Bewertung der Zelle Invasion und Migration-Prozess: ein Vergleich des Video Mikroskop-basierte Kratzers Wunde Assay und der Boyden Kammer-Test

Zusammenfassung

Diese Studie berichtet zwei verschiedene Methoden für die Analyse der Zelle Invasion und Migration: Boyden Kammer Assay und der in-vitro- video Mikroskop-basierte Wundheilung Assay. Die Protokolle für diese zwei Experimente werden beschrieben und ihre Vorteile und Nachteile gegenüber.

Zusammenfassung

Die Invasion und Migration Fähigkeiten von Tumorzellen sind Hauptursachen für Krebs Fortschreiten und Wiederkehr. Viele Studien haben untersucht, die Migration und Invasion Fähigkeiten zu verstehen, wie Krebszellen zu verbreiten, mit dem Ziel neue Behandlungsstrategien zu entwickeln. Analyse der zellulären und molekularen Grundlagen dieser Fähigkeiten führte zu der Charakterisierung der Zelle Mobilität und die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Zytoskeletts und zelluläre Mikroumgebung. Seit vielen Jahren haben der Boyden Kammer Assay und der Kratzer Wunde Assay die Standardtechniken Zellinvasion und Migration zu studieren. Beide Techniken haben jedoch Einschränkungen. Boyden Kammer Assay ist schwierig und zeitaufwendig, und Kratzer Wunde Assay hat niedrige Reproduzierbarkeit. Entwicklung moderner Technologien, vor allem in der Mikroskopie ist die Reproduzierbarkeit des Scratch Wunde Assays gestiegen. Verwenden leistungsstarke Analyse-Systeme, ein "Inkubator" Videomikroskop lässt sich automatisch und in Echtzeit Analyse der Zelle Migration und Invasion. Das Ziel dieses Papiers ist, zu berichten und vergleichen die beiden Assays verwendet, um Zelle Invasion und Migration zu untersuchen: Boyden Kammer Assay und eine optimierte in-vitro- video Mikroskop-basierte Scratch Wunde Assay.

Einleitung

Zellinvasion und Migration sind die Verbreitung von Krebszellen, die die Hauptursache der Widerstand gegen die Behandlung¹ ist beteiligt und können zu locoregionaler oder metastasierten Rezidiv nach Krebs Behandlung²führen. Die epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) ist der erste Prozess der Invasion-Zellwanderung in welcher Krebs Zellen mesenchymalen Phänotyp aus einer epithelialen wechseln. E-Cadherin ist eine extrazelluläre Marker der epithelialen Phänotyps³und erhöhte Expression von N-Cadherin und Vimentin ist charakteristisch für die mesenchymalen Phänotyp⁴. Migration hängt auch von der Fähigkeit von Krebszellen, die extrazelluläre Matrix (ECM) zu erobern durch das Wirken des Matrix-Metalloproteasen-⁵.

Diese Invasion – Migration-Mechanismus wurde für Krebs an vielen Orten, vor allem im Kopf-Hals-Krebs-⁶beschrieben. Viele Forscher konzentrierten sich auf die Migration und Invasion Prozesse besser zu verstehen, wie Krebszellen in der Hoffnung zu verbreiten, die dieses Wissen zu neuen Behandlungsstrategien führen wird. Es ist wichtig, dass diese Studien mit zuverlässige und reproduzierbare Tests durchgeführt werden.

In-vitro- Analyse der Zelle Motilität kann schwierig sein. Vor vielen Jahren entwickelte der Boyden Kammer-Test gilt der Standard für Invasion – Migration Analyse⁷. Aber es kostet Zeit und ist oft ungenau. Ein zweiter Test ist die Wundheilung Assay⁸, beinhaltet einen Kratzer auf einer Zellkultur Monolage und Aufnahmen der Zelle Invasion und Migration in festen Zeitabständen. Diese Technik ist weithin wegen der großen Schwankungen zwischen den Ergebnissen von zwei aufeinanderfolgenden Tests kritisiert worden. Allerdings hat die Anwendung moderner Technologien, vor allem in der Mikroskopie, die Reproduzierbarkeit des Scratch Wunde Tests verbessert. Video-Mikroskope können leicht in Inkubatoren eingeführt werden und können in Echtzeit Bilder von Zellwanderung erzeugen. Diese Geräte zeichnen mikroskopische Daten und bieten automatische Analyse der Wunde Zelle Zusammenfluss im Laufe der Zeit. Das Ziel dieses Papiers ist Boyden Kammer Assay und optimierte Scratch Wunde Assay zu beschreiben und um die Vorteile und Schwächen der einzelnen Ansätze zu diskutieren.

Protokoll

Hinweis: Die Boyden Kammer und Scratch-Assays ohne Einbeziehung des ECM werden als des Migration-Tests bezeichnet, und die gleichen Tests mit der ECM nennt man die Invasion-Assay.

(1) Boyden Kammer Assay

Hinweis: Dieses Protokoll eignet sich für die SQ20B-Zell-Linie, die ergibt sich aus einer wiederkehrenden Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür (lokal) Kehlkopfkrebs und wurde von John erhalten wenig (Boston, MA, USA).

Tag1

1. Zelle, die Aussaat
   1. Samen 2 10⁶ SQ20B Zellen in 12 mL Kulturmedium (CM) in einem 175 cm² Kolben 72 h vor dem ersten Tag und die Zellen bis zu 80 % Zelle Zusammenfluss wachsen lassen.
      1. Um CM SQ20B Zellen vorzubereiten, ergänzen Sie Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 0,04 mg/mL Hydrocortison, 100 U/mL Penicillin und Streptomycin 0,1 g/L.
   2. Unter einem Laminar-Flow-Haube trypsinize der Zellen. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), und 2,5 mL Trypsin Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (0,5 g/L). Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° C und beenden Sie dann die Reaktion durch Zugabe von 12,5 mL CM auf 37 ° c erwärmt Die Anzahl der Zellen, die Zelle Zähler.
   3. Samen der Zellen in einem 25 cm² Kolben in einer Zelle Dichte von 6 10⁵ Zellen für jede Bedingung ausgewertet werden. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h in 3 mL CM.

Tag2

2. Zelle verhungern und Vorbereitung der beschichteten Kammern
   1. Verhungern Sie die Zellen, indem Sie das Medium in jedem Kolben mit 3 mL niedrig-fötalen Rinderserum (FBS) Medium mit 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) anstelle von FBS. Verhungern Sie die Zellen für 24 h in den Inkubator.
      1. Ergänzen Sie um Hunger CM (s-CM) vorbereiten, DMEM mit 0,1 % BSA, 0,04 mg/mL Hydrocortison, 100 U/mL Penicillin und Streptomycin 0,1 g/L.
   2. Gehen Sie für die Migration-Assay zu Schritt 1.3.
   3. Für die Invasion-Assay bereiten 12 h vor Tag 3, die beschichteten Boyden-Kammern durch Zugabe von 500 μl von s-CM zu jeder beschichteten Kammer. Kommerziell hergestellte beschichtete Boyden Kammern zu verwenden und bei 4 ° C vor dem Gebrauch aufbewahren. Legen Sie jede Boyden Kammer in die Begleiter-Platte und legen Sie es über Nacht im Brutschrank bei 37 ° C.

Tag3

3. Zelle in der Boyden Kammer Aussaat
   1. Verwenden Sie die Begleiter-Platte, um die Lockstoffgradient vorzubereiten. Füllen Sie jeweils auch der 24-Well Begleiter Platte mit 750 μl des kompletten Medium mit 10 % FBS, 0,04 mg/mL Hydrocortison 100 U/mL Penicillin und Streptomycin 0,1 g/L.
      1. Passen Sie die Lockstoffgradient für jede Zelllinie und jede Behandlung Bedingung. Zur Vorbereitung der Lockstoffgradient CM (ca-CM) ergänzen Sie DMEM mit 10 % FCS, 0,4 mg/mL Hydrocortison, 100 U/mL Penicillin und Streptomycin 0,1 g/L.
   2. Übertragen Sie die obere Kammer in die vorgefüllten Begleiter-Platte, kümmert sich um Luftblasen zu vermeiden.
   3. Entfernen Sie für die Invasion-Assay vorsichtig 450 μL cm von jeder Boyden Kammer.
   4. Unter einem Laminar-Flow-Haube trypsinize der Zellen. Entfernen Sie das Medium, die Zellen mit sterilen PBS waschen, 0,5 mL Trypsin EDTA (0,5 g/L) zugeben und dann die Zellen für 5 min bei 37 ° c inkubieren Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von CM auf 37 ° c erwärmt Die Anzahl der Zellen, die Zelle Zähler.
   5. 3 10⁴ SQ20B Samenzellen in 500 μl von 0,1 % BSA Medium, geben eine Endverdünnung von 6 10⁴ Zellen/mL.
      Hinweis: Die Zellkonzentration sollte für jede Zelllinie angepasst werden.
   6. Legen Sie die Platte in den Brutschrank bei 37 ° C für 24 h.

Tag 4

4. Zelle Fixierung und Färbung
   1. Befestigen Sie die Zellen vor der Verdopplungszeit spezifisch für die Zell-Linie. SQ20B Zellen vor 24 h zu beheben.
   2. Entfernen Sie jeder Einsatz von der Begleiter Platte und entfernen Sie vorsichtig die Zellen aus der oberen Kammer mit einem Wattestäbchen. Es ist besonders wichtig, alle Zellen in der oberen Kammer zu entfernen.
   3. Fix und Fleck legen Sie individuell, um May-Grünwald-Giemsa Färbung⁹ mit dem Färbung Kit zur Verfügung gestellt zu bekommen. Alternativ können Sie 4 % Paraformaldehyd in einem anderen Begleiter Platte für 30 min fixieren.
   4. Halten Sie die Einsätze in eine leere 24 wohlen Begleiter Platte unter eine Haube Labor jede Kammer trocken.

Tag 5

5. Mikroskopische Analyse
   1. Legen Sie die Begleiter-Platte mit den Einsätzen auf dem 20 Phasenkontrast-Mikroskop und zählen Sie jedes migrierte Zelle im unteren Teil der Membran. Optimieren Sie die richtige Fokuslage zu, indem das Ziel bewegt sich von unten nach oben aus, bis die Position auf dem Unterteil der Membran.
   2. Berechnen Sie das Verhältnis zwischen der Zahl der migrierten Zellen und Zellen ausgesät. Jede Wiederholungsanzahl für jede Behandlung Bedingung in dreifacher Ausfertigung.

(2) neu gewickelt Assay: Zellwanderung

Hinweis: Anweisungen müssen für jede Art von Zelle angepasst werden.

Tag1

1. Zelle, die Aussaat
   1. Samen 2 x 10⁶ SQ20B Zellen in 12 mL CM in einem 175 cm² Kolben 72 h vor dem ersten Tag und die Zellen bis zu 80 % Zelle Zusammenfluss wachsen lassen.
   2. Unter einem Laminar-Flow-Haube trypsinize der Zellen. Entfernen Sie das Medium, die Zellen mit sterilen PBS waschen, 2,5 mL Trypsin EDTA (0,5 g/L) zugeben und die Zellen für 5 min bei 37 ° c inkubieren Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 12,5 mL CM auf 37 ° c erwärmt Die Anzahl der Zellen, die Zelle Zähler.
   3. Erzeugen Sie eine vorverdünnten Probe in einer Zelle Dichte von 4 x 10⁵/mL, eine endgültige Dichte von 4-10⁴ Zellen pro 100 μL in jede Vertiefung geben. Diese Konzentration sollte muss für jede Zelllinie angepasst werden und im Bereich von 1 x 10⁴ bis 6 10⁴ LiPo-Zellen.
   4. Samenzellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte durch Hinterlegung 100 μl der Lösung im Schritt 2.1.2 vorbereitet.
   5. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 5 min um die Zellen auf dem Boden der Näpfchen gleichmäßig zu verteilen.
   6. Die Platte in den Brutkasten und erlauben Sie die Zellen zur Einhaltung der Platte für 12 bis 16 h (maximal) bei 37 ° C.

Tag2

2. Kratzen der Wunde assay
   1. Entfernen Sie die Platten in Schritt 2.1 aus dem Inkubator vorbereitet.
   2. Machen Sie unter der Haube eine Wunde mit dem kommerziellen verletzte Gerät laut Protokoll des Herstellers.
   3. Sofort entfernen Sie das Medium aus jeder gut mit einer Pipette mit einer angepassten konische Spitze, kümmert sich um die Wunde nicht berühren.
   4. Waschen Sie die Zellen zweimal durch die Aspiration zu wiederholen und mit 100 μL von CM auf 37 ° C für jedes gut erwärmt.
   5. Entfernen Sie die CM mit einer Pipette mit einer angepassten konische Spitze nach der Waschschritte.
   6. Jedes gut 100 μL des Mediums, die spezifisch für jede Behandlung Bedingung hinzufügen.
   7. Versuchen Sie zu vermeiden, Luftblasen in den Brunnen. Eine umgekehrte Pipettieren Technik kann hier hilfreich sein. Alternativ entfernen Sie Luftblasen mit einer Spritzennadel.
   8. Legen Sie die Platte in die angepasst Rack mit dem Videomikroskop.
   9. Um die Bildqualität zu verbessern, lassen Sie die Platte zu warm für mindestens 15 Minuten vor dem ersten Scan zur Vermeidung von Kondensation auf der Unterseite der Platte.
   10. Programmieren Sie den Zeitplan für die Scans mit dem Videomikroskop-Software auf einem Bild pro Bohrloch. Ein maximales 2-h-Intervall ist erforderlich für eine Invasion-Migration-Experiment. Wenn das Ziel des Experiments ist es, ein Video zu produzieren, ist ein Intervall von 30 Minuten maximale bevorzugt.
   11. Am Ende des Experiments waschen Sie das verletzte Gerät sorgfältig und folgen Sie jeweils vier Waschschritte, die vom Hersteller angegebenen.

Tag 3, 4 und 5

3. Analyse der Migration das video Mikroskop
   1. Überwachen Sie für ein Minimum von 24 h und bis zu 5 Tage und überprüfen Sie die Zellwanderung.
   2. Verwenden Sie eine entsprechende Zelle Maske angepasst für jeden Zelltyp Zellwanderung zu analysieren. Um eine Zelle Maske angepasst für jede Zelllinie zu erhalten, erzeugen Sie eine Zelle Verarbeitung Definition aus der Software über eine bestimmte Zelle Bildersammlung.
   3. Verfolgen Sie die Kurven und exportieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation, die verwendet werden kann, zu analysieren und vergleichen Sie die Ergebnisse.

3. neu gewickelt Assay: Zellinvasion

Hinweis: Anweisungen müssen für jede Art von Zelle angepasst werden.

Tag1

1. Zelle, die Aussaat
   1. Verwenden Sie das gleiche Protokoll für die Zelle Aussaat, wie unter Punkt 2.1 beschrieben.

Tag2

2. Vorbereitung der ECM
   1. Tauen Sie die Matrix für mindestens 12 Stunden vor Gebrauch bei 4 ° C. Stellen Sie sicher, dass keine Aggregate sichtbar sind. Wenn Aggregate sichtbar sind, halten Sie die Matrix bei 4 ° C über einen längeren Zeitraum, bis die Aggregate verschwinden. Halten Sie die Matrix auf Eis. Verwenden Sie vorgekühlt Pipettenspitzen.
      Hinweis: Die Matrix verfestigen wird wenn nicht bei 4 ° c aufbewahrt
   2. Kühlen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen für 5 min auf Eis.
   3. CM auf 4 ° C gekühlt aus dem Kühlschrank und verdünnen Sie die Matrix in die vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen, eine Endkonzentration von 300 μg/mL zu erhalten.
   4. Rückkehr der Mikrozentrifugenröhrchen mit vorverdünnten Matrix wieder in den Kühlschrank bei 4 ° c
      Hinweis: Eine Rack-Kühlung für Mikrozentrifugenröhrchen angepasst ist hilfreich für die Aufrechterhaltung der Rohre bei 4° C während des Experiments.

Tag2

3. Scratch Wunde Assay und Behandlung des ECM
   1. Entfernen Sie die in Schritt 3.1 aus dem Inkubator vorbereitet.
   2. Machen Sie unter der Haube die Wunde mit dem kommerziellen verletzte Gerät laut Protokoll des Herstellers.
   3. Sofort entfernen Sie das Medium aus jeder gut mit einer Pipette mit einer angepassten konische Spitze kümmert sich um die Wunde nicht berühren.
   4. Waschen Sie die Zellen zweimal durch die Aspiration zu wiederholen und mit 100 μL von CM auf 37 ° c erwärmt
   5. Legen Sie nach dem zweiten waschen die Platte auf 4 ° C Inkubator, seine Temperatur für 5 min equilibrate.
   6. Entfernen Sie das kalte Medium aus jedem Brunnen mit der Pipette Absaugen mit einer kegelförmigen Spitze, kümmert sich um pipette vorsichtig vom Rand und zu vermeiden, berühren die Wunde.
   7. Jedes gut vorgekühlt konischen Spitzen bei 4 ° c mit fügen Sie 50 μL vorverdünnten Matrix hinzu
   8. Legen Sie die Platte im Inkubator bei 37 ° C für 30 Minuten.
      Hinweis: Eine vorgewärmte Unterstützung Rack bei 37 ° C ist hilfreich, um die Erwärmung der 96-Well-Platte zu beschleunigen.
   9. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie 100 μL des angepassten CM in jede Vertiefung für jede Behandlung Bedingung angegebenen hinzu.
   10. Versuchen Sie zu vermeiden, Luftblasen in den Brunnen. Eine umgekehrte Pipettieren Technik kann hier hilfreich sein. Alternativ entfernen Sie Luftblasen mit einer Spritzennadel.
   11. Legen Sie die Platte in das angepasste Rack im video Mikroskop.
   12. Um die Bildqualität zu verbessern, lassen Sie die Platte zu warm für mindestens 15 Minuten vor dem ersten Scan zur Vermeidung von Kondensation auf der Unterseite der Platte.
   13. Programmieren Sie den Zeitplan für die Scans mit dem Videomikroskop-Software auf einem Bild pro Bohrloch im Scratch gewickelt-Scan-Modus. Ein maximale 2-h-Intervall in erforderlich für eine Invasion-Migration-Experiment. Wenn das Ziel des Experiments ist es, ein Video zu produzieren, ist ein Intervall von 30 Minuten maximale bevorzugt.
   14. Am Ende des Experiments waschen Sie das verletzte Gerät sorgfältig und folgen Sie jeweils vier Waschschritte, die vom Hersteller angegebenen.

Tag 3, 4 und 5

4. Analyse der Zellinvasion unter Verwendung eines video-Mikroskops.
   1. Wiederholen Sie Schritt 2.3.

Ergebnisse

Wir berichten hier zwei verschiedene Methoden zur Analyse von Zellinvasion und Migration. Abbildung 1 zeigt die Boyden Kammer Experiment. Die Einsätze werden in eine Begleiter-Platte mit Lockstoffgradient Medium, und die Zellen sind in CM ausgesät. Die Membran kann unbeschichtet (Migration Assay) oder beschichtet (Invasion Assay). Zellen sind in der oberen Kammer in s-CM ausgesät. Die untere Kammer ist gefüllt mit CM als eine Lockstoffgradient. Die Zellen...

Diskussion

Wir berichten hier zwei verschiedene Modalitäten Zellprozess Invasion und Migration zu studieren. Die Analyse dieses Prozesses ist wichtig für das Verständnis der Faktoren bei metastasierendem Wiederholung, die durch erhöhte Motilität der eine Subpopulation von Krebszellen, die sogenannten Krebs-Stammzellen^10,11erklärt werden könnte.

Boyden Kammer Experiment ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken, erkunden Zell-Invasi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	-
Wound Maker	Essen Bioscience	4494	Store in safe and dry place
96-well ImageLock Plate	Essen Bioscience	4379
CoolBox 96F System with CoolSink 96F	Essen Bioscience	1500-0078-A00
CoolBox with M30 System	Essen Bioscience	1500-0078-A00
Boyden Insert	Dominique Dutcher	353097
Boyden Coated Insert	Dominique Dutcher	354483	Store at -20 °C
Companion 24-well Plate	Dominique Dutcher	353504
BD Matrigel standard	BD BioScience	BD 354234	Store at -20°C.
RAL 555 Staining Kit	RAL Diagnostics	361550	Store in safe and dry place
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	33511