АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот метод описывает клонирования, выражения и очистки рекомбинантных Nsa1 для определения структурных рентгеноструктурного анализа и малым угол рентгеновского рассеяния (лучей) и применим для гибридных структурный анализ других белков содержащие оба заказал и неупорядоченных доменов.

Аннотация

Определение структуры полнометражного рибосома Ассамблеи фактора Nsa1 от Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) является сложной задачей из-за неупорядоченных и протеазы лабильной C-конечная белка. Эта рукопись описывает методы для очистки рекомбинантных Nsa1 от S. cerevisiae для структурного анализа рентгеноструктурного анализа и лучей. Рентгеноструктурного анализа был использован для решения структуры упорядоченный WD40 N-концевой домен Nsa1, а затем лучей был использован для устранения структуры C-конечная Nsa1 в растворе. Решение рассеяния данные были собраны из полнометражных Nsa1 в растворе. Теоретические рассеяния амплитуд были рассчитаны с высоким разрешением кристаллической структуре WD40 домена, а затем сочетание твердого тела и ab initio моделирования показала C-конечная Nsa1. Через этот гибридный подход был реконструирован Четвертичная структура всей белка. Представленные здесь методы должны быть общеприменимыми для гибридных структурные определения других белков, состоящий из смеси структурированных и неструктурированных доменов.

Введение

Рибосомы являются большие рибонуклеопротеида машины, которые осуществляют важную роль перевода мРНК на белки во всех живых клетках. Рибосомы состоят из двух субъединиц, которые производятся в рамках сложного процесса, называют рибосома биогенеза1,2,3,4. Эукариотические рибосомы Ассамблея полагается на помощь сотни основных рибосомных Ассамблеи факторов2,3,5. Nsa1 (Nop7 связанные 1) является фактором Ассамблеи Эукариотические рибосомы, что конкретно требуется для производства большой субъединицы рибосомальной6, и это известный как WD-повторяю, содержащий 74 (WDR74) в высших организмов7. WDR74 было показано, для формирования бластоцисты в мышей8и промоутер WDR74 часто мутирует в раковых клетках9. Однако функция и точных механизмов Nsa1/WDR74 в Ассамблее рибосомы по-прежнему в основном неизвестны. Чтобы начать раскрыть роль Nsa1/WDR74 во время созревания Эукариотические рибосомы, несколько структурные анализы, включая рентгеноструктурного анализа и малоуглового рентгеновского рассеяния (лучей)10.

Рентгеноструктурного анализа, ядерного магнитного резонанса (ЯМР) спектроскопии, электронной микроскопии и лучей являются все важные методы для изучения макромолекулярной структуры. Размер, форма, доступность и стабильность макромолекул воздействий структурной биологии метод, для которого особенно макромолекулы будет лучше подходит, однако сочетая несколько методов через так называемый «гибридный» подход становится 11все более полезным инструментом. В частности рентгеноструктурного анализа и лучей являются мощными и взаимодополняющие методы структурной определения макромолекул12.

Кристаллография обеспечивает высоким разрешением атомных структур, начиная от маленьких молекул до больших клеточными как рибосомы и привела к многочисленным прорывам в понимании биологических функций белков и других 13макромолекул. Кроме того на основе структуры наркотиков дизайн использует власть кристаллических структур молекулярного стыковки, вычислительные методы, добавление критическое измерение наркотиков открытие и развитие14. Несмотря на его широкую применимость гибкие и неупорядоченных систем сложно оценить, кристаллография, так как кристалл упаковка может быть затруднено или карт плотности электронов может быть неполным или низкого качества. И наоборот лучей является на основе решения и разрешением структурный подход, способный описания гибких систем, начиная от неупорядоченных петель и Термини неразрывно неупорядоченных белки12,,1516. Учитывая, что это совместимо с широкий спектр частиц размерами12, лучей может работать синергически с кристаллографии расширить спектр биологических вопросов, которые могут быть рассмотрены структурные исследования.

Nsa1 подходит для гибридных структурный подход, потому что она содержит структурированный WD40 домена следуют функциональный, но гибкие C-конечная, которая не поддается методы рентгеноструктурного анализа. Ниже — это протокол для клонирования, выражения и очистки Nsa1 S. cerevisiae для гибридных структурные определения рентгеноструктурного анализа и лучей. Этот протокол может быть адаптирована для изучения структур других белков, которые состоят из комбинации упорядоченной и неупорядоченной регионов.

протокол

1. Рекомбинантный белок производства и очистки НГБ 1

  1. Nsa1 выражение плазмида дизайн и клонирование
    1. Получить или приобрести S. cerevisiae геномной ДНК.
    2. ПЦР усилить целевой последовательности Nsa1 (Nsa1FL, остатки 1-463) и C-терминал усечена Nsa1 (Nsa1ΔC, остатки 1-434) с соответствующей грунтовки с использованием геномной ДНК, изолированный от S. cerevisiae и температуры плавления приблизительно 60 ° C с расширение время 1-2 мин. Следующие грунтовки были использованы для того чтобы усилить Nsa1:
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC
    3. Subclone Nsa1 в pHMBP вектора выражения Escherichia coli (E. coli) , содержащие N-терминальный 6 X-гистидина следуют мальтоза привязки белка (MBP) и сайта протеазы вируса Etch табака (TEV) с использованием стандартных методов клонирования17 .
    4. Для проверки, что Nsa1 был клонирован в рамке с тегом его MBP N-терминальный используйте секвенирования ДНК.
  2. Выражение протеина Nsa1
    1. Преобразовать выражение plasmid(s) в подходящей E. coli выражение штамм с системой на основе промоутер T7. Пластина трансформантов на плиты агара LB, содержащие 100 мкг/мл Ампициллин и инкубировать пластину, перевернутый на ночь при 37 ° C.
    2. Прививок 50 мл культуры LB с 100 мкг/мл ампициллин от преобразования пластины и вырастить его на ночь с встряхивания на 200 об/мин при температуре 37 ° C.
    3. Прививок 3 x 1000 мл фунтов в Fernbach колбы с 100 мкг/мл ампициллин с 15 мл на ночь культуры и расти с встряхивания на 200 об/мин при температуре 37 ° C.
      Примечание: Для решения структуры белка, selenomethionyl (SeMet) включение может быть достиган растущих клеток в минимальный средний M9, дополняется SeMet и смеси аминокислот для ингибирования метионина производства до индукции, в отличие от LB СМИ 18.
    4. Побудить выражение Nsa1 когда ОД600 достигает ~0.8 добавлением изопропиловый тиогалактопиранозид β-D-1 (IPTG) в конечной концентрации 1 мм, после чего инкубации при 25 ° C ночь с встряхивания на 200 об/мин.
    5. Урожай клетки центрифугированием при 4 ° C на 15 мин на 5050 x g.
      Примечание: Клетки могут храниться долгосрочный-80 ° c или сразу же используется для очистки белков.
  3. Nsa1 очищение протеина
    1. Ресуспензируйте клетки в 25 мл буфера Lysis (50 мм трис-HCl, pH 7.5, 500 мм NaCl, 10% глицерина, 10 мм MgCl2) предварительно охлажденным при 4 ° C, содержащие одну таблетку ингибитор протеазы ЭДТА бесплатно.
    2. Лизировать клетки по sonication на 4 ° C (время 7 мин, 2 s на цикл, 2 s вне цикла; амплитуды: 70%).
    3. Уточнить lysate центрифугированием на 26 900 x g 45 мин при 4 ° C.
    4. Применить уточнил lysate к столбцу потока тяжести загружен с 10 мл иммобилизованных кобальта сродство смолы, предварительно достижение равновесного уровня с буфера Lysis.
    5. Разрешить супернатант мимо самотечный поток на 4 ° C над смолаой и мыть смолы дважды с 100 мл буфера Lysis.
    6. Элюировать Nsa1 с 20 мл буфера (50 мм трис-HCl рН 7,5, 500 мм NaCl, 5 мм MgCl2, 5% глицерина и имидазола 200 мм).
    7. Возьмите 15 мкл элюата и запустить его на геля SDS-PAGE 4-15% для проверки, что белок этого eluted от схожести смолы (рис. 1A).
    8. Удалите тег MBP ТэВ протеазы пищеварение. Добавьте 1 mL ТэВ протеазы19 (1 мг/мл бульона) для элюции смолы Nsa1 сходства и проинкубируйте его на 4 ° C на ночь.
    9. Концентрат MBP расщепляется Nsa1 в ~ 5 мл с помощью центробежного фильтра с молекулярной массой cut off 10 кДа.
    10. Применить расщепляется MBP Nsa1 к столбцу гель фильтрации, предварительно достижение равновесного уровня в буфере (20 мм трис-HCl pH 7.5, 100 мм NaCl, 1 мм MgCl2, 5% глицерина и 1 мм β-меркаптоэтанол) (рис. 1B).
    11. Анализ столбец фракций от фильтрации геля для проверки что MBP расщепляется и отделяется от Nsa1, запустив 15 мкл образцов на геля SDS-PAGE 4-15% (рис. 1B).
    12. Объединить фракций, содержащих Nsa1 и сосредоточиться на 8 мг/мл, с помощью центробежного фильтра с молекулярной массой, cut off 10 кДа.
    13. Определить концентрацию протеина путем измерения поглощения в 280 Нм на спектрофотометр с помощью вымирания коэффициент 42530 М–1cm–1. Немедленно используйте белка для протеолитических процессов скрининг и кристаллизации.

2. кристаллизации и протеолитических скрининг НГБ 1

  1. Разреженная матрица кристалл скрининга Nsa1
    1. Центрифуга 500 мкл 8 мг/мл акций Nsa1 на 16000 x g при 4 ° C на 10 мин.
    2. Установки испытания кристаллизации, с использованием робота кристаллизации и разреженных матриц кристалл экраны. Заполните водохранилище 96 хорошо лотков с 30 мкл индивидуального кристалла экран реагентов из разреженных матриц экранов кристаллизации. Настройка сидя капли с роботом, смешивая 250 nL хорошо решения с 250 nL раствора белка.
    3. Уплотнение кристаллизации пластины с лентой и инкубировать их в 25 ° C.
    4. Осмотрите пластины каждые два дня в первые 2-3 недели с стереомикроскопом.
    5. Убедитесь, что потенциальные кристаллы хитов содержат белок с микроскопом УФ.
      Примечание: Для двух разных кристалл форм Nsa1 (кубический и ромбическая, рисунок 2A) были получены в течение 1 недели от следующих экранов: JCSG + условие B11 (1,6 М tribasic цитрат натрия дигидрат, рН 6,5) и мастер осадителя Синергия экран блок 2 условие C11 (20.1%(v/v) ПЭГ-1500, 13.4%(v/v) КОЛЫШЕК 400, 0,1 М Tris HEPES натрия гидроксид, рН 7,5).
  2. Протеолитических скрининг
    Примечание: Во время оптимизации кристаллизации, было обнаружено, что ромбическая кристаллы Nsa1 возникли в результате протеолитического расщепления и не должны дублироваться кристаллы с использованием полнометражных протеинов. Используя сочетание ограниченного протеолиза, в сочетании с масс-спектрометрии, было установлено, что C-конечная Nsa1 был чувствителен к Протеолиз и удаления хвоста C-терминала требуется для последующего размножения (форма ромбическая кристалл Nsa1ΔC).
    1. Подготовка 1 мг/мл протеазы акций решения следующих протеаз α-химотрипсин, трипсин, эластазы, папаин, Субтилизин и endoproteinase Glu-C.
    2. Создание 1:10, 1: 100 и 1: 1000 разведений протеазы акций каждого 1 мг/мл с буфером для разбавления проб (10 мм HEPES, рН 7,5, хлорид натрия 500 мм).
    3. Пипетка 1 мкл акций протеазы (1:10, 1: 100 и 1: 1000) в 9 мкл аликвоты белка (1 мг/мл) для каждого протеазы пройти обследование.
    4. Инкубируйте решение при 37 ° C в течение 1 ч.
    5. Остановить реакции путем добавления 10 мкл буфера выборки SDS-PAGE 2 x и тепла реакции на 95 ° C за 5 мин.
    6. Анализировать digests, запуская их на геля SDS-PAGE 4-15% (рис. 2B).
    7. Идентифицировать протеазы устойчивостью домены целевого белка анализа в гель масс-спектрометрии.
    8. Удаление протеаз лабильного областей из целевого белка путем создания усеченного выражение конструкции и после клонирования, выражение и очистки протокол, описанных выше.
  3. Кристаллизация оптимизация
    1. Подготовка или получать складе решения следующих реагентов первоначальный кристаллизации: 1,6 М tribasic цитрат натрия дигидрат рН 6,5, 100%(v/v) ПЭГ-400, 50%(v/v) КОЛЫШЕК 1500, HEPES натрия гидроксид 1м, рН 7,5.
