Roman Vitro hücre göç değerlendirmek için şifa tahlil yara

Özet

Burada, peptidler etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu yöntemi Nicel veri hücre göç ve yara kapatma hızı üzerinde hızlı ve son derece tekrarlanabilir elde olanak sağlar.

Özet

Bu çalışmanın amacı, antimikrobiyal peptidler (Amper), hücre göç teşvik etmek gibi bazı immunomodulatory molekülleri yeteneği değerlendirmek için yeni bir yöntem göstermektir. Önemlisi, hücre geçiş bütünlüğü ve doku katmanları normal fonksiyonu yaralanma sonra yeniden kurmak için yara iyileşme sürecinde bir hızı sınırlaması olayı değil. Bu yöntemin avantajı üzerinden el ile yapılan bir çizik içinde bir hücre monolayer dayanır, klasik tahlil özel silikon kültür kullanımı iyi tanımlanmış genişlik (500 mikron ile bir boş hücre sözde yara alan oluşturmak için sağlayan iki bölmeleri ekler olduğunu ). Buna ek olarak, bir otomatik görüntü analiz platformu nedeniyle hızla yaranın kapanması ve hücre geçiş hızı üzerinde nicel verileri elde etmek mümkündür. Daha doğrusu, iki kurbağa-cilt amper etkisi bronş epitel hücrelerinin geçiş-ecek var olmak göstermek. Ayrıca, ön bu hücrelerin belirli inhibitörleri ile bu tür olayların altında yatan moleküler mekanizmaları üzerinde bilgi sağlar.

Giriş

Büyük ölçüde hayvanlarda yara iyileşmesi bütünlüğü ve doku katmanları normal fonksiyonu yaralanma¹sonra yeniden kurmak için temel bir süreç olduğu bilinmektedir. Epitel yüzeyleri dış ortama (Örneğin, deri, solunum sistemi ve gastrointestinal yolları) maruz rağmen fiziksel ve kimyasal hakaret üzerinden koruyucu bir bariyer oluşturmak, yara oluşumu kolayca, özellikle sonra oluşabilir cerrahi veya mikrobiyal enfeksiyonlar². Örnek olarak, akciğer dokusu tarafından Kistik fibrozis (CF) olanlar, özellikle de fırsatçı bakteriyel pathogen Pseudomonas aeruginosa, kolonizasyon sonucu solunum yetmezliği^{3airways epitel, zarar yol açar, 4}. Yara iyileşmesi bir yaralı doku⁵normal mimarisini geri yüklemek için bir karmaşık ana bilgisayar onarım mekanizmadır. Epithelialization, anjiogenez ve kolajen üretimini ve hücre farklılaşması^{6,7,8 ile doku remodeling kapsayan bir yenilenme dönemi ardından ilk inflamasyon ile karakterizedir} . Epitel bütünlüğünü güvenceye almak için ve mikrobiyal nükleer silahların yayılmasına karşı denetlemek için tüm canlıların savunma molekülleri, antimikrobiyal peptidler (Amper)^9,10dahil üretmek. İşlem şifa yara vitro hücre artıkları ve farklı hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimler eksikliği nedeniyle benzetimini yapmak çok zordur. Ancak, uyararak sözde bir yara kapatma hızlandırmak için bir peptid vitro yeteneğini epitel hücrelerinin geçiş güvenliği aşılan bir epitel iyileşmek için onun yetenek gösterge. Gerçekten de, hücre göç yara iyileşmesinde hızı sınırlaması olay ve hücre geçiş etkileyen faktörler eğitim geliştirilmiş yara iyileşmesi için hedef tedaviler için yardımcı olacaktır.

Burada, bir çok tekrarlanabilir deneysel tahlil hücre göç içinde vitrodeğerlendirmek için özel silikon kültür ekler göre sağlanır. Konfluent hücre monolayer üzerinde 500 mikron boşluk (sözde yara) oluşturulması dayanmaktadır. Hücreler yapay "yaralı" alanının kenarındaki boş hücre alanına geçiş, yeni hücre-hücre kişiler şekillendirme başlar. Kültür Ekle hızlı yara deneyler şifa için yeni bir araç temsil eder. 500 mikron duvar tarafından ayrılmış iki rezervuarlar sağlanır ve düzgün bir 3 cm tabak tabak içine veya iyi bir 12-şey plaka yerleştirilebilir. Her Bölmesi ekleme bir hücre süspansiyon ile doldurma hücreleri ekleme kaldırma yaklaşık 500 mikron (ayrılık duvar aynı genişlikte) bir temiz boş hücre boşluk doğurmak iken izdiham kadar belirlenmiş her alanda büyümeye sağlar. Bir uygun hücre kültür testi karışımla takıma orta sonra amacına eklenebilir plaka/iyi. Daha sonra boşluğu kapatma ters bir mikroskop, tercihen bir resim alma için bir video kamera ile donatılmış altında farklı zaman aralıklarında görüntülenir. Son olarak, ölçüm değişiklikleri web tabanlı otomatik görüntü analiz programı tarafından cep kaplı alanda yaranın kapanması ve hücre geçiş hızını miktar sağlayacaktır. Genel olarak, bu yöntem klasik tahlil, burada bir çizik bile el ile steril bir iğne ile Konfluent hücre monolayers incising tarafından yapılır veya bir pipet ipucu¹¹ile ilgili bir adım olur. Nitekim, son işlem plastik alt yemeğin yok edebilir plaka/iyi ve kırışıklıkları oluşturma yüzey kaplama. Buna ek olarak, bu son derece iğne/ipucu için araştırmacılar tarafından uygulanan basınç bağlı olarak "yaralı" alan iyi tanımlanmış genişlik boşluğu, tüm uzunluğu boyunca sahip değil. Ayrıca, yerinden çıkar hücreleri çizik kenarları canlı ve ölü hücreleri kümeleri oluşturabilir; Ayrıca, canlı hücreler "yaralı" alanının Yayilim sigara tekrarlanabilir sonuçlar¹²üreten hücre geçiş hızı ile etkileyebilir.

Ayrıca, sıfırdan görüntü analiz platformu sayesinde kullanıcılar hızla (dakika içinde) ek yazılım edinme gerekliliği olmadan Seçili hücrelerin göç davranışı üzerinde Nicel veri alabilir. Bu platform faz kontrast mikroskobu görüntülerini düşük (~ 5 X), orta (~ 10 X) ve yüksek (~ 20 X) büyütme analiz yeteneğine sahiptir. Görüntülerin (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff biçimi) bir zip dosyası yükledikten sonra analiz otomatik olarak alan hücre örtülü ve Karalama alanı yüzdesini, hem de hücre hızını gösteren bir Özet dosyası oluşturmak için yapılır göç, farklı zaman aralıklarında.

Bu çalışmada, bir kurbağa-cilt AMP-Türev, Yani Esc(1-21) ve onun diastereomer Esc(1-21) - 1 c¹³ve fonksiyonel CF transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR)^14,15ifade bir bronş hücre satırı kullanarak, peptid indüklenen hücre göç tedavi edilmemiş (kontrol) örnekleri ile karşılaştırıldığında bir örnek sağlanmıştır. Hava yolu epitel ve CFTR akciğer fonksiyonu korumada önemli bir rol oynamak unutmayın ve onarım¹⁶yara. Ayrıca, selektif inhibitörü (Örneğin, AG1478)¹⁷ epidermal büyüme faktörü reseptör (EGFR) aracılığıyla, geçiş bronş hücre tarafından yukarıda belirtilen peptidler indüklenen kanıt EGFR^{12aktivasyonu içerir, 18} bildirilir.

Özet olarak, bu yordam nasıl böyle silikon kültür ekler kullanımı doğru göç yapışık hücreleri (Örneğin, bronş epitel hücreleri) ve moleküler belirlemek için hızlı ve kolayca erişilebilen bir tahlil temsil ettiğini göstermek için hedeftir Bu tür olayları kontrol mekanizmaları.

Protokol

1. hücre hazırlık

1. Tohum 2.5x10⁶ hücre 10 ml, en az gerekli orta (2 mM glutamin (MEMg), ile desteklenmiş MEM) % 10 fetal sığır serum (FBS), antibiyotik (penisilin ve streptomisin 0.1 mg/mL) ve puromisindir (0,5 µg/mL seçimi ve bakımı için hücre satırı) bir T75 şişesi içinde. 37 ° C ve % 5 CO₂ şişeye 2 gün kuluçkaya. Deneme başlamadan önce kesiştiği yerde ters bir mikroskop altında hücre kontrol.
   Not: deneme için kullanılan ölümsüzleştirdi insan bronş epitel hücreleri puromisindir direnci veriyor lentiviral bir vektör ile transduced hücrelerdir. Stabil bir işlevsel CFTR^14,15hızlı.
2. Hücre izdiham 90-%100 ulaşmıştır sonra şişeye ortamından Aspire edin ve biyolojik güvenlik kabin sınıfı II altında bir atık şişe içine atın. 6 mL tamponlanmış fosfat hücrelerle serum kalsiyum ve magnezyum (CMF-PBS) yıkayın. Yavaşça şişeye el ile kaya ve CMF-PBS atın.
   Not: pipet ile hücre monolayer dokunmamaya dikkat et.
3. CMF-PBS 10 mL ekleyin ve 10 dk 37 ° C ve % 5 CO₂ şişeye kuluçkaya.
4. CMF-PBS Aspire edin ve o atın. Sonra tripsin/EDTA 2 mL şişe için ekleyin.
5. Yavaşça tamamen hücreleri ceket ve hücreleri gözle görülür bir mikroskop altında müstakil kadar 10 dk 37 ° C ve % 5 CO₂ şişeye kuluçkaya çözüm sağlayan şişesi, rock.
   Not: kuluçka süresi sonunda, yuvarlak ve değil bağlı plastik yüzey hücreleri görünmelidir. Hücreleri de müstakil değilseniz, manuel ajitasyon gerekli olabilir.
6. MEMg artı % 10 10 mL ekleyin FBS tripsin devre dışı bırakın ve şişeye alt yıkayarak hücreleri toplamak için. Birimin bir konik 50 mL tüp içine aktarın.
7. Tüp 80 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi.
8. Süpernatant Aspire edin ve MEMg artı % 10 6 mL hücrelerde yeniden askıya FBS. Tekrar tekrar herhangi bir kümeleri kadar kırmaya pipet.
9. Bir micropipette ile hücre süspansiyon 10 µL çıkar ve birimin kapak daha önce Burker veya Neubauer odası üzerinde koymak cam altında enjekte.
10. Hücre sayısı.

2. hücre kültüründe tohum ekler

1. 12-şey plaka her kuyuya, kültür Ekle steril cımbızla (şekil 1) aktarın. Plaka yüzeyine düzeltmek için ekler kenarları boyunca basın için cımbız kullanın.
   Not: Yapışma sağlar bir yapışkan alt ekler var.

Resim 1 : Düzgün bir 12-şey plaka kuyu koymak silikon kültür ekler, şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. Düzgün hücre süspansiyon MEMg artı % 10 oranında seyreltin FBS. Her Bölmesi ekleme hücre süspansiyon (yaklaşık 3.5x10⁴ hücreleri/odası), 70 µL ile doldurun.
   Not: Her kompartımanda uygulanan hücre yoğunluğu hücre türüne göre değişir. Bu izdiham 24 h içinde tamamlamak için yol açar bir hücre yoğunluğu kullanmak için tavsiye edilir.
3. Mikroskop altında Hücre Ekle bölmeleri sızıntı değil ve 37 ° C ve % 5 CO₂24 h 12-şey plaka kuluçkaya kontrol edin.

3. sözde yara iyileşme tahlil

1. Kuluçka sonra hücreleri Konfluent hücre monolayers oluşmuş doğrulamak için ters mikroskop altında görselleştirin.
2. Test bileşikler (Örneğin, amper) 1 mL MEMg yeniden askıya alma.
   Not:-20 ° C'de depolanan stok çözüm başlayarak taze amper dilutions hazırlamak
3. Yavaşça ekler tarafından steril cımbız kaldırmak. Hücre monolayers kırmamaya dikkat et. Ekler emici kağıt üzerine aktarın.
   Not: aynı ekler yeniden kullanmak için onlara en az 3 h için % 70 etanol içinde sterilize. Bu daha sonra çöpe önerilir.
4. Yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için iyi bir micropipette kullanarak başına MEMg 1 mL ekleyin. Plaka kapatın ve yavaşça salla.
   Not: Orta kendi kesintileri önlemek için doğrudan hücre monolayers üstüne eklemeyin.
5. Orta Aspire edin ve MEMg 1 mL de başı ile değiştirin. Plaka kapatın ve bir video kamera ile donatılmış 4 X büyütme, ters mikroskop altında (ekler tarafından oluşturulan) boş hücre boşlukları görselleştirmek. Görüntüleri (T0) zaman sıfır ve bir .jpg biçiminde kaydedebilirsiniz.
6. Orta kuyulardan kaldırmak, PBS ile 1 mL yıkar ve o atın.
7. (3.2 noktada hazır) test bileşikler wells için ekleyin. Tedavi edilmemiş kontrol örnekleri için MEMg 1 mL ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO₂plaka kuluçkaya.
8. 15, 20 ve 24 h tedavi sonra 4 X büyütme, mikroskop altında hücre göç gözlemlemek ve görüntüleri.
   Not: Bu adım sırasında esir alma imge T0 gelince aynı alanlarda çalışın. Hangi imge esir alma zaman aralıkları seçim hücre geçiş hızına bağlıdır.
9. Bazı seçmeli inhibitörleri, Yani AG1478, hücre göç, etkisini incelemek için ekler kaldırmadan önce her INSERT bölmesi ortamından Aspire edin.
   1. Her bölmesi taze MEMg ile yıkayın ve MEMg AG1478 ile desteklenmiş 70 µL ile doldurun.
   2. 3.3 noktasından açıklandığı gibi kuluçka 37 ° C ve %5 CO₂30 dk sonra devam.
      Not: çamaşır adım ve hücre monolayers belirli inhibitörleri ile ön sırasında ekler kaldırmak değil dikkatli olun.

4. görüntü analizi

1. Üzerinde ikmal-in deneme, görüntüleri çeşitli deneysel grupları en iyi temsil eden örnekleri seçin ve T0, T15, T20 ve T24 h tek görüntüleri içeren bir ZIP dosyası oluşturun.
   Not: Tek görüntüleri tüm örnekleri için seçilen zaman aralıklarında alınır. Triplicates en az üç kez tekrarlanan her deneme için çalıştırın. Sonunda, tüm deneysel grupları, en az 3 fotoğraf ("a", "b", "c", her bağımsız deneyden türetme vb,) için her zaman noktası analiz edilir.
2. Belgili tanımlık fermuar eğe içine otomatik olarak seçilen zaman noktalarda (yüzde) olarak cep kaplı ve kazı bölgelerinden deneysel verileri içeren bir elektronik tablo Özet dosya e-posta yoluyla sağlayan görüntü analiz yazılımı yükleyin.
   Not: Öncü ve gap alanının tanınması büyük ölçüde kenar algılama yöntemi (hangi keskin görüntü parlaklığını değiştirir noktaları belirlenmesi amaçlı) temel alır.
3. Verileri kaydetmek ve onları toplamak. Ortalama değer açısından tüm verilerin zaman sıfır normalleştirmek. Her zaman noktası ve göreli standart hata (SEM) tüm çoğaltır normalleştirilmiş veri ortalama değerini hesaplamak. İki yönlü Varyans analizi (ANOVA) kullanarak, uygun istatistik yazılımı ile istatistiksel analiz yapmak. Peptid tedavi grupları ve farklı zaman aralıklarında kontrol grubu arasında farklılıklar istatistiksel olarak significant bir piçin olmak olarak kabul edilir < 0,05.
4. Elde edilen verileri seçili zaman aralıkları tüm örnek gruplar karşı hücre bölgeyi yüzdesini gösteren bir çubuk grafik, bir grafik çizmek.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı etkisi Esc(1-21) ve Esc(1-21) - 1 c fonksiyonel CFTR ifade bronş epitel hücreleri indüklenen hücre göç etkinlik açısından şifa yara belirlemek için kullanıldı. Bu tahlil, kültür ekler bir 12-şey plaka wells yerleştirildi ve her bölmesi MEMg % 10 ile desteklenmiş 35.000 hücreleri ile seribaşı FBS. Hücreleri 24 h içinde tam izdiham sonra ulaştı, bir 500 mikron boşluk oluşturulur ve her şey peptid farklı konsantrasyonlarda içeren MEMg doluy...

Tartışmalar

Hücre göç yara iyileşmesi, embriyonik gelişim ve kanser metastaz dahil olmak üzere birçok fizyolojik ve patolojik olaylarda önemli bir süreçtir. Hücre göç vitro çalışma temel yordamı içerir: (i) bir hücre monolayer, (ii) hücreleri, Konfluent tabakası sözde bir yarada üretimi oluşturulması (III) yara kadar farklı zaman aralıklarında görüntüleri yakalama kapatma ulaştı , (iv) seçilen hücreleri geçiş hızını ölçmek için görüntü sırası analizi.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum essential medium (MEM)	Euroclone	ECB2071L	Warm in 37 °C water bath before use
Glutamine	Euroclone	ECB3000D
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0180DH
Penicillin and Streptomycin	Euroclone	ECB3001D
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Trypsin/EDTA 1X in PBS	Euroclone	ECB3052D	Warm at room temperature before use
DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
DPBS with calcium and magnesium (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Ibidi Culture-Insert 2 well	Ibidi	80209
Wimasis Image Analysis	Ibidi	30002
PRISM software	GraphPad	version 6.0