Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

Özet

Bu çalışmada cep işgali ve geçiş analizi için iki farklı yöntem raporları: Boyden odası tahlil ve vitro video mikroskobu tabanlı yara iyileşmesi tahlil. Bu iki deney protokollerde açıklanmış ve kendi yararları ve dezavantajları karşılaştırılır.

Özet

Tümör hücreleri istila ve geçiş yeteneklerini kanser ilerlemesi ve yineleme için ana katkı kaynağı sağlamaktadır. Birçok çalışma nasıl kanser hücrelerinin yaymak yeni tedavi stratejileri geliştirmek amacı ile anlamak için geçiş ve işgal yeteneklerini incelemiş bulunuyoruz. Bu yeteneklerin hücresel ve moleküler temeli analizi hücre hareketlilik karakterizasyonu ve fizikokimyasal özellikleri sitoiskeleti ve hücresel microenvironment yol açmıştır. Uzun yıllar boyunca, Boyden odası tahlil ve sıfırdan yara tahlil cep işgali ve geçiş eğitim için standart teknikleri olmuştur. Ancak, bu iki teknik kısıtlamalar bulunmaktadır. Boyden odası tahlil zor ve zaman alıcı ve düşük tekrarlanabilirlik sıfırdan yara tahlil vardır. Mikroskobu, özellikle de modern teknolojilerin geliştirilmesini sıfırdan yara tahlil tekrarlanabilirlik artmıştır. Güçlü analiz sistemleri kullanarak, bir "içinde-kuluçka" video mikroskobu hücre göç ve işgal otomatik ve gerçek zamanlı analiz sağlamak için kullanılabilir. Amacı bu kağıt, rapor ve hücre işgali ve geçiş eğitim için kullanılan iki deneyleri karşılaştırın etmektir: Boyden odası tahlil ve bir en iyi duruma getirilmiş vitro video mikroskop esaslı çizik tahlil yara.

Giriş

Cep işgali ve geçiş direnci tedavi¹ ana nedeni kanser hücrelerinin, yayılması yer alırlar ve lokal veya metastatik yineleme sonra kanser tedavi²yol açabilir. Mezenkimal epitel geçiş (EMT) hücre Invasion-geçiş hangi kanser hücreleri bir epitel Mezenkimal bir fenotip geçiş ilk işlemidir. E-Cadherin epitel fenotip³hücre dışı bir işaretleyicidir ve artan N-cadherin ve vimentin Mezenkimal fenotip⁴karakteristik ifadesidir. Geçiş de matris metalloproteases⁵eylem yoluyla iç kapasite kanser hücrelerinin temel hücre dışı Matriks (ECM) işgal bağlıdır.

Bu istila-geçiş mekanizması kanser birçok yerlerde, özellikle baş ve boyun kanser⁶' için tanımlanmıştır. Pek çok araştırmacı nasıl bu bilgi için yeni tedavi stratejileri götürecek umuduyla kanser hücrelerinin yaymak daha iyi anlamak için göç ve işgal işlemleri üzerinde odaklanmıştır. Bu çalışmalar güvenilir ve tekrarlanabilir deneyleri kullanarak gerçekleştirilen çok önemlidir.

Hücre hareketliliği vitro analizine zor olabilir. Uzun yıllar önce geliştirilen, Boyden odası tahlil Invasion-geçiş analiz⁷için standart olarak kabul edilir. Ancak, zaman alıcı ve sık sık yanlıştır. İkinci bir test bir hücre monolayer kültürü üzerinde bir çizik bile yapma ve esir alma imge cep işgali ve göç sabit zaman aralıklarında içerir yara iyileşmesi tahlil⁸' dir. Bu teknik yaygın olarak iki ardışık test sonuçları arasında büyük farklılıklar nedeniyle eleştirildi. Ancak, mikroskopi, özellikle de modern teknolojilerin uygulama sıfırdan yara tahlil tekrarlanabilirlik geliştirdi. Video mikroskoplar kolayca İnkübatörler içinde tanıttı olabilir ve hücre göç gerçek zamanlı görüntü oluşturabilirsiniz. Bu cihazlar mikroskobik verileri kaydetmek ve zaman içinde yara hücre izdiham otomatik olarak analiz sağlar. Bu kağıt Boyden odası tahlil ve en iyi duruma getirilmiş sıfırdan yara tahlil tarif ve avantajları ve her yaklaşımın zayıf yönlerini tartışmak için amaçtır.

Protokol

Not: ECM dahil olmadan Boyden odası ve çizik deneyleri için geçiş tahlil olarak adlandırılır ve ECM ile aynı deneyleri işgali tahlil olarak adlandırılır.

1. Boyden odası tahlil

Not: Bu protokolü tekrarlayan bir baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu (HNSCC) gırtlak kanseri türetilir ve John elde edildi SQ20B hücre satırı için adapte Little (Boston, MA, USA).

Gün 1

1. Tohum hücre
   1. Tohum 2 10⁶ SQ20B 175 cm² şişeye bir gün önce 72 h 12 mL kültür orta (CM) hücreleri ve hücrelerin % 80 hücre izdiham için büyümeye izin.
      1. CM SQ20B hücreler için hazırlamak için Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) % 10 fetal buzağı serum (FCS), 0,04 mg/mL hidrokortizon, 100 U/mL penisilin ve 0,1 g/L streptomisin ile ek.
   2. Laminar akış başlık altında hücreleri trypsinize. Orta kaldırmak, steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) hücrelerle yıkama ve tripsin ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (0,5 g/L) 2.5 mL ekleyin. 37 ° C'de 5 min için hücreleri kuluçkaya ve reaksiyon 37 ° C'ye ısındı cm 12.5 mL ekleyerek durdurun Bir hücre sayaç kullanarak hücreleri saydırmak.
   3. 25 cm² şişesi 6 10⁵ hücre değerlendirilecek her koşul için bir hücre yoğunluğu, hücrelerde tohum. 24 h cm 3 ml için hücreleri kuluçkaya.

2. gün

2. Hücre açlık ve kaplı odaları hazırlanması
   1. Hücreleri her şişeyi ortamda ile 3 mL %0,1 sığır serum albumin (BSA) kullanarak düşük fetal sığır serum (FBS) orta yerine FBS değiştirerek açlıktan. Kuluçka 24 h için hücreleri açlıktan.
      1. Açlık CM (s-CM) hazırlamak için DMEM % 0.1 BSA, 0,04 mg/mL hidrokortizon, 100 U/mL penisilin ve 0,1 g/L streptomisin ek.
   2. Geçiş tahlil için 1.3 adıma geçin.
   3. İstila tahlil, günde 3, önce 12 h için kaplamalı her odasına s-cm 500 μL ekleyerek kaplı Boyden odaları hazır olun. Ticari olarak hazırlanan kuşe Boyden Chambers'ı kullanın ve onları kullanmadan önce 4 ° C'de tutun. Her Boyden Oda arkadaşı tabağına yerleştirin ve 37 ° C'de kuluçka gecede ayarlayın.

3. gün

3. Boyden odasında tohum hücre
   1. Eşlik eden plaka chemoattractant hazırlamak için kullanın. Her doldurmak tam orta %10 FBS, 0,04 mg/mL hidrokortizon, 100 U/mL penisilin ve 0,1 g/L streptomisin 750 μL 24-iyi arkadaşı plakalı, iyi.
      1. Chemoattractant her hücre satır ve her tedavi koşul için uyum. Chemoattractant CM (ca-CM) hazırlamak için DMEM % 10 FCS, 0.4 mg/mL hidrokortizon, 100 U/mL penisilin ve 0,1 g/L streptomisin ek.
   2. Üst odası kabarcıklar önlemek için dikkat çekici doldurulmuş arkadaşı kalenin aktarın.
   3. İstila tahlil için dikkatli bir şekilde her Boyden odasından cm 450 μL çıkarın.
   4. Laminar akış başlık altında hücreleri trypsinize. Orta kaldırmak, steril PBS hücrelerle yıkama tripsin EDTA (0.5 g/L) 0.5 mL ekleyin ve sonra hücreleri 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya 37 ° C'ye ısındı CM ekleyerek reaksiyonu durdurmak Bir hücre sayaç kullanarak hücreleri saydırmak.
   5. Tohum 3 10⁴ SQ20B % 0.1 BSA orta, 6 10⁴ hücre/mL nihai bir seyreltme veren 500 μL hücrelerde.
      Not: Hücre konsantrasyonu her hücre satırı için adapte edilmelidir.
   6. Plaka 37 ° C'de kuluçka makinesi 24 h için yerleştirin.

4. gün

4. Hücre fiksasyon ve boyama
   1. Önce katlama zaman o hücre satırıyla belirli hücreleri tamir. 24 saat önce SQ20B hücreleri tamir.
   2. Her ekleme arkadaşı plaka çıkarın ve hücreleri bir pamuklu çubukla kullanarak üst odasından dikkatli bir şekilde çıkarın. Üst bölmede bulunan tüm hücreleri kaldırmak özellikle önemlidir.
   3. Düzeltme ve leke Mayıs-Grunwald Giemsa renklendirme⁹ sağlanan boyama seti kullanarak elde etmek için tek tek ekleyin. Alternatif olarak, % 4 paraformaldehyde 30 dk fiksasyon için başka bir arkadaşı tabak içinde kullanın.
   4. Ekler bir boş 24-iyi arkadaşı plaka her odası kuruması için bir laboratuvar başlık altında tutun.

Gün 5

5. Mikroskopik analiz
   1. Eşlik eden plaka ekler 20 faz kontrast mikroskop üzerine yerleştirin ve geçirilen her hücre zarının alt kısmında say. Amaç aşağıdan yukarı hareket ettirerek doğru odak konumunu en iyi duruma getirme ve pozisyon membran alt kısmı durdurun.
   2. Geçirilen hücrelerin sayıları ve numaralı seribaşı hücreleri arasındaki oran hesaplamak. Her sayısı nüsha her tedavi koşul için yineleyin.

2. çizik tahlil yara: Hücre göç

Not: Talimatları hücre türüne göre adapte olmalıdır.

Gün 1

1. Tohum hücre
   1. Tohum 2 x 10⁶ SQ20B 175 cm² şişeye bir gün önce 72 h cm 12 ml hücreleri ve hücrelerin % 80 hücre izdiham için büyümeye izin.
   2. Laminar akış başlık altında hücreleri trypsinize. Orta kaldırmak, steril PBS hücrelerle yıkama tripsin EDTA (0.5 g/L) 2.5 mL ekleyin ve 37 ° C'de 5 min için hücreleri kuluçkaya 37 ° C'ye ısındı cm 12.5 mL ekleyerek reaksiyonu durdurmak Bir hücre sayaç kullanarak hücreleri saydırmak.
   3. Prediluted bir örneği 4 x 10⁵/mL, hücre yoğunluğu ' 4 10⁴ hücre başına 100 μL her şey son bir yoğunluk vererek oluşturmak. Bu konsantrasyon her hücre satırı için adapte olmalı ve 1 x 10⁴ 6 10⁴ hücre aralığında olmalıdır.
   4. 2.1.2. adımda hazırlanan solüsyona yatırma 100 μL tarafından bir 96-şey plaka her kuyuya tohum hücreleri.
   5. Hücreler eşit olarak kuyu dibinde dağıtmak 5 min için oda sıcaklığında plaka bırakın.
   6. Plaka da kuluçka yerleştirin ve 12-16 (en fazla) h 37 ° C'de plaka uygun hücrelere sağlar

2. gün

2. Yara tahlil kaşı
   1. Adım 2.1 kuluçka makinesi'hazırlanan tabak çıkarın.
   2. Başlık altında üreticinin protokolüne göre ticari yaralama aygıtı kullanarak bir yara olun.
   3. Hemen orta her şey bir pipet yara dokunmamaya dikkat çekici bir adapte konik ucuyla kullanarak kaldırın.
   4. Hücreleri aspirasyon yinelenen ve her şey için 37 ° c sıcak cm 100 μL kullanarak tarafından iki kez yıkayın.
   5. Bir pipet adapte bir konik ucuyla sonra çamaşır adımları kullanarak CM kaldırın.
   6. Orta her tedavi koşul için belirli 100 μL her şey için ekleyin.
   7. Wells için yapılan herhangi bir kabarcık oluşturma önlemek için deneyin. Bir ters pipetting teknik burada yararlı olabilir. Alternatif olarak, bir şırınga iğnesi kabarcıklar kaldırın.
   8. Plaka video mikroskobu adapte raf yerleştirin.
   9. Görüntü kalitesini artırmak için en az 15 dk önce plaka alt tarafındaki yoğunlaşmayı önlemek için ilk inceden inceye gözden geçirmek için sıcak plaka izin.
   10. Zamanlamayı iyi başına bir görüntü, video mikroskop bilgisayar yazılımı kullanarak tarama programı. En çok 2-h Aralık işgali-geçiş deney için gereklidir. Denemenin amacı bir video üretmek için ise 30 dk maksimum aralığını tercih edilir.
   11. Deney sonunda, yaralama aygıt dikkatle yıkama ve her üretici tarafından belirtilen dört çamaşır adımları izleyin.

Gün 3, 4 ve 5

3. Video mikroskop kullanarak geçiş analizi
   1. En az 24 h ve 5 gün, izlemek ve hücre göç denetleyin.
   2. Her hücre türü için uyarlanmış bir uygun cep maskesi hücre göç çözümlemek için kullanın. Her hücre satırı için uyarlanmış bir cep maskesi elde etmek için bir hücre belirli hücre resim koleksiyonu kullanarak yazılım tanımından işleme oluşturmak.
   3. Eğrileri izleme ve veri analiz ve sonuçları karşılaştırmak için kullanılan bir elektronik tabloya ver.

3. çizik tahlil yara: Hücre Invasion

Not: Talimatları hücre türüne göre adapte olmalıdır.

Gün 1

1. Tohum hücre
   1. 2.1. adımda açıklandığı gibi hücre tohum için aynı iletişim kuralını kullanın.

2. gün

2. ECM hazırlanıyor
   1. Matris için en az 12 h 4 ° C'de kullanmadan önce defrost Hiçbir toplamları görünür olduğundan emin olun. Toplamları görünür durumdaysa, matrix 4 ° C'de kadar agrega ortadan daha uzun süre tutmak. Matris buz üzerinde tutun. Precooled pipet ipuçlarını kullanın.
      Not: Matrix kuvvetlendirmek değil Eğer 4 ° C'de muhafaza
   2. 5 min için buz üzerine microcentrifuge boruları chill.
   3. CM 4 ° C-buzdolabından soğutmalı ve 300 μg/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için precooled microcentrifuge tüpler matrisinde oranında seyreltin.
   4. Buzdolabı 4 ° C'de prediluted matris microcentrifuge tüplerini dönmek
      Not: microcentrifuge tüpler için uyarlanmış bir soğutma rafa deneme boyunca 4 ° C'de tüpler korumak için yardımcı olur.

2. gün

3. Yara tahlil ve ECM tedavisinde kazı kazan
   1. Adım 3.1 kuluçka makinesi'hazırlanan tabak çıkarın.
   2. Başlık altında üreticinin protokolüne göre ticari yaralama aygıtı kullanarak yara olun.
   3. Hemen orta her şey bir pipet yara dokunmamaya dikkat çekici bir adapte konik ucuyla kullanarak kaldırın.
   4. Hücreleri aspirasyon yordamı yinelenen ve 37 ° C'ye ısındı cm 100 μL kullanarak tarafından iki kez yıkamak
   5. İkinci yıkama sonra plaka 5 min için sıcaklık equilibrate için 4 ° C kuluçka makinesi yerleştirin.
   6. Her şey dikkatle kenarından pipet ve yara dokunmaktan kaçının için dikkat çekici bir konik uç ile aspirasyon pipet ile soğuk orta kaldırın.
   7. 4 ° C'de precooled konik ipuçlarını kullanarak her şey 50 μL prediluted matris ekleyin
   8. 37 ° C'de kuluçka 30 dk için plaka yerleştirin.
      Not: Bir prewarmed destek raf 37 ° C'de ve 96-şey levha ısınma hızlandırmak yararlıdır.
   9. Plaka da kuluçka kaldırın ve her tedavi koşul için belirtildiği gibi her şey için adapte cm 100 μL ekleyin.
   10. Wells için yapılan herhangi bir kabarcık oluşturma önlemek için deneyin. Bir ters pipetting teknik burada yararlı olabilir. Alternatif olarak, bir şırınga iğnesi kabarcıklar kaldırın.
   11. Plaka video mikroskobu adapte rafa yerleştirin.
   12. Görüntü kalitesini artırmak için en az 15 dk önce plaka alt tarafındaki yoğunlaşmayı önlemek için ilk inceden inceye gözden geçirmek için sıcak plaka izin.
   13. Taramalar, kuyuda sıfırdan yara tarama modunu başına bir görüntü, video mikroskop bilgisayar yazılımı kullanarak zamanlama programı. En çok 2-h Aralık içinde bir istila-geçiş deney için gerekli. Denemenin amacı bir video üretmek için ise 30 dk maksimum aralığını tercih edilir.
   14. Deney sonunda, yaralama aygıt dikkatle yıkama ve her üretici tarafından belirtilen dört çamaşır adımları izleyin.

Gün 3, 4 ve 5

4. Video bir mikroskop kullanarak cep işgali analizi.
   1. 2.3 arasındaki adımları yineleyin.

Sonuçlar

Biz burada hücre işgali ve geçiş analiz etmek için iki farklı yöntem raporu. Şekil 1 Boyden odası deneyi gösterir. Ekler chemoattractant orta ile bir arkadaşı tabak içine yerleştirilir ve hücreleri CM tohumlari. Membran kaplamasız olabilir (geçiş tahlil) veya (Invasion tahlil) kaplı. Hücre s-cm üst odasına numaralı seribaşı. Alt odası CM ile bir chemoattractant girilir. Hücreleri önce katlama zaman sabittir.

Tartışmalar

Biz burada iki farklı yöntemler cep işgali ve geçiş işlemi çalışma raporu Bu süreç analizi bir subpopulation kanser kök hücreleri^10,11adı verilen kanser hücrelerinin artan hareketliliği tarafından açıkladı metastatik yineleme katılan faktörler anlamak için önemlidir.

Boyden odası deneyi biridir en sık kullanılan teknikler keşfetmek için hücre işgali ve geçiş. Bu yaklaşımın bir avantajı, tekrarlanabi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	-
Wound Maker	Essen Bioscience	4494	Store in safe and dry place
96-well ImageLock Plate	Essen Bioscience	4379
CoolBox 96F System with CoolSink 96F	Essen Bioscience	1500-0078-A00
CoolBox with M30 System	Essen Bioscience	1500-0078-A00
Boyden Insert	Dominique Dutcher	353097
Boyden Coated Insert	Dominique Dutcher	354483	Store at -20 °C
Companion 24-well Plate	Dominique Dutcher	353504
BD Matrigel standard	BD BioScience	BD 354234	Store at -20°C.
RAL 555 Staining Kit	RAL Diagnostics	361550	Store in safe and dry place
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	33511