    2. Подготовить Стоковый раствор Nsa1ΔC FL и Nsa1 на 8 мг/мл, как описано выше.
    3. Оптимизация Nsa1 кубических кристаллах (Nsa1FL).
      1. Подготовьте экран 24-ну сетки скважин, содержащий 500 мкл с уклоном 1-1,6 М цитрата натрия с рН 6,5 от Стоковый раствор цитрата натрия 1,6 М tribasic с рН 6,5.
      2. Смешайте 1 мкл белка с 1 мкл хорошо решения и место смесь на силиконизированной крышка слайд. Тщательно инвертировать слайд крышка сверху предварительно смазанную хорошо и убедиться, что он хорошо закрытой, но будьте осторожны, чтобы не нарушить падение или сломать крышку слайд. Повторите этот процесс до тех пор, пока лоток заполнен и затем хранить при температуре 25 ° C.
        Примечание: Маленькие кубические кристаллы должны появиться в 2-7 дней.
      3. Подготовьте запас microseed кубических кристаллов. Используйте цикл навесные нейлона для передачи небольших кубических кристаллов ~ 10 1,5 мл микро пластиковых пробирок, содержащий небольшой шарик и 50 мкл 1,6 М цитрат натрия tribasic Вит рН 6,5.
      4. Вортекс микро пластиковых пробирок 1.5 мл на высокой скорости (~ 3000 об/мин) за 1 мин.
      5. Сделать серию десятикратного серийных разведений семенного фонда с tribasic цитрат натрия 1,6 М и вихревой смесь тщательно для 5 s.
      6. Заполните каждый хорошо из 24-ну сетки, экран с 500 мкл 1,6 М цитрат натрия tribasic рН 6,5.
      7. Оптимизация условий microseeding путем создания капель с различной соотношения белков с решениями семенного фонда (Рисунок 3А). Крупных кубических кристаллов высокой дифракционного качества должны появиться в течение 2-5 дней (рис. 3 c).
    4. Оптимизировать ромбическая кристаллов (Nsa1ΔC)
      1. Подготовьте экран сетки с 500 мкл в каждой скважине с 24 различных условиях (рис. 3B) из запасов растворов 50%(v/v) ПЭГ-1500 и 100%(v/v) КОЛЫШЕК 400. В дополнение к градиенты PEG 1500 и ПЭГ-400 каждый хорошо также должен содержать 0,1 М HEPES натрия гидроксид рН 7,5.
      2. Смешайте 1 мкл раствора белка с 1 мкл хорошо раствора на слайде силицированного покрытия. Тщательно инвертировать слайд крышка сверху предварительно смазанную хорошо и убедиться, что он хорошо закрытой. Повторите этот процесс до тех пор, пока весь лоток был заполнен. Хранить лотков при 25 ° C.
        Примечание: Nsa1 ромбическая кристаллы должны появиться в 2-7 дней.
      3. Дальнейшей оптимизации ромбическая кристаллы, microseeding, как описано для кубических кристаллах (шаги 2.3.3.3 в 2.3.3.7) с использованием 500 мкл 20.1%(v/v) ПЭГ-1500, 13.4%(v/v) КОЛЫШЕК 400 и 0,1 М HEPES натрия гидроксид pH 7.5 как хорошо решение.
        Примечание: Nsa1 SeMet кристаллы должны быть оптимизированы аналогичен родной кристаллов.

3. рентгеновская дифрактометрия сбора данных и НГБ 1 структура решения

  1. Крио защиты кристаллов и сбора данных рентгеновской дифракции
    1. Ромбическая кристаллов (Nsa1ΔC), подготовить 1 мл криопротектора раствор, содержащий 22.5%(v/v) ПЭГ-1500, 15%(v/v) КОЛЫШЕК 400 и 0,1 М HEPES натрия гидроксид рН 7,5.
    2. Заполнить пены Дьюара с жидким азотом и предварительно охладить шайбу кристалл. Соблюдайте осторожность при работе с жидким азотом и надевайте защитные перчатки и защитные очки.
    3. Осторожно переверните слайд крышка хорошо содержащие кристаллов на сцену стереомикроскопом кристаллизации.
    4. Пипетка 2 мкл раствора криопротектора на новый слайд крышка.
    5. Придаем навесные нейлон цикла соответствующего размера для кристалла крио магнитной палочки.
    6. Использование помощи стереомикроскопом, быстро передавать кристалл криопротектора решение с крио навесные петли.
    7. Пусть сбалансировать за 5 мин в решении криопротектора кристалл.
    8. Быстро используя помощь стереомикроскопом, цикл кристалла от криопротектора решение и Плунге замораживание в жидком азоте.
    9. Ждать для жидкого азота вокруг цикла остановить кипящей и затем отпустите цикла от палочки в конкретное расположение в кристалл шайбу.
    10. Кубический Nsa1FL кристаллы не нужно быть cryoprotected и может быть непосредственно флэш замороженных (следующие шаги 3.1.8-3.1.9 выше).
    11. Печать кристалл шайбу с помощью инструментов крио и передачи для доставки тростника в предварительно охлажденные Дьюара. Хранить кристаллы в шайбы/сосуды Дьюара до сбора данных.
    12. Если сбор данных в синхротрон, корабль кристаллы синхротрон, с использованием сухой грузоотправителя.
    13. Сбор данных рентгеновской дифракции, после20стандартных методов.
      Примечание: Для Nsa1 родной и сад наборы данных (одной длины волны аномальных дисперсия) были собраны в 100 K на линии пучка SER-CAT 22-ID и 22-BM Advanced Фотон источника в Аргоннской национальной лаборатории (Чикаго, Иллинойс). Сад Nsa1 набора данных была собрана на λ = 0.97911 Å. Данные был записан с использованием 1 s выдержка и 0,5 ° колебания. Mosaicity эти кристаллы обычно был около 0,3 °.
    14. Процесс и масштаба дифракции рентгеновских изображений для создания отражения файлов для каждого набора данных в группе соответствующие пространства.
      Примечание: Nsa1 дифракция наборы были обработаны с HKL200021. Кубические кристаллы Nsa1 были обработаны в пространство группы P213 и ромбическая кристаллы обрабатывались в пространство группы P212121.
  2. Nsa1 структуры решения.
    Примечание: Существует несколько кристаллографии пакетов программного обеспечения, которые могут использоваться для решения и уточнения кристаллических структур, включая Феникс и CCP422,23. Ниже приводится протокол для Nsa1 структуры с помощью Phenix программного обеспечения люкс22.
    1. Анализа наборов данных с phenix.xtriage22масштабирования родной и сад.
    2. Решите структуры Nsa1 с использованием ПЕЧАЛЬНО пик отражение файла22,24Phenix.autosol. Для запуска программы АУТОСОЛ, введите количество селенометионина сайтов (сайтов = 9), файл последовательности fasta Nsa1ΔC, и волны, используется для сбора данных ГРУСТНО (λ = 0.97911 Å).
      Примечание: В наборе Nsa1 Сад, phenix.autosol должны быть в состоянии определить экспериментальной фазы и построить большую часть модели.
    3. Сделать ручной корректировки модели с Лысуха25, следуют изысканности в phenix.refine22,26.
    4. Решите структуру высокого разрешения родной ромбическая кристалл и кубический кристалл, молекулярные замены с помощью Phaser27,28.
    5. После успешного структуру раствора, проверить модель и плотности электронов карта в Лысуха25.
    6. Создавать и совершенствовать структуры, запустив итеративный раундов изысканности в модель здания в Лысуха25и22,phenix.refine26 .

4. лучей сбора, обработки и моделирования данных

  1. Сбор данных лучей
    Примечание: Лучей данные были записаны для полнометражных S. cerevisiae Nsa1 на расширенный источник света, на излучение СИБИЛЛЫ высок объём 12.3.1 в национальной лаборатории Лоуренса Беркли, Беркли, Калифорния29.
    1. Очистить Nsa1FL протоколом, описанных выше. 24 часа до начала перевозки Nsa1FL на излучение, пробегают столбец фильтрации геля протеина предварительно достижение равновесного уровня в буфере A.
    2. Бассейн фракций, содержащих Nsa1 и определить концентрацию белка, как описано выше.
    3. Подготовка 30 мкл аликвоты концентрации серии Nsa1 от 1 до 6,2 мг/мл, используя буфер а.
    4. 20 мкл каждого концентрации серии Nsa1 передать ясно юбкой 96 хорошо Гонав наряду с буфера A только элементы управления.
      Примечание: Лучей данные собираются на растворы с помощью нескольких концентрации очищенный образца во избежание агрегации, межчастичных отталкивание и повреждения радиации.
    5. Уплотнение микропланшетов с силиконовой уплотнения мат и корабль на ночь при 4 ° C на излучение.
    6. Храните микроплиты на 4 ° C до сбора данных.
    7. Непосредственно перед сбором данных спина пластину на 3200 x g 10 мин при температуре 4 ° C для удаления возможных агрегатов и пузырьков воздуха.
    8. Данные записи лучей.
      Примечание: Для Nsa1, лучей данные были записаны для буфера до и после каждой серии концентрация белка. Тридцать три последовательных сканирований 0.3 s были собраны для Nsa1FL над серией концентрации (1 до 6,2 мг/мл) при 10 ° C.
    9. Выполните вычитание буфера для данных лучей.
      Примечание: Для Nsa1 буфер вычитание было сделано автоматически на излучение, но буфер вычитание также могут быть выполнены с помощью программного обеспечения сокращения данных например, разброс30 и ATSAS люкс31. Вычитание буфера является важной частью анализа данных лучей и уход должны приниматься для обеспечения что буфер, используемый для вычитания идентичен буфер образца протеина.
    10. Средняя 33 подряд сканирует для создания *ave.dat файла для каждой концентрации.
      Примечание: Наложение 33 последовательных кадров для сравнения кривых. Изменения в кривых рассеяния со временем часто свидетельствует о радиационных повреждений. Исключите эти кадры из усреднения. Усреднение проверки подряд Nsa1 была выполнена автоматически на излучение СИБИЛЛЫ.
  2. Обработка данных лучей и сравнение концентрации серии
    Примечание: Существует несколько пакетов программного обеспечения, которые могут использоваться для анализа данных лучей. Для Nsa1 Радиус инерции и функций распределения попарного расстояния были определены с помощью PRIMUS32 и33 гном из ATSAS 2.7.2 люкс31 и сравнивать по все концентрации белка для обеспечения там был без радиации повреждение или зависящих от концентрации межчастичных взаимодействий10.
    1. Откройте оболочку терминал и перейдите в каталог, содержащий данные лучей.
    2. Запуск PRIMUS32 GUI из в оболочке терминала.
    3. В PRIMUS GUI, загрузить кривые рассеяния (* ave.dat).
    4. Использование AutoRg для определения радиуса инерции (Rg) и вперед рассеяния света I(0), для каждой кривой рассеяния (* ave.dat).
    5. Генерировать Kratky участков для каждой кривой рассеяния (* ave.dat), для оценки степени компактности.
    6. Использование AutoGNOM33 для вычисления попарного распространения функция (также называется P(r)) для каждой кривой рассеяния (* ave.dat). Введите начальный DМакс ≈ 3 * Rg и оптимизировать D значениеmax для получения гладкой кривой P(r). Во время оптимизации DМаксубедитесь, что расчетные P(r), функция согласуется с экспериментальной рассеяния кривой, установив значение сообщил χ2 и визуально оценки общего подходят к кривой рассеяния.
    7. Вычислите молекулярный вес Nsa1 от рассеяния кривых с помощью объем корреляции34.
    8. Сравните структурных параметров для каждой концентрации, чтобы обеспечить, что не существует радиационного повреждения или концентрации зависимых эффектов.
      Примечание: Концентрация эффекты могут проявляться как увеличение Rg и DМакс по отношению к растущей концентрации белка. Вперед рассеяния I(0), деленное на концентрации образца также должны оставаться неизменными через серии концентрация белка.
  3. Моделирование лучей
    Примечание: Чтобы определить положение C-конечная Nsa1FLNsa1 кристалл структура10 (PDB 5SUM) кривых рассеивания лучей были использованы и осуществлять сочетание твердого тела и ab initio моделирование, с помощью программ куча 35 и ансамбль метод оптимизации (МНВ)36 от ATSAS комплект программного обеспечения31. WD40 домен Nsa1 рассматривалась как твердого тела, в то время как C-конечная Nsa1 наряду с несколько неупорядоченных петли с WD40 домена были смоделированы в соответствии с экспериментальными данными лучей.
    1. Создайте входной файл PDB. PDB-файл должен разделить каждый раз остатков отсутствуют от основной цепи, и PDB-файл не может содержать несколько конформации, лиганды, или молекул воды.
    2. Запустите программу35 Pre_BUNCH подготовить входной файл PDB для кучу (pre_bunch.pdb). Ввод последовательности целевого белка (*.seq), количество доменов/PDB-файлы создаются в 4.3.1, и каждый из отдельных файлов PDB создается выше.
    3. Рассчитайте амплитуды рассеяния для каждого индивидуального PDB-файл с помощью программы CRYSOL37. Для запуска CRYSOL ввода отдельного файла PDB и экспериментальной кривой рассеивания лучей (*.dat). Это создаст файл амплитуд (* .alm).
    4. Запуск программы кучу35 для моделирования WD40 домен Nsa1 против лучей данные с помощью комбинированных жесткие тела и ab initio подход. Ввод PDB-файл из Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb), экспериментальной кривой рассеивания лучей (*.dat) и отдельных амплитуды (* .alm) файлы для каждого частичного PDB-файл, созданный CRYSOL.
    5. Сравните значение χ2 от начала PDB (5SUM) с этим от модели ab initio , порожденных букет с использованием экспериментальных данных лучей.
      Примечание: Успешная модель ПУЧОК должен иметь значительно меньшее значение χ2 , чем начальная модель. Теоретические рассеяния куча модели следует также описать хорошо экспериментальных данных как рассужено путем визуального осмотра перекрытия между теоретической рассеяния куча модели к данным лучей и его значением χ2 (рис. 4, центр трубопровода).
    6. Вручную проверьте файлы вывода из СГУСТКА в38 Pymol наложить Кристаллическая структура с моделью, генерируемые СГУСТКА и лучей конверт (рис. 4, центр трубопровода).
    7. Повторно запустите кучу 10 - 20 раз для создания независимых моделей, чтобы подтвердить, что эти модели схожи.
      Примечание: Для Nsa1 было диапазона значений χ2 ~ 1 до 3 из 20 независимых запусков.
    8. Ансамбль моделирование
      Примечание: как факультативный подход к СГУСТКА, МНВ36 или минимальный ансамбль поиск39 (MES). МНВ и MES использовать ансамбль подходы, которые хорошо подходят для белков с гибкой домены/регионов, которые находятся в нескольких конформации.
      1. Запустите программу МНВ36 с помощью онлайн сервера ATSAS. Чтобы запустить МНВ, ввод PDB-файлы от 4.3.1, последовательность целевого белка (*.seq) и экспериментальных данных лучей (*.dat).
      2. Сравните значения χ2 от начала PDB (5SUM) с этим от ансамбль, созданный с использованием экспериментальных данных лучей МНВ.
        Примечание: Успешное МНВ ансамбль должен иметь значительно меньшее значение χ2 , чем начальная модель. Теоретические рассеяния ансамбля должны также описать хорошо экспериментальных данных как рассужено путем визуального осмотра перекрытия между теоретической рассеяния ансамбля к данным лучей и его значением χ2 (рис. 4, право конвейер). Один должен также сравнить χ2 значения из СГУСТКА и МНВ, чтобы определить, какая модель лучший описывает экспериментальных данных лучей.
      3. Вручную проверяйте конформеров МНВ в Pymol38 для наложения Кристаллическая структура с конформеров, порожденных МНВ (рис. 4). Обратите внимание, общее количество конформерам и часть размещение для каждого конформером, что способствует рассеяния кривой. Для более жесткой молекул, таких как Nsa1, количество конформеров должна быть небольшой (1-5) (рис. 4, справа трубопровода)36.
      4. Повторный запуск МНВ несколько раз, чтобы гарантировать согласованность результатов.
        Примечание: Для Nsa1 количество конформеров был обычно 3 или 4 с χ2 значений от 0,1 до 0,3.

Результаты

Nsa1 был ПЦР усиливается от S. cerevisiae геномной ДНК и subcloned в вектор, содержащий тег сродство 6 x гистидина N-терминальный следуют MBP и сайт ТэВ протеазы. Nsa1 был преобразован в клетках E. coli BL21(DE3) и высокие урожаи экспрессии белков были получены после индукции с IPTG и рос...

Обсуждение

Используя этот протокол, рекомбинантных Nsa1 от S. cerevisiae был сгенерирован для структурных исследований рентгеноструктурного анализа и лучей. Nsa1 было хорошо себя вели в растворе и кристаллизуется в нескольких формах кристалл. В процессе оптимизации этих кристаллов было обнаружено, ч...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Дифракция данные были собраны на юго-востоке региональных совместных доступ команды (SER-CAT) 22-ID и 22-BM излучение в Advanced Фотон источник (APS), Аргоннской национальной лаборатории. ЛУЧЕЙ данные были собраны на СИБИЛЛЫ излучение на заранее источника света (ALS), Лоуренса Беркли национальной лаборатории. Мы хотели бы поблагодарить сотрудников на излучение СИБИЛЛЫ за их помощь с удаленного сбора и обработки информации. Мы признательны исследований спектрометрии массы национального института окружающей среды медицинских наук (NIEHS) и группа поддержки за помощь в определении границ домена протеина. Эта работа получила поддержку от нас Национальный институт здравоохранения интрамуральных исследований программа; США Национальный институт наук санитарного состояния окружающей среды (NIEHS) (Зия ES103247 на р. е. с.) и канадский институты медицинских исследований (КНИИЗ, 146626 до M.C.P). Использование APS было поддержано Министерством энергетики США, управление науки, отделение фундаментальных наук энергии под контракт № W-31-109-Рус-38. Использование передовых источника света (ALS) было поддержано директор, управление науки, управление основные энергии наук, Министерство энергетики США под контракт № ДЕ AC02-05CH11231. Дополнительная поддержка для лучей СИБИЛЛЫ излучение происходит от национального института здравоохранения Минос (R01GM105404) и проекта элитного инструментария Грант S10OD018483. Мы также хотели бы поблагодарить Андреа Луна и доктор Сара Андрес за их критическое прочтение этой рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vectorSheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNAATCC204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFwIDTCGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRvIDTAATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFwIDTGGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRvIDTGATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star CellsInvitrogenC601003
pMBP- NSA1 and various truncationsLo et al., 2017
SelenomethionineMolecular DimensionsMD12-503B
IPTG, Dioxane-FreePromegaV3953
EDTA Free Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich4693159001
Sodium ChlorideCaledon Laboratory Chemicals7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrateSigma-AldrichM2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5KD MedicalRGF-3340
GlycerolInvitrogen15514-029
beta-mercaptoethanolSigmaM6250
1M Imidazole, pH 8.0TeknovaI6980-06
Talon Affinity ResinClonetech635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K)MilliporeUFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration ColumnGE-Healthcare28989335
TEV ProteasePrepared by NIEHS Protein Expression CoreExpression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBioRad456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal ScreenHampton ResearchHR2-110
Crystal Screen 2Hampton ResearchHR2-112
Salt RxHampton ResearchHR2-136
Index  ScreenHampton ResearchHR2-144
PEG/Ion ScreenHampton ResearchHR2-139
JCSG+Molecular DimensionsMD1-37
Wizard Precipitant Synergy Molecular DimensionsMD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop platesTTP Labtech4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing TapeHampton ResearchHR4-506
Proti-Ace KitHampton ResearchHR2-429
PEG 1500Molecular DimensionsMD2-100-6
PEG 400Molecular DimensionsMD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5Molecular DimensionsMD2-011-
Sodium Citrate tribasicMolecular DimensionsMD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized CoverslidesHampton ResearchHR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant)Hampton ResearchHR3-172
 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM)Hampton ResearchHR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead KitHampton ResearchHR2-320
Magnetic Crystal CapsHampton ResearchHR4-779
Magnetic Cryo WandHampton ResearchHR4-729
Cryogenic Foam DewarHampton ResearchHR4-673
Crystal Puck SystemMiTeGenM-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear PlateVWR10011-228
AxyMat Sealing MatVWR10011-130
Equipment
UVEX-mJAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite SpectrophotometerThermo-Fisher
Mosquito RobotTTP Labtech
Software/Websites
HKL2000Otwinoski and Minor, 1997
PhenixAdams et al., 2010
CootEmsley et al., 2010
ATSASPetoukhov et al., 2012https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
ScatterRambo and Tainer, 2013
PymolThe PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCHPetoukhov and Svergun, 2005
CRYSOLSvergun et al, 1995
PRIMUSKonarev et al, 2003
EOMTria et al, 2015

Ссылки

  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells - focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516 (2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?. Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. . The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8 Available from: https://pymol.org (2015)
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer's perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431 (2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103 (2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

131WD40

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены