Um romance em Vitro ferida cura ensaio para avaliar a migração celular

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar o efeito dos peptídeos na migração das células epiteliais brônquicas. Este método permite a obtenção rápida e altamente reprodutível de dados quantitativos sobre a velocidade de fechamento de migração e ferida de célula.

Resumo

O objetivo deste trabalho é apresentar um novo método para avaliar a capacidade de algumas moléculas de imunomoduladores, como peptídeos antimicrobianos (AMPs), para estimular a migração celular. Importante, migração celular é um evento limitante durante o processo de cicatrização de feridas para re-estabelecer a integridade e a função normal das camadas de tecido após a lesão. A vantagem deste método sobre o ensaio clássico, que é baseado em um arranhão feito manualmente em uma monocamada de células, é que o uso da cultura de silicone especial insere fornecendo dois compartimentos para criar um campo de pseudo ferido sem célula com uma largura bem definida (500 μm ). Além disso, devido a uma plataforma de análise automatizada de imagem, é possível obter rapidamente dados quantitativos sobre a velocidade da migração de encerramento e célula de ferida. Mais precisamente, será mostrado o efeito de duas ampolas de pele de sapo sobre a migração de células epiteliais brônquicas. Além disso, tratamento prévio destas células com inibidores específicos irá fornecer informações sobre os mecanismos moleculares subjacentes a tais eventos.

Introdução

Isso é amplamente conhecido que a cicatrização de feridas em animais é um processo fundamental para restabelecer a integridade e a função normal das camadas de tecido após lesão¹. Apesar de superfícies epithelial expostas ao ambiente externo (por exemplo, a pele, respiratória e trato gastrointestinal) formam uma barreira protetora de insultos físicos e químicos, a formação de feridas pode ocorrer facilmente, especialmente depois cirurgia ou infecções microbianas². Como exemplo, a colonização do tecido pulmonar pelo patógeno oportunista bacteriano Pseudomonas aeruginosa, especialmente em pessoas com fibrose cística (CF), leva a dano do epitélio de vias aéreas, com consequente insuficiência respiratória^{3, 4}. Cicatrização de feridas é um mecanismo de reparação do complexo hospedeiro para restaurar a arquitetura normal de um tecido lesado⁵. É caracterizada por inflamação inicial, seguida de um período de regeneração, englobando epitelização, angiogênese e remodela o tecido com a produção de colágeno e células diferenciação^6,7,8 . Para garantir a integridade epitelial e para controlar a proliferação microbiana, todos os organismos vivos produzem moléculas de defesa, incluindo peptídeos antimicrobianos (AMPs)^9,10. A processo de cicatrização de feridas é muito difícil simular em vitro devido à falta de restos celulares e interações complexas entre diferentes tipos de células. No entanto, a em vitro capacidade de um peptídeo para acelerar o encerramento de uma pseudo ferida, estimulando a migração de células epiteliais é indicativa de sua capacidade de curar um epitélio comprometido. Com efeito, migração celular é um evento limitante na cicatrização de feridas, e estudar os fatores que podem afetar a migração celular ajudará a terapias de alvo para melhor cicatrização.

Aqui, um ensaio experimental altamente reprodutível é fornecido com base em inserções de cultura do silicone especiais para avaliar a migração de células in vitro. É baseado na criação de um 500 μm gap (pseudo ferida) em uma monocamada confluente célula. As células na borda do campo "ferido" artificial começará migrando para a área livre de células, formando novos contatos do celular. A inserção da cultura representa uma nova ferramenta para rápida ferida experiências de cura. São fornecidos dois reservatórios separados por uma parede de 500 μm, e podem ser devidamente colocados em um prato prato 3 cm ou no bem de uma placa de 12. Cada compartimento da inserção de enchimento com uma suspensão de células permite que as células a crescer em cada área designada até confluência, enquanto a remoção da inserção criará uma abertura limpa livre de célula de aproximadamente 500 μm (a mesma largura que o muro de separação). Um meio de cultura celular adequada complementado com um composto de teste pode ser adicionado no prato prato/bem. Depois, o fechamento de espaço pode ser visualizado em intervalos de tempo diferentes sob um microscópio invertido, de preferência um equipado com uma câmera de vídeo para aquisição de imagens. Finalmente, medição de mudanças na área celular coberto pelo programa de análise de imagem automatizado baseado na web irá permitir a quantificação da velocidade da migração de encerramento e célula de ferida. Em geral, esse método é um passo em frente no que diz respeito o ensaio clássico, onde um arranhão é feito manualmente por incisão duas monocamadas de células confluente com uma agulha estéril ou uma pipeta dica¹¹. Com efeito, o último procedimento pode destruir o fundo plástico do prato prato/poço e o revestimento de superfície, criando rugas. Além disso, a área de "ferida" não tem uma largura bem definida ao longo de todo o comprimento do gap, como altamente depende da pressão aplicada por pesquisadores a ponta da agulha. Além disso, as células soltas podem formar aglomerados de células vivas e mortas nas bordas da risque; Além disso, a disseminação de células vivas para a área de "ferida" pode interferir com a velocidade de migração celular, gerando resultados não reproduzíveis¹².

Além disso, graças a uma plataforma de análise de risco de imagem, os usuários podem rapidamente receber (em minutos) dados quantitativos sobre o comportamento migratório das células selecionadas sem a necessidade de aquisição de software adicional. Esta plataforma é capaz de analisar imagens de microscopia de contraste de fase de baixa (~ 5. X), médio (~ 10 X) e ampliação de alta (~ 20 X). Após o upload de um arquivo zip de imagens (em *. jpg, *. jpeg, *.jp2, *. png, *. gif, formato *.tiff) a análise é automaticamente realizada para gerar um arquivo de resumo que mostra a porcentagem de áreas cobertas de célula e de áreas de risco, bem como a velocidade da célula migração, em intervalos de tempo distintos.

Neste trabalho, por meio de um AMP-derivado de pele de sapo, ou seja, Esc(1-21) e seu Diastereoisômero Esc(1-21) - 1 c¹³e uma linhagem de células brônquicas expressando o funcional CF condutância transmembrana regulador (CFTR)^14,15, é fornecido um exemplo de migração celular induzida por peptídeo em comparação com amostras não tratadas (controle). Observe que o epitélio das vias respiratórias e CFTR desempenham um papel crucial na manutenção da função pulmonar e ferida reparo¹⁶. Além disso, por meio de inibidores seletivos (por exemplo, AG1478)¹⁷ do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), provas de que a migração de células brônquicas induzidas pelos peptídeos acima mencionados envolve ativação do EGFR^{12, 18} é relatado.

Em resumo, o objetivo deste procedimento é mostrar como o uso de tais inserções de cultura do silicone representa um ensaio rápido e facilmente acessível para determinar com precisão a migração de células aderentes (por exemplo, células epiteliais brônquicas) e o molecular mecanismos de controle de tais eventos.

Protocolo

1. preparação da pilha

1. Sementes 2.5x10⁶ células em 10 mL de mínimo essencial médio (MEM) suplementada com glutamina 2mm (MEMg), e mais 10% de soro fetal bovino (FBS), antibióticos (0,1 mg/mL de penicilina e estreptomicina) e puromicina (0,5 µ g/mL para a seleção e manutenção da linha de células) em um balão de T75. Incube o frasco a 37 ° C e 5% de CO₂ por 2 dias. Antes de iniciar o experimento, verificar a confluência das células sob um microscópio invertido.
   Nota: As células utilizadas para o experimento são imortalizadas brônquicas epiteliais células humanas transfectadas com um vetor de Lentivirus confere resistência à puromicina. Eles expressam estàvel CFTR funcional^14,15.
2. Uma vez que alcançou a confluência das células 90-100%, Aspire o meio do recipiente e descartá-lo em um frasco de resíduos sob uma classe do gabinete de segurança biológica II. Lavam-se as células com 6 mL de tampão fosfato salina sem cálcio e magnésio (CMF-PBS). Suavemente agitar o frasco manualmente e descartar CMF-PBS.
   Nota: Tenha cuidado para não tocar a monocamada de células com a pipeta.
3. Adicionar 10 mL de PBS-CMF e incubar o frasco a 37 ° C e 5% CO₂ por 10 min.
4. Aspire CMF-PBS e descartá-lo. Em seguida, adicione 2 mL de tripsina/EDTA para o balão.
5. Suavemente agitar o frasco, permitindo que a solução completamente revestir as células, e incubar o frasco a 37 ° C e 5% CO₂ por 10 min até que as células são visivelmente destacadas sob um microscópio.
   Nota: No final do tempo de incubação, as células devem aparecer arredondados e não anexado à superfície plástica. Se as células não são bem destacadas, agitação manual pode ser necessária.
6. Adicionar 10 mL de MEMg acrescido de 10% FBS para inactivar a tripsina e coletar as células lavando o fundo do frasco. Transferi o volume para um tubo cónico de 50 mL.
7. Centrifugar o tubo por 5 min a 80 x g.
8. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 6 mL de MEMg acrescido de 10% FBS. Pipeta repetidamente para quebrar qualquer touceiras.
9. Pegue 10 µ l de suspensão de células com uma micropipeta e injetar o volume sob o vidro de cobertura anteriormente colocar uma câmara Burker ou Neubauer.
10. Conte o número de celular.

2. célula semeando a cultura insere

1. Em cada poço de uma placa de 12, transferi a inserção de cultura com pinça estéril (Figura 1). Use uma pinça para pressionar ao longo das bordas de inserções para corrigi-los para a superfície da placa.
   Nota: As inserções tem um pegajoso inferior que permite a adesão.

Figura 1 : Representação esquemática das pastilhas cultura do silicone, colocar corretamente em poços de uma placa de 12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Corretamente, diluir a suspensão de eritrócitos em MEMg acrescido de 10% FBS. Encha cada compartimento da inserção com 70 µ l de suspensão de células (sobre 3.5x10⁴ células/câmara).
   Nota: A densidade de células aplicado em cada compartimento depende do tipo de células. Recomenda-se usar uma densidade de células que leva à completa confluência dentro de 24 h.
3. Sob o microscópio, verificar que as células não estão vazando dos compartimentos de inserção e incubam a placa de 12 para 24 h a 37 ° C e 5% de CO₂.

3. pseudo-ferido cura ensaio

1. Após a incubação, visualize as células ao microscópio invertido para verificar que monocamadas confluente célula tem sido formadas.
2. Re-suspenda os compostos de teste (por exemplo, ampères) em 1 mL de MEMg.
   Nota: Preparar diluições de amplificadores frescas a partir da solução estoque armazenada a-20 ° C.
3. Retire com cuidado as inserções por uma pinça estéril. Tenha cuidado para não quebrar as monocamadas de células. Transferi as inserções em papel absorvente.
   Nota: Para re-usar as mesmas inserções, esterilizá-los em etanol a 70% pelo menos 3 h. Recomenda-se jogá-los fora depois.
4. Para remover as células não-aderentes, adicione 1 mL de MEMg por bem utilizando uma micropipeta. Feche a placa e balance-a cuidadosamente.
   Nota: Não adicione médio diretamente em cima de monocamadas de células para evitar a sua ruptura.
5. Aspire o meio e substituí-lo com 1 mL de MEMg por bem. Feche a placa e visualizar as lacunas sem célula (criadas pelas inserções) sob o microscópio invertido na ampliação de 4x, equipado com uma câmera de vídeo. Adquirir imagens no tempo zero (T0) e salvá-los em um formato. jpg.
6. Remover o meio de poços, lave-os com 1 mL de PBS e descartá-lo.
7. Adicione os compostos de teste (preparados no ponto 3.2) nos poços. Para amostras de controle não tratados, adicione 1 mL de MEMg. Incube a placa a 37 ° C e 5% de CO₂.
8. Depois de 15, 20 e 24 h de tratamento, observar a migração de células sob o microscópio com ampliação de 4x e adquirir imagens.
   Nota: Durante esta etapa, tente capturar imagens nas mesmas áreas quanto a T0. A escolha dos intervalos de tempo em que as imagens são capturadas depende da velocidade de migração celular.
9. Para estudar o efeito de alguns inibidores seletivos, ou seja, AG1478, na migração celular, Aspire o meio de cada compartimento de inserção antes de remover as pastilhas.
   1. Lavar cada compartimento com MEMg fresco e preenchê-lo com 70 µ l de MEMg suplementado com AG1478.
   2. Após 30 min. de incubação a 37 ° C e 5% de CO₂, proceda como descrito do ponto 3.3.
      Nota: Durante a etapa de lavagem e tratamento prévio de monocamadas de células com os inibidores específicos, tenha cuidado para não remover as inserções.

4. análise de imagens

1. Após a conclusão do experimento, selecionar imagens das amostras mais representativas dos diversos grupos experimentais e criar um arquivo zip contendo imagens isoladas a h T0, T15, T20 e T24.
   Nota: Imagens isoladas são tomadas a intervalos de tempo selecionado para todas as amostras. Execute triplica para cada experimento, o que é repetido pelo menos três vezes. No final, para grupos todos experimentais, um mínimo de 3 imagens ("a", "b", "c", etc, derivando de cada experimento independente) em cada ponto de tempo são analisados.
2. Fazer o upload do arquivo zip para o software de análise de imagem que fornece automaticamente, por e-mail, um arquivo de planilha Resumo contendo os dados experimentais das áreas cobertas de célula e zero (em percentagem) nos pontos de tempo selecionado.
   Nota: O reconhecimento da borda principal e a área de abertura é amplamente baseado no método de deteção de borda (visto identificar pontos em que o brilho da imagem muda bruscamente).
3. Salvar os dados e coletá-los. Normalize todos os dados em relação ao valor médio no tempo zero. Calcule o valor médio dos dados normalizados de todas as repetições em cada ponto do tempo e o desvio-padrão relativo (SEM). Por meio de duas vias de análise de variância (ANOVA), realiza análise estatística com um software de estatística adequada. Diferenças entre grupos tratados com peptídeo e grupos de controle em intervalos de tempo diferentes são consideradas estatisticamente significativa para um p< 0,05.
4. Plotar os dados obtidos em um gráfico como um histograma, que mostra a porcentagem de área coberta por célula de toda amostra grupos contra os intervalos de tempo selecionado.

Resultados

Este protocolo foi utilizado para determinar a efeito de Esc(1-21) e Esc(1-21) - 1 c em termos de actividade de migração celular induzida em células epiteliais brônquicas expressando a CFTR funcional de cicatrização de feridas. Neste ensaio, inserções de cultura foram colocadas em poços de uma placa de 12, e cada compartimento foi inoculado com 35.000 células em MEMg suplementado com 10% FBS. As células atingiu completa confluência dentro de 24 h. depois, uma lacuna de 500 μm...

Discussão

Migração celular é um processo essencial em muitos eventos fisiológicos e patológicos, incluindo a cicatrização de feridas, desenvolvimento embrionário e metástases. O procedimento básico para estudar célula migração em vitro envolve: (i) a criação de uma monocamada de células, (ii) a produção de uma pseudo ferida na camada confluente das células, (iii) a captura de imagens em intervalos de tempo diferentes até ferida encerramento é alcançado. e (iv) a análise da sequência de imagem de fo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum essential medium (MEM)	Euroclone	ECB2071L	Warm in 37 °C water bath before use
Glutamine	Euroclone	ECB3000D
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0180DH
Penicillin and Streptomycin	Euroclone	ECB3001D
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Trypsin/EDTA 1X in PBS	Euroclone	ECB3052D	Warm at room temperature before use
DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
DPBS with calcium and magnesium (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Ibidi Culture-Insert 2 well	Ibidi	80209
Wimasis Image Analysis	Ibidi	30002
PRISM software	GraphPad	version 6.0