JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu yöntem klonlama, ifade ve yapısal tayini için rekombinant Nsa1 arınma x-ışını kristalografisi ve küçük açı X-ray saçılma (SAXS) tarafından açıklar ve diğer proteinlerin hibrid yapısal analiz için geçerlidir her ikisi de içeren düzenli ve düzensiz etki alanları.

Özet

Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) elde ribozom derleme faktörü Nsa1 tam uzunlukta yapısını belirlenmesi zor nedeniyle düzensiz ve proteaz değişken C-terminus protein. Bu el yazması x-ışını kristalografisi ve SAXS göre yapısal analiz için S. cerevisiae üzerinden rekombinant Nsa1 arındırmak için yöntemleri açıklar. X-ışını kristalografisi Nsa1 iyi N-terminal WD40 etki alanı yapısını çözmek için kullanılmıştır ve sonra SAXS Nsa1, C-terminus yapısında çözüm çözmek için kullanıldı. Çözüm saçılma veriler çözüm tam uzunlukta Nsa1 üzerinden toplanmıştır. Teorik saçılma genlikleri WD40 etki alanı yüksek çözünürlüklü kristal yapısı hesaplanan ve C-terminus Nsa1, katı vücut ve ab initio modelleme bir arada ortaya koydu. Bu melez yaklaşımla tüm protein dördüncül yapısının yeniden. Burada sunulan yöntemleri genel olarak yapılandırılmış ve yapılandırılmamış etki alanları karışımından oluşan diğer proteinlerin hibrid yapısal kararlılık için uygulanabilir olmalıdır.

Giriş

Ribozom mRNA tüm canlı hücrelerdeki protein dönüştürerek httpd'ye temel rolü gerçekleştirmek büyük Ribonükleoprotein makinelerdir. Ribozom ribozom biyongenezi1,2,3,4olarak adlandırdığı karmaşık bir süreç içinde üretilen iki altbirimden oluşur. Ökaryotik ribozom derleme gerekli ribozomal derleme faktörler2,3,5yüzlerce yardımıyla dayanır. Nsa1 (Nop7 ilişkili 1) özellikle büyük ribozomal altbirimde6üretimi için gerekli olan bir ökaryotik ribozom derleme bir faktördür ve WD yineleme olarak bilinen 74 (WDR74) daha yüksek organizmaların7içeren. WDR74 fareler8blastosist oluşumu için gerekli olduğu gösterilmiştir ve WDR74 düzenleyici sık kanser hücreleri9' mutasyona uğramış. Ancak, işlev ve Nsa1/WDR74 kesin mekanizmaları ribozom derlemesinde hala büyük ölçüde bilinmeyen vardır. Nsa1/WDR74 rolü ökaryotik ribozom olgunlaşma sırasında ortaya çıkarmak başlamak için birden çok yapısal analiz, x-ışını kristalografisi ve küçük açı X-ray saçılma (SAXS)10gibi yapıldı.

X-ışını kristalografisi, Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, elektron mikroskobu ve SAXS makromoleküllerin yapısı eğitim için tüm önemli teknikler vardır. Boyut, şekil, kullanılabilirliğini ve kararlılığını belirli bir makromolekül en iyi olacak Yapısal Biyoloji yöntemi uygun oluştururlar etkiler, ancak bir çok teknik bir sözde "melez" yaklaşımla birleştirerek haline geliyor bir giderek daha faydalı aracı11. Özellikle x-ışını kristalografisi ve SAXS yapısal oluştururlar12tespiti için güçlü ve tamamlayıcı yöntemler vardır.

Kristalografi ribozom gibi büyük hücresel makine küçük moleküller arasında değişen yüksek çözünürlüklü atomik yapıları sağlar ve proteinleri ve diğer biyolojik fonksiyonların anlamada çok sayıda devrimler yol açmıştır oluştururlar13. Ayrıca, uyuşturucu yapısı tabanlı tasarım hesaplama yöntemleri, ilaç bulma ve geliştirme14için kritik bir boyut ekleme tarafından Moleküler yerleştirme için kristal yapıları gücünü. Onun geniş uygulanabilirliği rağmen esnek ve düzensiz kristal ambalaj engel veya elektron yoğunluğu eşlemeleri tamamlanmamış olabilir beri kristalografisi, ya da düşük kaliteli değerlendirmek için zorlu sistemlerdir. Tersine, SAXS çözüm tabanlı ve düşük çözünürlüklü yapısal yaklaşım düzensiz döngüler ve termini özünde düzensiz proteinler12,15,16' kadar esnek sistemleri açıklayan yeteneğine sahip olduğunu. Parçacık boyutları12geniş bir yelpazesi ile uyumlu olduğunu düşünürsek, SAXS sinerjik kristalografisi yapısal çalışmaları tarafından ele alınması biyolojik sorular aralığı genişletmek için çalışabilirsiniz.

Bir fonksiyonel ama esnek C-hangi x-ışını kristalografisi yöntemleri için müsait değildir terminus ardından iyi yapılandırılmış bir WD40 etki alanı içerdiği için Nsa1 bir melez yapısal yaklaşım için uygundur. Klonlama, ifade ve arıtma S. cerevisiae Nsa1 x-ışını kristalografisi tarafından hibrid yapısal tayini için ve SAXS için bir protokol aşağıdadır. Bu iletişim kuralı bir arada düzenli ve düzensiz bölgeler oluşmaktadır diğer proteinler yapılarının çalışmaya adapte edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. rekombinant Protein üretimi ve Nsa 1 arıtma

  1. Nsa1 ifade plazmid tasarım ve klonlama
    1. Elde etmek veya S. cerevisiae genomik DNA satın alın.
    2. PCR yükseltmek Nsa1 hedef dizisi (Nsa1FL, artıkları 1-463) ve C-terminal kesildi Nsa1 (Nsa1ΔC, artıkları 1-434) S. cerevisiae ve erime sıcaklığını izole genomik DNA'yı kullanarak uygun astar ile yaklaşık 1-2 dk bir uzantısı zaman ile 60 ° C. Aşağıdaki astar Nsa1 yükseltmek için kullanılmıştır:
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC
    3. Bir N-terminal içeren Escherichia coli (e.coli) ifade vektör pHMBP Nsa1 subclone 6 X-histidin etiketi ardından maltoz bağlayıcı Protein (MBP) ve standart klonlama teknikleri17 kullanarak bir tütün Etch virüs (TEV) proteaz site ekleyin .
    4. DNA sıralama Nsa1 N-terminal MBP O'nun etiketiyle çerçevesindeki klonlanmış doğrulamak için kullanın.
  2. Nsa1 Protein ifade
    1. İfade plasmid(s) uygun bir E. coli dönüşümü ifade gerilme T7 organizatörü tabanlı bir sistemin ile. Transformants 100 µg/mL Ampisilin içeren LB agar plakalar üzerinde plaka ve plaka gecede 37 ° C'de ters kuluçkaya
    2. 100 µg/mL Ampisilin dönüştürme plaka ile LB 50 mL kültürünü aşılamak ve gecede 200 devirde 37 ° C'de sallayarak ile büyür
    3. 3 x 1000 mL lb Fernbach şişeler 100 µg/mL Ampisilin ile yapılan gecede kültür 15 mL ile aşılamak ve 37 ° C'de 200 devirde sallayarak ile büyür
      Not: protein yapısı çözüm için selenomethionyl (SeMet) birleşme hücreleri ile SeMet ve bir amino asit karışımı metiyonin üretim indüksiyon, LB medya aksine önce etkisizleştirmek için takıma M9 en az orta büyüyen tarafından elde edilebilir 18.
    4. OD600 ~0.8 Buna ek olarak izopropil β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) tarafından ulaştığında 1 mM gecede 200 devir / dakikada sallayarak ile kuluçka 25 ° c ve ardından son bir konsantrasyon, Nsa1 ifade teşvik.
    5. Santrifüjü 5,050 x g de 15 dakika 4 ° C'de tarafından hücre hasat.
      Not: Hücreleri uzun vadeli-80 ° C'de depolanan veya hemen protein arıtma için kullanılan.
  3. Nsa1 Protein saflaştırma
    1. Bir EDTA ücretsiz proteaz inhibitörü tablet içeren 4 ° C'de önceden soğutulmuş lizis arabelleği (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, % 10 gliserol, 10 mM MgCl2) 25 mL hücrelerde resuspend.
    2. 4 ° C'de sonication tarafından hücreleri Parçalayıcı (zaman 7 dk., 2 dönemi, 2 s s döngüsü kapalı; genlik: % 70).
    3. Santrifüjü 26,900 x g 4 ° C'de 45 dk için de tarafından lysate açıklamak
    4. Geçerli bir yerçekimi akışı sütuna immobilize kobalt benzeşme reçine 10 mL ile yüklenen lysate açıklık, önceden lizis arabellek ile dengelenmiş.
    5. Yerçekimi akımını 4 ° C'de reçine geçmek ve reçine lizis arabelleği 100 mL ile iki kez yıkayın süpernatant izin.
    6. Nsa1 20 mL elüsyon arabellek (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 5 mM MgCl2, % 5 gliserol ve 200 mM imidazole) ile elute.
    7. Eluate 15 μL al ve kaç protein benzeşme reçine (şekil 1A) eluted doğrulamak için bir 4-%15 SDS-sayfa jel üzerinde.
    8. MBP etiketi TEV proteaz sindirim tarafından kaldırın. TEV proteaz19 (1 mg/mL stok) 1 mL Nsa1 benzeşme reçine elüsyon için ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya.
    9. Konsantre MBP i ciddi Nsa1 için ~ 5 mL bir molekül ağırlığı ile santrifüj filtre kullanarak kapalı 10 kDa kes.
    10. MBP i ciddi Nsa1 geçerli bir jel-filtrasyon sütun için arabellek (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, % 5 gliserol ve 1 mM β-mercaptoethanol) önceden equilibrated (şekil 1B).
    11. Sütun kesirler MBP i ciddi ve Nsa1 15 μL örnekleri 4-%15 SDS-sayfa jel (şekil 1B) üzerinde çalıştırarak ayrılmış doğrulamak için jel filtrasyon üzerinden analiz.
    12. Nsa1 içeren kesirleri birleştirin ve 8 mg/mL 10 kDa uzakta-in kesmek bir molekül ağırlığı ile santrifüj filtre kullanarak için konsantre.
    13. 280 Absorbans ölçerek protein konsantrasyonu belirlemek yok olma katsayısı 42530 M-1cm-1' i kullanarak bir Spektrofotometre nm. Protein hemen proteolitik tarama ve kristalizasyon denemeler için kullanın.

2. kristalizasyon ve Nsa 1 proteolitik tarama

  1. Seyrek matris kristal tarama Nsa1
    1. Nsa1 8 mg/mL stok vasıl 10 dk 4 ° C'de 16.000 x g 500 μL santrifüj kapasitesi.
    2. Kristalizasyon denemeler kristalizasyon robot ve seyrek matris kristal ekranlar kullanarak kurulum. Bireysel kristal ekran reaktifler seyrek matris kristalizasyon ekranlar üzerinden 30 μl ile 96 iyi tepsiler rezervuar doldurun. 250 karıştırılarak robot ile oturma damla kurulum nL 250 ile iyi çözüm nL protein çözüm.
    3. Kristalizasyon plakalarının bant ile ve onları 25 ° C'de kuluçkaya
    4. Tabakları her iki günde bir stereomicroscope ile ilk 2-3 hafta boyunca kontrol edin.
    5. Potansiyel kristalleri sayısı UV mikroskopla protein içerdiğini doğrulayın.
      Not: Nsa1 iki farklı kristal formlar için (kübik ve Ortorombik, şekil 2A) aşağıdaki ekranları 1 hafta içinde elde edilmiştir: JCSG + condition B11 (1.6 M sodyum sitrat Tribazik kurutmak, pH 6,5) ve Sihirbazı Precipitant sinerji ekran blok 2 C11 durumu (20.1%(v/v) 1500 PEG, 13.4%(v/v) 400 PEG, 0.1 M Tris HEPES/sodyum hidroksit, pH 7.5).
  2. Proteolitik tarama
    Not: kristalizasyon en iyileştirme sırasında bu Nsa1 Ortorombik kristalleri proteolitik bölünme sonucu olarak ortaya çıktı ve tam uzunlukta protein kullanarak kristallerin çoğaltılamadı keşfedildi. Sınırlı proteolizis kütle spektrometresi ile birleştiğinde kullanarak, bu Nsa1, C-terminus proteolizis için hassas ve C-terminal kuyruk kaldırılması Ortorombik kristal formu (sonraki üreme için gerekli belirlendi Nsa1ΔC).
    1. 1 mg/mL proteaz hisse senedi çözümleri aşağıdaki proteaz α-kimotripsin, Tripsin, elastase, papain, subtilisin ve endoproteinase Glu-C. hazırlamak
    2. 1:10, 1: 100 ve 1: 1000 dilutions her 1 mg/mL proteaz stokunun ile seyreltme tampon (10 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM Sodyum Klorür) oluşturun.
    3. Proteaz stokunun (1:10, 1: 100 ve 1: 1000) 1 μL pipet protein (1 mg/mL) taranması her proteaz için 9 μL aliquots içine.
    4. Çözüm için 1 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    5. Reaksiyon 10 μL 2 x SDS-sayfa örnek arabelleği ekleyerek durdurmak ve 5 min için 95 ° C'de tepki ısı.
    6. Özetler bir % 4-15 SDS-sayfa jel (şekil 2B) çalıştırarak analiz.
    7. Hedef protein proteaz dayanıklı etki alanlarına göre jel kütle spektrometresi analiz tanımlayın.
    8. Proteaz değişken bölgeler kesilmiş ifade yapılarını oluşturarak ve yukarıda açıklanan klonlama, ifade ve arıtma iletişim kuralı aşağıdaki hedef protein kaldırın.
  3. Kristalizasyon en iyi duruma getirme
    1. Hazırlamak veya hisse senedi çözümleri aşağıdaki ilk kristalizasyon reaktifler, alın: 1.6 M sodyum sitrat Tribazik kurutmak pH 6,5, 100%(v/v) 400 PEG, 50%(v/v) 1500 PEG, 1 M HEPES/sodyum hidroksit, pH 7.5.
    2. Nsa1 stok çözeltisi hazırlamakFL ve Nsa1ΔC , 8 mg/mL yukarıda açıklandığı gibi.
    3. Nsa1 kübik kristaller optimize (Nsa1FL).
      1. 1-1.6 m sodyum sitrat ile pH 6,5-1,6 M sodyum sitrat Tribazik hisse senedi bir çözüm pH 6,5 ile gradyan ile 500 µL içeren wells ile 24-iyi kılavuz ekran hazırlayın.
      2. Mix 1 µL 1 µL iyi çözüm ve yeri bir kapak silikonlu slayt üzerine karışımı ile protein. Dikkatli önceden yağlanmış üstüne kapak slayt iyi ve emin olmak ters çevir'i de kapalı ama değil damla rahatsız veya kapak slayt kırmak için özen gösterin. Tepsi doldurulur kadar bu işlemi yineleyin ve ardından 25 ° C'de depolayın
        Not: Küçük kübik kristaller 2-7 gün içinde görünmelidir.
      3. Bir microseed hisse senedi kübik kristaller hazırlayın. Bir monte naylon döngü ~ 10 küçük kübik kristaller küçük boncuk ve 1,6 M sodyum sitrat Tribazik zekâ pH 6,5 50 µL içeren 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü aktarmak için kullanın.
      4. Girdap 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü yüksek hızda (~ 3000 devir/dakika) 1 dk için.
      5. Karışım iyice 5 için 1,6 M sodyum sitrat Tribazik ve girdap ile tohum stokunun 10 kat seri dilutions bir dizi yapmak s.
      6. Her doldurmak iyi bir 24-şey tablo, 1,6 M sodyum sitrat Tribazik pH 6,5 500 µL ile ekran.
      7. Microseeding koşulları damla protein tohum stok Çözümleri (şekil 3A) ile değişen oranlara sahip ayarlayarak en iyi duruma getirme. Yüksek kırınım kalite daha büyük kübik kristaller (şekil 3 c) 2-5 gün içinde görünmelidir.
    4. Ortorombik kristalleri optimize (Nsa1ΔC)
      1. 500 µL 24 farklı koşullar (şekil 3B) ile her iyi bir kılavuz ekran 50%(v/v) PEG 1500 ve 100%(v/v) PEG 400 hisse senedi çözümlerinden hazırlayın. Ek olarak degradeler PEG 1500 ve PEG 400 her şey aynı 0.1 M HEPES/sodyum hidroksit pH 7.5 içermelidir.
      2. Protein çözüm 1 µL silikonlu kapak Slayt üzerindeki iyi çözüm 1 µL karıştırın. Dikkatli önceden yağlanmış üstüne kapak slayt iyi ve emin olmak ters çevir'i de kapalı. Tüm belgili tanımlık tepsi dolu kadar bu işlemi yineleyin. Tepsiler 25 ° C'de depolayın
        Not: Nsa1 Ortorombik kristalleri 2-7 gün içinde görünmelidir.
      3. Kübik kristaller (Adım 2.3.3.3-2.3.3.7) açıklandığı gibi Ortorombik kristalleri microseeding tarafından daha fazla optimize 20.1%(v/v) 1500 PEG, 13.4%(v/v) PEG 400 ve 0.1 M HEPES/sodyum hidroksit pH 7.5 500 µL iyi çözüm olarak kullanarak.
        Not: Nsa1 SeMet kristalleri benzer şekilde yerel kristaller daha optimize edilmelidir.

3. x-ışını kırınım veri toplama ve Nsa 1 yapı çözüm

  1. Cryo-kristaller ve x-ışını kırınım veri toplama korunması
    1. Ortorombik kristalleri (Nsa1ΔC), 22.5%(v/v) 1500 PEG, 15%(v/v) PEG 400 ve 0.1 M HEPES/sodyum hidroksit pH 7.5 içeren 1 mL cryoprotectant solüsyon hazırlamak.
    2. Bir köpük Dewar sıvı azot ile doldurun ve kristal Pak önceden serin. Sıvı azot ile çalışırken dikkatli olun ve koruyucu eldiven ve gözlük.
    3. Dikkatle de içeren bir stereomicroscope sahneye kristalleri kristalleşme kapak slayt tersine çevirin.
    4. Yeni bir kapak slayt üzerine cryoprotectant çözümün 2 µL pipet.
    5. Bir monte naylon döngü kristal için uygun büyüklükte bir manyetik cryo değnek iliştirin.
    6. Stereomicroscope yardımıyla kullanarak, hızlı bir şekilde bir kristal takılı cryo döngü ile cryoprotectant çözüm aktarın.
    7. 5 dakika içinde cryoprotectant çözüm için equilibrate kristal ver.
    8. Stereomicroscope yardımıyla kullanarak, hızlı bir şekilde cryoprotectant çözüm ve Dalma-freeze gelen kristal sıvı azot döngüsü.
    9. Kaynama durdurmak için döngü etrafında sıvı azot bekleyin ve değneği üzerinden döngü kristal puck içinde belirli bir konuma bırakın.
    10. Kübik Nsa1FL kristalleri cryoprotected olmak gerekli olmayan ve olmak doğrudan flaş dondurulmuş (adımları 3.1.8-3.1.9 yukarıdaki).
    11. Cryo araçlarını kullanarak kristal puck mühür ve bir nakliye baston önceden soğutulmuş dewar içinde transfer. Kristalleri adam/dewars veri toplama kadar saklayın.
    12. Eğer bir sinkrotron veri toplama, Kuru bir nakliyeci kullanarak sinkrotron kristal gemi.
    13. Aşağıdaki standart teknikleri20x-ışını kırınım veri toplamak.
      Not: Nsa1 yerli ve SAD için (tek dalga boyu anormal dağılım) veri kümeleri 100 K 22-ID ve 22-BM Argonne Ulusal Laboratuvarı (Chicago, Il) gelişmiş foton kaynağının SER-kedi ışın satırlarındaki toplanmıştır. SAD Nsa1 veri kümesi λ toplanan 0.97911 Å =. Veri 1 s çekim hızı ve 0.5 ° salınımlarını kullanarak kaydedildi. Bu kristaller mosaicity genellikle yaklaşık 0.3 ° yapıldı.
    14. İşlem ve ölçeği x-ışını kırınım yansıma dosyaları her veri kümesi için uygun alan grubunda oluşturmak resimlerini.
      Not: HKL200021Nsa1 Difraksiyon veri kümeleri işlendi. Nsa1 kübik kristaller uzay grubu P213 işlendi ve Ortorombik kristaller içinde alan grup P212121işlendi.
  2. Nsa1 yapı çözüm.
    Not: Çözmek ve rafine Phenix ve CCP422,23dahil olmak üzere kristal yapılar için kullanılan birkaç kristalografisi yazılım paketleri vardır. Phenix yazılım Süiti22kullanarak Nsa1 yapı çözüm için protokol aşağıdadır.
    1. Çözümlemek veri kümeleri phenix.xtriage22ile yerli ve SAD ölçekli.
    2. ÜZGÜN tepe yansıma dosyası22,24kullanarak Phenix.autosol ile Nsa1 yapısını çözmek. AutoSol programını çalıştırmak için selenomethionine sitelerin sayısı giriş (siteleri = 9), Nsa1ΔC ve üzgün veri toplamak için kullanılan dalga boyu fasta sıra dosya (λ 0.97911 Å =).
      Not: Nsa1 SAD kümesinden phenix.autosol deneysel aşamada belirlemek ve çoğu model oluşturmak gerekir.
    3. Coot25phenix.refine22,26arıtma ardından, modeliyle manuel ayarlamalar.
    4. Yüksek çözünürlüklü yerli Ortorombik kristal ve kübik kristal yapısı moleküler yedek tarafından fazer27,28kullanarak çözmek.
    5. Model ve elektron yoğunluğu başarılı yapı çözüm sonra incelemek harita Coot25.
    6. Oluşturmak ve phenix.refine22,26 , Sakarmeke25bina modelini arıtma yinelemeli tur çalıştırarak yapılar rafine.

4. SAXS veri toplama, işleme ve modelleme

  1. SAXS veri toplama
    Not: Tam uzunlukta S. cerevisiae için SAXS veri kaydedildi, Gelişmiş ışık kaynağında yüksek üretilen iş FALCILAR beamline 12.3.1 Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı, Berkeley, CA29Nsa1.
    1. Nsa1 arındırmak yukarıda açıklanan protokol sonrasıFL . Nsa1 Sevkiyat öncesinde 24 hFL beamline, protein bir jel filtrasyon sütun üzerinde çalıştırmak için önceden dengelenmiş bir arabellek A.
    2. Nsa1 içeren kesirleri havuz ve daha önce anlatıldığı gibi protein konsantrasyonu belirlemek.
    3. Toplama serisi 1 Nsa1 6,2 mg/ml arabellek c.kullanarak 30 μl aliquots hazırlamak
    4. Nsa1 her konsantrasyon dizi 20 μl etek net tam 96 iyi Mikroplaka arabellek A yalnız denetimleri ile birlikte aktarın.
      Not: SAXS veri toplama, arası parçacık itme ve radyasyon hasarı etkileri önlemek için saflaştırılmış örnek çeşitli konsantrasyonları kullanarak sulu çözümler üzerinde toplanır.
    5. Mikroplaka sızdırmazlık mat ve gemi gecede 4 ° c beamline ile bir silikon ile kapatın.
    6. 4 ° C'de Mikroplaka veri toplama kadar saklayın.
    7. Hemen veri toplama önce 3200 x g 10 dk 4 ° C'de potansiyel toplamları kaldırmak ve hava kabarcıkları için plaka döndür.
    8. Kayıt SAXS veri.
      Not: Nsa1 için SAXS veri arabelleği için önce ve sonra her protein konsantrasyonu serisi kaydedildi. Otuz üç ardışık s Nsa1 için toplanan 0,3 taranmasınıFL 10 ° C'de bir konsantrasyon dizi (1-6,2 mg/mL) üzerinden
    9. Arabellek çıkarma SAXS veriler için gerçekleştirme.
      Not: Nsa1 için arabellek çıkarma otomatik olarak beamline yapıldı ama arabellek çıkarma dağılım30 ve31ATSAS Süiti gibi veri azaltma yazılımı kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Arabellek çıkarma SAXS veri analizi kritik bir parçasıdır ve çıkarma için kullanılan arabellek protein örnek arabellek için aynı olması için özen göstermelidir.
    10. Ortalama 33 ardışık her konsantrasyon için bir *ave.dat dosyası oluşturmak için tarar.
      Not: eğrileri karşılaştırmak için 33 ardışık kareyi yerleşimi. Saçılma eğrileri zaman içinde değişiklikler kez radyasyon hasar göstergesi. Bu kareler ortalaması üzerinden hariç. Nsa1 üst üste taranmasını ortalama FALCILAR beamline otomatik olarak gerçekleştirildi.
  2. SAXS veri işleme ve konsantrasyon serisi karşılaştırılması
    Not: SAXS verileri çözümlemek için kullanılan çeşitli yazılım paketleri vardır. Nsa1 için RADIUS eylemsizlik ve pair-wise mesafe dağıtım işlevleri tespit PRIMUS32 ve Gnom33 ATSAS 2.7.2 üzerinden kullanarak suite31 ve radyasyon yok olduğunu emin olmak için tüm protein konsantrasyonları arasında karşılaştırıldığında hasar veya konsantrasyon bağımlı arası parçacık etkileşimleri10.
    1. Bir terminal kabuğu'nu açın ve SAXS veri içeren dizine gidin.
    2. PRIMUS32 GUI üzerinden terminal kabuk içinde denize indirmek.
    3. PRIMUS GUI içinde saçılma eğrileri yüklemek (* ave.dat).
    4. Eylemsizlik yarıçapı (Rg) belirlemek ve saçılım yoğunluğu I(0), her saçılma Curve iletmek için AutoRg kullanın (* ave.dat).
    5. Kratky araziler her saçılma Curve oluşturmak (* ave.dat), anlatım derecesini değerlendirmek için.
    6. AutoGNOM33 pair-wise dağılım fonksiyonu hesaplamak için kullanın (her saçılma eğrisi için P(r)) olarak da bilinir (* ave.dat). Bir başlangıç Dmax ≈ girin 3 * Rg ve Dmax değeri düz bir P(r) eğri elde etmek için en iyi duruma getirme. Dmaxgetirilmesi sırasında hesaplanan P(r) işlevi tarafından bildirilen χ2 değeri denetleme ve görsel olarak saçılma eğriyi uydurmak genel değerlendirilmesi deneysel saçılma eğrisi ile tutarlı olduğundan emin olun.
    7. Nsa1 molekül ağırlığı korelasyon34hacmi kullanarak saçılma eğriler üzerinden hesaplamak.
    8. Yapısal parametreleri yok radyasyon hasarı veya konsantrasyon bağımlı etkileri olduğundan emin olmak için her konsantrasyon için karşılaştırın.
      Not: Konsantrasyon etkileri artan Rg ve Den fazla artan bir protein konsantrasyonu ile ilgili olarak meydana gelen. İleri I(0) örnek konsantrasyon tarafından bölünmüş saçılma da protein konsantrasyonu serisi arasında sabit kalmalıdır.
  3. SAXS modelleme
    Not: C-terminus, Nsa1 konumunu belirlemek içinFL, Nsa1 kristal yapısı10 (PDB 5SUM) ve SAXS saçılma eğrileri bir arada katı vücut ve modelleme, grup programları kullanarak ab initio taşımak için kullanılan 35 ve Ensemble optimizasyonu yöntemi (EOM)36 ATSAS yazılım Süiti31. Deneysel SAXS verileri sığdırmak için C-terminus, Nsa1 ile birlikte çeşitli düzensiz döngüler WD40 etki alanından örnek alınarak iken Nsa1 WD40 etki katı bir organ olarak tedavi edildi.
    1. Giriş PDB dosya (lar) oluşturur. PDB dosyasını her zaman artıkları arasındaki ana zinciri eksik ve PDB dosyasını içeren birden fazla biçimler, ligandlar, ya da su molekülleri bölmeniz gerekir.
    2. Grup (pre_bunch.pdb) için giriş PDB dosyasını hazırlamak için Pre_BUNCH35 programını çalıştırın. Hedef protein (*.seq), etki alanları/PDB 4.3.1 içinde oluşturulan sayısını dizisi giriş ve bireysel PDB dosyalarının her birinin yukarıda oluşturulan.
    3. Her bireysel PDB dosyasını programda CRYSOL37saçılma genlikleri hesaplayın. CRYSOL çalıştırmak için bireysel PDB dosyasını ve deneysel SAXS saçılma eğrisi (*.dat) giriş. Bu bir genlikleri dosyası oluşturur (* .alm).
    4. Program grup35 Nsa1 WD40 etki alanı karşı Birleşik bir katı vücut ve ab initio yaklaşım kullanarak SAXS veri modeli için çalıştırın. Girdi PDB dosyasını Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb) üzerinden, deneysel SAXS saçılma eğrisi (*.dat) ve bireysel genlik (* .alm) CRYSOL tarafından oluşturulan her kısmi PDB dosyası için dosyaları.
    5. Başlangıç PDB (5SUM) χ2 değerinden modelinden deneysel SAXS verileri kullanarak grup tarafından oluşturulan ab initio bununla karşılaştırırsınız.
      Not: Başarılı bir grup model başlangıç modeli daha önemli ölçüde daha düşük χ2 değeri olmalıdır. Grup modeli teorik saçılma Ayrıca de deneysel veriler arasında grup modeli SAXS verilere teorik saçılma ve χ2 değerini (şekil 4, düzeninin görsel denetim tarafından karar olarak açıklamalıdır Merkezi boru hattı).
    6. Grup ve SAXS zarf (şekil 4, Merkezi boru hattı) tarafından oluşturulan modeli ile kristal yapısı yerleşimi için Pymol38 grup üzerinden çıktı dosyalarında el ile kontrol edin.
    7. Grup 10 - 20 kez yeniden çalıştırın modelleri benzer olduğunu doğrulamak için bağımsız modelleri oluşturmak için.
      Not: Nsa1 için χ2 değerleri ~ 1 3 20 bağımsız çalışan bir dizi vardı.
    8. Ensemble modelleme
      Not: bir isteğe bağlı bir yaklaşım grup EOM36 veya Minimal Ensemble arama39 (MES) çalıştırın. EOM ve MES proteinler ile birden fazla biçimler esnek etki alanları/bölgeler için uygundur ensemble yaklaşımları kullanın.
      1. EOM36 ATSAS online server kullanarak programı çalıştırın. EOM çalıştırmak için 4.3.1, hedef protein (*.seq) ve deneysel SAXS veri (*.dat) dizisi PDB dosyalarından girdi.
      2. Başlangıç PDB (5SUM) χ2 değerleri ile deneysel SAXS verileri kullanarak EOM tarafından oluşturulan topluluk karşılaştırmak.
        Not: Başarılı bir EOM topluluğu başlangıç modeli daha önemli ölçüde daha düşük χ2 değeri olmalıdır. Teorik saçılma Ensemble Ayrıca de deneysel veri SAXS veri topluluk teorik saçılma ve χ2 değerini (şekil 4, sağ arasında düzeninin görsel denetim tarafından karar olarak açıklamalıdır boru hattı). Bir de grup ve EOM hangi modeli en iyi deneysel SAXS verileri tanımlayan belirlemek için χ2 değerleri karşılaştırmak gerekir.
      3. El ile EOM conformers Pymol38 kristal yapısı ile EOM (şekil 4) tarafından oluşturulan conformers yerleşimi kontrol edin. Conformers toplam sayısı ve doluluk kısmını saçılma eğrisi için katkıda bulunan her conformer için dikkat edin. Nsa1 gibi daha sert molekülleri conformers sayısı küçük olmalıdır (1-5) (şekil 4, doğru boru hattı)36.
      4. EOM yeniden çalıştırmak tutarlı sonuçlar sağlamak için birkaç kez.
        Not: Nsa1 için conformers sayısı genellikle 3-4 0,1 0,3 için değişen χ2 değerleri ile oldu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Nsa1 S. cerevisiae genomik DNA'güçlendirilmiş ve ardından MBP ve TEV proteaz site bir N-terminal 6 x-histidin benzeşme etiketi içeren bir vektör içine subcloned PCR yapıldı. Nsa1 E. coli BL21(DE3) hücrelere dönüştü ve yüksek verim protein ifade aşağıdaki IPTG ile indüksiyon ve 25 ° c gece (şekil 1A) büyüme elde edilmiştir. Nsa1 benzeşme saf üzerinde immobilize kobalt benzeşme reçine, MBP bölünme TEV proteaz ile...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu iletişim kuralını kullanan, rekombinant Nsa1 S. cerevisiae gelen yapısal çalışmaları için x-ışını kristalografisi ve SAXS tarafından oluşturuldu. Nsa1 çözümde su kuyusu-davranmak ve kristal yükseltgen kristalize. Bu kristaller en iyileştirme sırasında C-terminus Nsa1, proteaz düşmesine duyarlı keşfedilmiştir. Yüksek çözünürlüklü Ortorombik kristal formu sadece çoğaltılamaz C-terminal kesme türevleri Nsa1, büyük olasılıkla ile esnek C-terminus Nsa1, kristal ambalaj eng...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Kırınım veri Güneydoğu bölgesel işbirliği Access ekibi (SER-CAT) 22-ID ve 22-BM beamlines, Gelişmiş foton kaynak (APS), Argonne Ulusal Laboratuvarı, toplanmıştır. SAXS veri FALCILAR beamline, önceden ışık kaynağı (ALS), Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı üzerinde toplandı. FALCI beamline onların yardımıyla uzak veri toplama ve işleme için personel teşekkür etmek istiyorum. Ulusal çevre sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) kütle spektrometresi araştırma ve destek grubu için protein etki alanı sınırları belirleme konusunda yardım için sana şükrediyoruz. Bu eser bize Ulusal Enstitüsü, sağlık Intramural araştırma programı tarafından desteklenen; ABD Ulusal Enstitüsü çevre sağlığı Bilimleri (NIEHS) (R. E. S. için Ziya ES103247) ve sağlık araştırması (CIHR, 146626 M.C.P için) Kanadalı Enstitüleri. APS kullanımı bize Enerji Bakanlığı, bilim Office, Office temel Enerji Bilimler altında Sözleşme No Filtresi tarafından desteklenen yapıldı. W-31-109-Eng-38. Kullanım gelişmiş ışık kaynağı (ALS) Yönetmen, bilim Office, Office temel Enerji Bilimler, Sözleşme No altında ABD Enerji Bakanlığı tarafından desteklenmiştir DE-AC02-05CH11231. Ek destek FALCILAR SAXS beamline Ulusal Sağlık Enstitüsü gelir için project MINOS (R01GM105404) ve bir yüksek-son araçları Grant S10OD018483. Biz de Andrea ay ve Dr Sara Andres Bu el yazması onların eleştirel okuma için teşekkür etmek istiyorum.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vectorSheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNAATCC204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFwIDTCGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRvIDTAATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFwIDTGGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRvIDTGATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star CellsInvitrogenC601003
pMBP- NSA1 and various truncationsLo et al., 2017
SelenomethionineMolecular DimensionsMD12-503B
IPTG, Dioxane-FreePromegaV3953
EDTA Free Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich4693159001
Sodium ChlorideCaledon Laboratory Chemicals7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrateSigma-AldrichM2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5KD MedicalRGF-3340
GlycerolInvitrogen15514-029
beta-mercaptoethanolSigmaM6250
1M Imidazole, pH 8.0TeknovaI6980-06
Talon Affinity ResinClonetech635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K)MilliporeUFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration ColumnGE-Healthcare28989335
TEV ProteasePrepared by NIEHS Protein Expression CoreExpression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBioRad456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal ScreenHampton ResearchHR2-110
Crystal Screen 2Hampton ResearchHR2-112
Salt RxHampton ResearchHR2-136
Index ScreenHampton ResearchHR2-144
PEG/Ion ScreenHampton ResearchHR2-139
JCSG+Molecular DimensionsMD1-37
Wizard Precipitant SynergyMolecular DimensionsMD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop platesTTP Labtech4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing TapeHampton ResearchHR4-506
Proti-Ace KitHampton ResearchHR2-429
PEG 1500Molecular DimensionsMD2-100-6
PEG 400Molecular DimensionsMD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5Molecular DimensionsMD2-011-
Sodium Citrate tribasicMolecular DimensionsMD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized CoverslidesHampton ResearchHR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant)Hampton ResearchHR3-172
18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM)Hampton ResearchHR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead KitHampton ResearchHR2-320
Magnetic Crystal CapsHampton ResearchHR4-779
Magnetic Cryo WandHampton ResearchHR4-729
Cryogenic Foam DewarHampton ResearchHR4-673
Crystal Puck SystemMiTeGenM-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear PlateVWR10011-228
AxyMat Sealing MatVWR10011-130
Equipment
UVEX-mJAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite SpectrophotometerThermo-Fisher
Mosquito RobotTTP Labtech
Software/Websites
HKL2000Otwinoski and Minor, 1997
PhenixAdams et al., 2010
CootEmsley et al., 2010
ATSASPetoukhov et al., 2012https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
ScatterRambo and Tainer, 2013
PymolThe PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCHPetoukhov and Svergun, 2005
CRYSOLSvergun et al, 1995
PRIMUSKonarev et al, 2003
EOMTria et al, 2015

Referanslar

  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells - focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516(2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. Schrödinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8. , Available from: https://pymol.org (2015).
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431(2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103(2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyokimyasay 131x n kristalografisiSAXShibrid y ntemleriProtein safla t rmaWD40 etki alans n rl proteolizisribozom derleme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır