirlik teknikleri patofizyolojisi ve geri dönüşü olmayan dejeneratif olayları öncesinde biyofiziksel değişiklikleri incelemek için güçlü bir araç sağlar. Bu el yazması imzalat sıçan ulnar sinir üzerinde bu tekniklerin kullanımı gösterilmiştir.

Özet

Elektrofizyoloji periferik sinir işlevi içinde vivoobjektif değerlendirme sağlar. Kronik akson kaybı ve demiyelinizasyon, sırasıyla tespit genlik ve gecikme süresi gibi geleneksel sinir iletim ölçer. Aksonal uyarılabilirlik tekniklerle ""eşik izleme iyon kanalları, pompalar ve akut işleve ilgilidir ve dejeneratif olaylar koyun değiştiriciler etkinliği ile ilgili bilgi sağlayan tarafından bu ölçümleri genişletin. Bu nedenle, nörolojik hastalıkların hayvan modellerinde aksonal uyarılabilirlik kullanımı roman tedavi müdahaleler değerlendirmek için yararlı vivo içinde ölçü birimi sağlayabilir. Burada fare ulnar sinir motor aksonlar uyarılabilirlik teknikleri birden fazla ölçü için deneysel bir kurulumunu açıklayan.

Hayvanlar isoflurane ile anestezi ve anestezi sürekli ve yeterli derinliği emin olmak için dikkatle izlenir. Vücut ısısı, solunum hızı, kalp hızı ve kandaki oksijen doygunluğu sürekli olarak izlenir. Aksonal uyarılabilirlik çalışmalar ulnar sinir ve forelimb pençe hypothenar kaslarının kaydından perkütan stimülasyon kullanılarak gerçekleştirilir. Doğru elektrot yerleştirme ile uyarıcı yoğunluğu artan ile genlik artırır net bileşik kas aksiyon potansiyeli kaydedilir. Otomatik bir program daha sonra 5 belirli uyarılabilirlik önlemler aşağıdaki sırayla oluşturmak elektrik darbeleri bir dizi sunmak için kullanılmaktadır: uyarıcı yanıt davranışını, gücü süresi zaman sabit, eşik electrotonus, akım-eşik ilişki ve kurtarma döngüsü.

Burada sunulan verileri belirtmek bu önlemlerin tekrarlanabilir ve aynı gün değerlendirirken sol ve sağ ulnar sinir arasında benzerlik göstermektedir. Doz ve zaman anestezi altında etkisi bu ortamda bu tekniklerin bir kısıtlamadır. Dikkatli izlenmesi ve bu değişkenleri kayıt dikkate değer çözümleme zamanında yapılmalıdır.

Giriş

Elektrofizyolojik tekniklerin kullanımı nörolojik bozukluklar periferik sinir fonksiyonu vivo incelenmesi için önemli bir araçtır. Geleneksel sinir iletim yöntemleri supramaximal uyaranlara motor aksiyon potansiyeli genlik ve gecikme süresi kaydetmek için kullanmak. Bu teknikler bu nedenle lifleri yürütülmesi sayısını ve iletim hızı en hızlı liflerinin yararlı bilgiler sağlar. Değerli bir tamamlayıcı araç aksonal uyarılabilirlik test bu. Dolaylı faaliyetin iyon kanalları, enerji bağımlı Pompalar, iyon değiştirme işlemleri ve membran potansiyeli gibi periferik sinirler biyofiziksel özellikleri değerlendirmek için sofistike Elektrofizyolojik stimülasyon desenleri bu tekniği kullanır ¹.

Aksonal uyarılabilirlik test sık klinik ortamda patofizyolojik süreç ve çeşitli sinir hastalıkları tedavi müdahaleler etkilerini araştırmak için kullanılmaktadır. Önemlisi, aksonlar uyarılabilirlik önlemler periferik sinir fonksiyonu intravenöz immünglobulin (IVIG) tedavisi²gibi etkiler tedavi müdahaleler duyarlıdır kemoterapi³ ve kalsinörin inhibitörü (CNI) tedavisi ⁴. her ne kadar bu çalışmalar önemli bilgiler vermişlerdir, klinik çalışmalar kez soruşturma erken hastalık özellikleri ve roman tedavi olanakları⁵engel. Bu nedenle, nörolojik hastalıkların hayvan modellerinde bu yöntemlerin kullanımı son zamanlarda çekiş^6,7,8,9kazanmıştır. Nitekim, bu yöntemleri böylece translasyonel araştırma ilerleyen bu bozuklukları ile ilişkili belirli sinir uyarılabilirlik değişiklikleri anlamak için bir fırsat sağlar.

Burada açıklanan yordamı ulnar sinir kayıt aksonal uyarılabilirlik ölçüsü olduğu gibi fare için basit ve güvenilir bir yöntemdir.

Protokol

Burada açıklanan tüm deneysel yordamlar hayvan bakım ve Etik Komitesi UNSW Sydney ile uyulması ve ulusal sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC) hayvan deneme için Avustralya düzenlemelerin uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. deneysel kurmak

Not: Bu yordamda 12 hafta yaşlı, kadın uzun-Evans fareler kullanıldı.

1. %4 isoflurane ve 1 L min O₂ akış hızı kullanarak bir indüksiyon odası köstebeğiyle anestezi. Yeterli anestezi için iyileştiren refleks sınayarak doğrulayın ve onun yokluğu hayvan indüksiyon odasından çıkarmadan önce emin olun. Not çeşitli anestezik ajanların sinir uyarılabilirlik¹⁰farklı etkileri vardır.
2. Güvenli bir şekilde hayvanın burun burun konisi ek olarak yerleştirin ve başına min O₂ akış hızı % 2.5 isoflurane ve 1 L bir idame dozu teslim.
3. Yeterli anestezi pedal çekilmesi ve kornea refleksleri için hayvanın ayak pinching ve yavaşça onun göz dokunmadan kontrol ederek onaylayın.
   Not: anestezi iken altında kuruluk önlemek için veteriner merhem gözleri, önerilen ancak yordam genellikle hayvan başına 30 dakika sürer gibi temel uygulamasıdır.
4. Bir geribildirim kontrollü Isıtma mat ve rektal termometreyi prob kullanımı ile 37 ° C'de farenin vücut ısısını korumak. Isıtma mat ve entegre vücut sıcaklık sensörü ile 40 ° C ile daha yüksek sıcaklıklarda oluşur herhangi bir cilt hasarı önlemek için ayarlayın.
   Not: Bu bir hayvan fizyolojik izleme sistemi kullanımı ile her 10s monitör ve kayıt fizyolojik önlemler için (kalp hızı, oksijen doygunluğu, vücut ısısı ve solunum hızı) tavsiye edilir. Çevre sıcaklığı çekirdek sıcaklığı¹¹ (şekil 1) soğuk olabilir gibi en iyi kayıt yordamları yerel uzuv sıcaklık ölçümü içermelidir.
5. Antiseptik eldiven giymek ve % 70 etanol ile temizlenmiş aletleri prosedürü boyunca patojen içermeyen bir ortam sağlamak için her zaman kullanın.

2. Elektrofizyolojik kurmak

1. Düşük empedansı Platin electroencephalogram (EEG) iğne elektrotları için bu yordamı kullanın.
2. Hypothenar kas ve referans elektrot 4 haneli dorsal yönünü aracılığıyla kayıt iğne elektrot (şekil 1; içinde belirtilen mor) ekleyerek kayıt iğne elektrotları hazırlayın (şekil 1; içinde belirtilen turuncu) bileşik kas aksiyon potansiyelleri (insert) kaydetmek için.
3. Uyarıcı ve elektrotlar (şekil 1; içinde belirtilen yeşil) kayıt arasında önkol üstün yönü üzerinde deri yoluyla zemin elektrot yerleştirin. Kas dokusu önlemek için elektrotlar eklerken ilgilen.
4. Perkütan uyarıcı iğne elektrot katot (şekil 1; içinde etiketli mavi) ekleyerek hazırlamak yaklaşık 4 mm distal kübital tünel dirsek. Anot (şekil 1; etiketli olarak kırmızı) Ekle yaklaşık 1 cm uzağından axillar bölgesinin deri yoluyla.

Şekil 1: iğne elektrot yerleşim sıçan forelimb olarak bir şematik diyagramı. Katot (mavi) yaklaşık olarak 4 mm dirsek, kübital tünel için distal eklenir ve anot (kırmızı) eklenen yaklaşık 1 cm uzağından axillar bölgesinin deri yoluyla. Zemin iğne elektrot (yeşil) uyarıcı ve elektrotlar kayıt arasında önkol üstün yönü üzerinde deri yoluyla eklenir. (Mor) kayıt ve başvuru (turuncu) iğne elektrotları hypothenar kas ve 4^th haneli dorsal yönünü aracılığıyla eklenir. Sıcaklık probu (gri) tenar kas üstün yönü üzerinde yer alıyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. aksonal uyarılabilirlik yordamları

1. Kemirgen motor sinir yarı otomatik TRONDNF iletişim kuralı'nı gerçekleştirmek, bilgisayar kontrollü aksonal uyarılabilirlik programı sürekli geçerli uyarıcı ve bir amplifikatör (malzemeleri tablo görmek) bağlı. 50/60 Hz gürültü giderici kullanarak aşırı 50 Hz elektrik gürültü çıkarmak.
   1. Aynı anda CMAP Morfoloji görselleştirme ve bir 1'i uyguladıktan CMAP hypothenar kas üzerinden kayıt ms kare dalga darbe katot iğne elektrot ile ulnar sinir.
      1. En uygun kayıtları elde etmek, bir en iyi bifazik yanıt eğrisi sürekli genlik ile bu kadar dikkatle açı ve/veya katot konumunu ayarlamak (şekil 2A.) elde. Bir kez en iyi konum belirlendikten sonra bir repositionable elektrot tutucu katotlu stabilize etmek.
         Not: otomatik olarak kullanılan yazılım aşağıda açıklanan test uyaranlara sunar ve artırır veya azaltır mevcut eşik ulaşmak için gerekli.
   2. Artımlı olarak bir 1 uyarıcı yoğunluğunu artırarak bir uyarıcı-tepki eğrisi kayıt 1 ms itki en büyük bir yanıt elde kadar anne.
      Not: Mor ve yeşil satır şekil 2B ve 2C, uyarıcı yoğunluğu ve otomatik sistem artımlı artış sırasıyla temsil eder. Hedef genlik eşiği izleme için uyarıcı-tepki eğrisi en dik yamaçta alanına karşılık gelen maksimal genlik % 40'ını ayarlanmıştır. 'Eşik' değişikliği (yani % 40 temin için gerekli uyarıcı CMAP) çeşitli tarafından indüklenen test uyaranlara protokol geri kalanı elde edilen değişken olduğunu.
   3. Eşik electrotonus (TE), dahil olmak üzere birden çok aksonal uyarılabilirlik parametreleri kayıt geçerli-eşik (ı / V) ilişki ve kurtarma döngüsü (başvurusunda açıklandığı gibi RC)¹².
      Not: Bilgisayar kontrollü aksonal uyarılabilirlik programı ve denetim eşiği ±40% %20 geçerli ayarlanan eşik (TE) ile 100 ms depolarize ve akımları hyperpolarizing subthreshold değerlendiriyor. Eşik depolarize hem hyperpolarizing akımları sonra değişikliği otomatik olarak 14 saat noktalarda 100 ms geçerli polarize ve 12 puan sırasında geçerli polarize sonra kaydedilir. Eşik electrotonus dolaylı olarak internodal conductances değerlendiriyor ve membran potansiyeli belirtecidir. I / V ilişki yoğunluğu + 50 üzerinden alternatif 200 ms subthreshold Klima akımları ile değerlendirildi % -100% 10 %'luk oranlarla denetim eşiği. Ben / V ilişki farklı TE'ye akımları cinsinden süresi daha uzun olduğunu, polarizasyon yoğunluğunu kademeli 50 farklı olan % -100% ve eşik Değiştir her yoğunlukta 1 değerlendirildi geçerli polarize kesildiği tarih vardır sonra ms. I / V ilişki axon¹işletmeye özelliklerini görmemizi sağlar. Belirli aralıklarla 2.5 ms 200 Bayan bu parametre nodal içinde meydana gelen olayları iyi tanımlanmış bir dizi testler için bir dizi test uyaranlara tarafından takip bir ilk supramaximal Klima uyarıcı uygulandığı bir çifte darbe paradigma ile belgili tanımlık RC değerlendirildi supramaximal uyarım takip axon bölgesi. Bu olaylar, bir sonraki yanıt temin daha zor hale getirir ve refractoriness ve göreli Refrakter dönem ¹tarafından sayısal inactivation voltaj Na⁺ kanal içerir. Bu şarj bir düğümler arası ve artan uyarılabilirlik hızlı potasyum kanalları, superexcitability tarafından sayısal tarafından aracılı bir süre takip eder. Son olarak, yavaş yavaş aktive potasyum kanalları azaltılmış uyarılabilirlik, subexcitability sayılabilir bir geç dönem aracılık.

Resim 2: bir aksonal uyarılabilirlik denemedir ham verileri Masası'A abiphasic CMAP yanıt eğrisi sonra ulnar sinir stimülasyonu artımlı artış gösterir. Panelleri B ve C uyarıcı yoğunluğu (mA) ve genliği CMAP (mV), sırasıyla temsil eder. B ve C yeşil bileşenin uyarıcı yoğunluğu artan otomatik azalma ve izleme eşik için gerekli CMAP ilişkili sigmoid şekilli düşüş gösteriyor.

4. mesaj Elektrofizyoloji yordamları

1. Sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar sıçan için ayrı bir kafes aktarın. Tam anesteziden kurtarıldı kadar bir hayvan ve diğer hayvanların şirkette katılımsız bırakmayın. Fare tamamen anesteziden kurtarıldı sonra geri orijinal onun kafes aktarın.
2. Çalışma bitiminde, fareyi bir barbitürat (örneğin lethabarb) hayvan, örneğin öldürücü mayi enjeksiyon için acısız ötenazi.

Sonuçlar

Sıçan ulnar sinirin Elektrofizyolojik önlemleri mevcut protokolü ile elde edilmiştir. Şekil 3 12 hafta-yaşlı kadın uzun Evans fare sol ulnar sinir kayıt bir temsilcisi gösterir. Bileşik kas aksiyon potansiyeli aynı anda aktif lifler iletken sayısı ile ilgilidir. Supramaximal en yüksek yanıt (mV) (şekil 3A) ne zaman orada olan herhangi bir değişiklik (2B rakam) yanıt olana uyaran ...

Tartışmalar

Basit ve güvenilir, açıklanan yordamı gösterir minimal invaziv tekniği bu biyofiziksel özellikleri değerlendirilmesi ve akson membran potansiyeli kısa bir süre içinde sağlar. Sinir pozlama gerektiren diğer daha invaziv teknikleri ile karşılaştırıldığında aksonal uyarılabilirlik test mevcut yöntem böylece fizyolojik şartlarda, korur vivo içinde değerlendirme etkinleştirme minimal doku hasarı neden olmaktadır sinir ilgi ve tekrarlanan ölçülerini sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
QTracS Program	Digitimer Ltd.		Axonal excitability program
AM-Systems 2200, Analog Stimulus Isolator, 2200V/50Hz	SDR Scientific	850005	Stimulator
High Performance AC Amplifier Model LP511	Grass Technologies		Amplifier
Humbug 50/60Hz Noise eliminator	Quest Scientific Instruments	726310	Noise eliminator
Low Impedance Platinum Monopolar Subdermal Needle Electrodes	Grass Technologies	F-E2-24	Recording electrodes, 10 mm length, 30 gauge
Low Impedance Platinum Electroencephalography Needle Electrodes	Cephalon	9013L0702	Stimulating electrodes, 10 mm length, 30 gauge
Multifunction I/O Device Model USB-6341	National Instruments		Multifunction input/output device
Iron Base Plate IP	Narishige Scientific Instrument Laboratory		Used for holding stimulating needle electrode in place
Rotating X-block X-4	Narishige Scientific Instrument Laboratory		Used for holding stimulating needle electrode in place
Magnetic Stand GJ-8	Narishige Scientific Instrument Laboratory		Used for holding stimulating needle electrode in place
Micromanipulator M-3333	Narishige Scientific Instrument Laboratory		Used for holding stimulating needle electrode in place