JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Fareler enfeksiyon ve gastrointestinal mikroorganizmalar tarafından neden olduğu hastalıklar çalışmaya bir çok değerli vivo içinde modeli temsil. Burada, bakteriyel kolonizasyon ve Helicobacter pylorifare modelleri histopatolojik değişiklikleri incelemek için kullanılan yöntemleri tarif-hastalığı ile ilgili.

Özet

Helicobacter pylori dünya nüfusunun yarısı var ve önemli bir morbidite ve mortalite insanlarda nedenidir bir mide patojeni var. Birkaç fare modelleri gastrik Helicobacter enfeksiyonunun sayede H. pylori bakteri mide insan ana kolonize ve hastalığa neden moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için geliştirilmiştir. Burada, biz protokollere tarif: 1) intragastric sonda ile besleme; yoluyla farelerin vivo içinde enfeksiyon Bakteriyel süspansiyonlar hazırlamak 2) polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ve uygun hesap tarafından fare gastrik dokularda bakteriyel kolonizasyon düzeylerini belirlemek; ve 3) patolojik değişiklikler, Histoloji tarafından değerlendirmek. Kurmak Helicobacter farelerde enfeksiyon için belirli patojen-Alerjik (SPF) hayvanlar ilk fare kolonileşmesi suşları ya Helicobacter pylori , süspansiyonlar (≥105 koloni oluşturan birimler, CFUs içeren) ile aşılanmış veya hayvanlardan, diğer mide Helicobacter spp. gibi Helicobacter felis. Uygun zaman-puan sonrası enfeksiyon mideleri varlığına ve sagittally iki eşit doku parçaları, her test ve vücut bölgelerinde oluşan disseke. Diğer histolojik işleme tabi tutulur iken bu parçaları birini daha sonra uygun sayma ya da DNA ekstraksiyon, için kullanılır. Bakteriyel kolonizasyon ve midede histopatolojik değişiklikleri düzenli olarak Warthin yıldızlı, Giemsa veya Haematoxylin ve eozin (H & E) lekeleri, uygun ile lekeli gastrik doku bölümlerde değerlendirildi. Ek immünolojik değerlendirmeler de immünhistokimya veya fare gastrik doku bölümlerinde ayirt tarafından üstlenilen. Aşağıda açıklanan protokoller gastrik patolojiler bu insan ile ilgili H. pylori benzeyen farelerde değerlendirilmesi etkinleştirmek için özel olarak tasarlanmış hastalıklar, iltihap, bezi atrofi ve lenfoid folikül oluşumu gibi. İnoculum hazırlanması ve intragastric sonda ile besleme iletişim kuralları da fare, Salmonella Typhimurium veya Sitrobacter rodentiumgibi kolonize diğer enterik insan patojenleri patogenezinde çalışmaya adapte olabilir.

Giriş

Helicobacter pylori enfeksiyonu oranları gelişmekte olan ülkelerde % 801sırasına göre olduğu tahmin ile dünya çapında spiral şeklinde, gram-negatif, insan mide patojen mevcut tüm nüfus var. Her ne kadar çoğu H. pylori-enfekte bireylerin asemptomatik, biraz daha ağır hastalıkları, peptik ülser mide kanseri2' ye kadar geliştirmek. H. pylori-ilişkili kanserler geniş oluşumu ekstra nodal lenfoid doku mide, mide adenokarsinom sonuçlanan veya mukoza ilişkili lenfoid veya malign degisimler epitel hücreleri (GECs) tarafından karakterize doku (MALT) Lenfoma, anılan sıraya göre. H. pylori mide çeşitli virülans faktörleri ve mekanizmaları, bağlılık, büyüme ve metabolizma bu niş içinde kolaylaştırmak varlığı nedeniyle sert ekolojik niş içinde hayatta kalmak için son derece uyarlanmıştır. Özellikle, öldürücü soy-in H. pylori 40 kb cag patojenitesi Adası (cagPAI) yaklaşık 30 genler bir tip 4 salgı sistemi (T4SS)3,4 üretimi için gerekli kodlar sahip . cag PAI-pozitif H. pylori suşları karıştığı gastrik adenokarsinom5temel bir habercisi konak, kronik inflamasyon yüksek düzeyde indüksiyon ile ilişkilidir.

İn vivo hayvan modelleri, özellikle fareler, araştırmacılar host, H. pylori enfeksiyonu ve hastalık sonucu6bakteriyel ve çevresel faktörlere göreli katkılarıyla araştırmak için izin vererek son derece bilgilendirici olmuştur. Çalışmalar daha önce gösterdi bu uzun H. pylori enfeksiyonu C57BL/6 genetik arka plan sonuçlarını geliştirme kronik gastrit ve bezi farelerin atrofi, H. pylori enfeksiyonu7her iki işaretlerinden. Ayrıca, enfeksiyon ile ilgili kedi/köpek bakteriyel türler, H. felis, MALT oluşumu benzer patoloji ve insan MALT lenfoma8,9' da görüldüğü gibi hastalık ilerlemesi ile farelerde ikna etmek için gösterilmiştir. En sık kullanılan H. pylori izole fare kolonizasyon çalışmaları olduğunu "Sydney zorlanma 1" hangi cagPAI+ ama işlevsel olmayan bir T4SS vardır (SS1) zorlanma10, (T4SS−)11. H. pylori yaygın olarak kullanılan diğer suşları dahil B128 7,13 (cagPAI+/T4SS+) (cagPAI-/T4SS−)1312 ve X47-2AL. H. felis enfeksiyonları, zorlanma CS1 için ("kedi sarmal 1", cagPAI-/T4SS−) olduğunu genellikle kullanılan14.

Burada, Helicobacter inocula vivo içinde enfeksiyon için yordamı farelerin intragastric sonda ile besleme için hem de histopatolojik değişikliklerin incelenmesi için dokuların işleme yöntemleri hazırlanması açıklayan bir protokol sağlar mide. Özellikle, bu makalede bakteriyel kolonizasyon görselleştirmek ve MALT oluşumu, virüslü fareleri gastrik mukoza dahil histopatolojik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan histolojik yöntemleri ele alınacak. Burada açıklanan yöntemlerden bazıları diğer gut patojenleri S. gibi çalışmanın adapte olabilir Typhimurium veya C. rodentium.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. büyüme ve bakteriyel Inocula hazırlanması

  1. H. pylori veya H. felis15 -80 ° C ve alt kültür at kan agar (HBA) plakaları oluşan gliserol stokları çözülme: kan Agar Bankası No.2 (bkz. Tablo reçetesi); değiştirilmiş bir "Skirrow'ın antibiyotik seçmeli ek" (vankomisin, 10 μg/mL; oluşan polimiksin B, 25 ng/mL; trimetoprim, 5 µg/mL; Amfoterisin B, 2.5 μg/mL); ve 5-%10 (v/v) at kan15,16. Bakteri anaerobik kavanoz ( Tablo malzemelerigörmek) uygun gaz paketleri, 37 ° C'de içeren 2,5 veya 3.5 L microaerobic koşullarda de büyümek
    Not: H. felisiçin en az 2 gün, kuluçka ise genel olarak zorunlu bu koşullar altında yetiştirilen H. pylori suşları, kuluçka, 1-1.5 gün sonra subcultured gerekir. Uygun kültür ve depolama medya açıklanan ayrıntılı olarak daha önce15.
  2. Bakteriyel inocula fare enfeksiyon erken ve orta Logaritmik faz kültürlerden hazırlamak. Ağar kaplamalar yavaşça bakterilerden her plaka 1-2 mL beyin kalp infüzyon (BHI) suyu ile sel hasat. Süspansiyonlar Pasteur Pipetler ile plakalar üzerinden Aspire edin.
    1. Alternatif olarak, 16-18 h15için BHI suyu yayılma Helicobacter bakterilerden inocula hazırlayın. Bu durumda, düşük hızlı Santrifüjü 2200 x g 4 ° C'de 10 dakika için de tarafından bakteri toplamak
  3. Canlılık ve motilite bakteri ıslak Dağı hazırlıklar faz kontrast mikroskobu (100 X amaç) altında incelenerek değerlendirmek. Islak bağlar bir loopful 10-20 μL damlacık BHI, bakteri resuspending tarafından suyu cam mikroskop slayt üzerindeki hazırlayın. H. pyloridaha çok daha büyük bir bakteri olan H. felissöz konusu olduğunda, bir haemocytometer doğru bir şekilde canlı bakteri sayısını saymak için kullanın. Kültür saflık Gram boyası gerçekleştirerek onaylayın.
    Not: bakterilerin çoğunluğu (morfolojisi zorlanma bağlı olarak değişebilir) bir bacillary veya spiral şekli varsa sadece H. pylori inocula kullanın. H. felis inocula öncelikle sarmal şeklinde bakteri. içermelidir Bu formlar kalıcı değildir ve enfeksiyon farelerde kuracak değil gibi bakterilerin çoğu kok bir kara delik varsa inocula kullanmayın.
  4. Faz kontrast mikroskobu altında bakteri (100 X amaç) başına yaklaşık sayılması ve aşağıdaki kılavuzu kullanarak inoculum bakteri sayısını tahmin etmek: 1 bakteri başına yaklaşık 10 =6 koloni oluşturan birimler () CFU), Helicobacter/mL; alan başına 10 bakteri yaklaşık 10 =7 CFU/mL; alan başına 100 bakteri yaklaşık 10 =8 CFU/mL, vb
    1. Bir haemocytometer kullanırken, CFU/mL aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar:
      CFU/mL = (bakteri bir 4 x 4 alanda ortalama sayısı) x (seyreltme faktörü) x (104).
  5. İnoculum yaklaşık 107–108 CFU/mL tarafından BHI suyu, seyreltme için bakteri hücre yoğunluğu ayarlayın.
    1. Maksimal bakteriyel canlılığı sağlamak için inocula için intragastric sonda ile besleme en kısa zamanda hazırlık sonra kullanın.
    2. Her zaman H. pylori hücre yoğunluğu ve canlılığı uygun inocula hemen sonda ile besleme işlemden sonra (aşağıya bakın) sayma gerçekleştirerek onaylayın. Genellikle izole kolonileri Kültür medya biçimi değil olarak bu her zaman H. felisiçin mümkün değildir. Bu yöntem kalıcı arasında ayrımcılık yok gibi optik yoğunluk ölçüm tarafından (bir600) tek başına inocula uygun Helicobacters numaralarını tespit edilemez (yani, bacillary/spiral/helisel) ve uygun olmayan ( Yani, Kok) bakteri.
    3. Optik yoğunluk değerlerine uygun H. pylori sayıda tahmin etme aracı olarak kullanmak inocula, ama bu durumda, bakterilerde bir büyüme eğrisi oluşturmak için ilk gerekli oldu. Bunun için H. pylori kültürlerin A600 değerleri zaman içinde izlenen ve canlı bakteri, plaka sayılarak belirlenen sayıda karşı doğrudan ilişkili.
      Not: kültür bakterilerde bir % 10 CO2 kuluçka makinesine yerleştirilen standart düz dipli doku kültürü şişeler kullanarak sıvı orta (Bölüm 1.2), bu tür büyüme eğrisi tespitler gerçekleştirmek için uygun bir yöntem sağlamaktır. CFUs, her 4-6 h 2-3 gün içinde elde kültürler aliquots belirlenen sayıda sonra karşılık gelen bir600 değerleri17karşılaştırılır. Önemlisi, büyüme eğrileri her H. pylori zorlanma için bunlar farklı oranlarda büyümeye olabilir ve ayrıca, tüm suşların de % 10 CO2' büyümek gibi oluşturulan gerekir.

2. fare ile Helicobacter intragastric sonda ile besleme

Not: Bu yöntemi intragastric sonda ile besleme, gut Örneğin S. kolonize diğer bakteriyel türler için uygulanabilir TyphimuriumC. rodentium, Listeria Monositogenez.

  1. 6-8-hafta-yaşlı, belirli patojen-Alerjik (SPF) ve Helicobacterkullanın-ücretsiz erkek ya da dişi fareler. Hayvanlar H. felisimleriyle H. pylori enfeksiyonu deneyleri için C57BL/6 genetik olarak arka plan kullanın. Bu da çalışmanın, biz vahşi-type (WT) ikinci el ve genetiği değiştirilmiş C57BL/6 fare anahtar doğuştan gelen bağışıklık reseptör (knock-out ya da KO hayvan denir) eksik.
    Not: Fareler üzerinde genetik diğer arka planlar da Helicobacter enfeksiyonlar için kullanılabilir, ancak, kolonizasyon düzeyleri ve hastalık şiddeti ana bilgisayar arka plan18,19türü tarafından etkilenebilir.
  2. Bakteriyel inoculum (adım 1.5) tek kullanımlık 1 mL şırınga Aspire edin ve sağlanan iğneler üzerine yapıştırılmış tek kullanımlık polietilen kateterler (iç çapı, 0,58 mm uzunluğu, 6-8 cm;) olan 23 gauge iğne değiştirin. Kateterler iğneler için plastik küçük şeritler uygulama tarafından bağlayın (bkz. Tablo reçetesi) film. Alternatif olarak, iğne/kateter derleme steril Plastik tüpler besleme kullanarak değiştirme (20 ölçmek x 38 mm).
  3. Fiziksel olarak bir tutuş, boyun ve kuyruk scruff ile fareler dizginlemek.
    Not: Bu yordam anestezi olmadan veya alternatif olarak, methoxyflurane veya isoflurane15gibi bir inhale anestezik kullanımı ile gerçekleştirilebilir.
  4. Açık çene ve yemek borusu kaudal bir yönde kılavuzda merkezi kateter takın. Mide yemek borusu yoluyla (ve trakea uzak) için erişim kolaylığı sağlamak için fareyi boyun en kadar genişletmek veya tek kateterin artık görünür ve mide Bankası için karşılık gelen bir direnç hissedilir. Belirli bir aliquot, genellikle 100 μL aşılama (Şekil 1) başına teslim.
    Not: Fareler ≥ 10 ile gavaged olması gereken5 CFU en uygun kolonizasyon ve hastalık patoloji emin olmak için.
  5. Deneme süresi için bir SPF hayvan tesisinde House fareler.
    Not: Şiddetli patoloji ve adenokarsinom WT C57BL/6 farelerde sadece gözlenen yaklaşık 24 ay sonrası enfeksiyon20at. Ancak, bu etkiyi genetiği değiştirilmiş bazı hayvanlarda veya diğer genetik kökenli farelerde hızlandırılmış.
  6. Sonda ile besleme yordamı tamamlandıktan sonra uygun H. pylori numaraları belirlemek için Miles ve enesali teknik bir değişiklik yapmak bakteri fareler için yönetilen. Bunun için inoculum seri olarak (üzerinden 10−5için 10– 1 ) açıklanan yöntemi kullanarak BHI seyreltilmiş ayrıntılı olarak daha önce15.
    Not: tek kolonileri yalıtım sağlamak için HBA plakaları olmalı ısıttı ve 10-15 dk kullanmadan önce bir biyolojik emanet dolabı veya 37 ° C kuluçka kurutulmuş.

3. hasat farelerin sonrası deneme dokulardan

  1. Fareler karbon dioksit inhalasyon veya hayvan deneme için ilgili etik komitesi göre servikal çıkığı ötenazi.
  2. Karın boşluğu açmak ve ince, eğri makas kullanırken mide tüketim.
    Not: Sera da sistemik yanıt Helicobacter enfeksiyonu için soruşturma yardımcı olmak için kardiyak ponksiyon tarafından toplanabilir. Ayrıca, dalağı ve paragastric lenf düğümleri koleksiyon edinilmiş bağışıklık yanıtı okumak yararlı bulunmaktadır.
  3. Mide daha fazla eğim boyunca kesmek ve kalan gıda tarafından nazik steril fosfat tamponlu tuz yıkama (PBS) 50 mL tüplerde kaldırın.
  4. Mide yine steril PBS yıkama ve 6 cm şeytan plastik Petri yemekler kullanarak ıslak ağırlığı kaydetmek.
  5. Mide düzleştirmek ve sagittally oluşan her iki eşit doku parçalara incelemek: test, beden ve salgı sigara forestomach bölgeler (Şekil 2). Glandüler olmayan bölge kaldırmak ve bir tartmak yarım her mide (geçerli sayım için) ya da 1 mL steril BHI için eklemeden önce veya sıvı azot (DNA/RNA çıkarılması için) buz gibi kendine gel.
    Not: işlenmeye hazır olana BHI dokusu içeren tüpler buza depolanması gerekir. Snap donmuş mide doku RNA veya protein qPCR (kantitatif PCR) veya Batı analizleri, kurutma için sırasıyla ayıklamak için kullanılabilir.
  6. Diğer mide yarısı % 10 formalin içeren bir 15 mL tüp için ekleyin. % 10 formalin 10 dokularda bırakın s ve tüpler üst tarafına düzleştirin. Dokularda % 10 formalin çözüm en az 24 saat içinde yeniden çeker önce düzeltmek izin verir.
    Not: Doku işleme önce birçok hafta boyunca Histoloji için % 10 formalin içinde kalabilir. Ancak, uzun süreli depolama doku yan mimarisi ve/veya alt-optimal sonuçlarında aşağı akım analizleri sonuçlanan antigenicity etkileyebilir.

4. onay mide sonrası enfeksiyon Bakteriyel kolonizasyon

  1. H. pylori midede geçerli sayım
    1. Ek steril HBA plakaları koloni sayıları virüslü fare mideleri16' dan gerçekleştirmeden önce ek antibiyotik (200 μg/mL ilaç ve 10 μg/mL naladixic asit).
    2. Mide bölümleri de el ile autoclavable Polipropilen micropestles ya da mekanik ayrışma enstrüman kullanarak homojenize ( Tablo malzemelerigörmek).
    3. Yinelenen seri dilutions (10– 1 için 10−2) steril BHI içinde ortaya çıkan mide homogenates, hazır olun.
      Not: Dilutions karar verilen H. pylori için elde edilen tipik bakteriyel yük dayalı için enfeksiyon, aynı zamanda enfeksiyon süresi kullanılan zorlanma. Su katılmamış örnekleri de kullanılabilir.
    4. (Yukarıdaki nota bakın) önceden kurutulmuş HBA plakaları üç ya da dört parça halinde bölün. Bir uyarlaması Miles ve enesali tekniği kullanarak, her seyreltme agar plaka bir parçasını üzerine 10-100 mL ekleyin ve steril plastik döngüler15kullanarak yayıldı.
    5. Kuru ve sonra ters bir pozisyonda (kapak tarafı aşağı) anaerobe gaz kavanozlara koyun plakaları izin. Kavanoz nem korumak için su içeren bir petri içerir.
    6. (Genellikle 4-7 gün) koloniler oluşana kadar kavanoz 37 ° C'de kuluçkaya.
    7. Segment(s) 10 ile 100 arasında izole kolonileri içeren sıralamak.
      Not: H. pylori kolonileri ve H. felis büyüme plakaları standart üreaz, katalaz ve oksidaz testleri kullanarak fare gastrik microbiota diğer üyelerin milleri ayrılır. H. pylori ve H. felis için tüm üç testi pozitif.
    8. Bakteriyel yükler (CFU/g doku), hesaplamak aşağıdaki formülü kullanarak:
      [(Koloniler sayılır ortalama sayı) × (seyreltme faktörü) x (kaplama cilt)] / (karın kilo).
  2. H. felis enfeksiyon mide dokularda polimeraz zincir tepkimesi (PCR) tarafından algılanması
    1. DNA fare mideleri standart DNA izolasyon protokolleri veya piyasada bulunan bir seti kullanarak ayıklayın.
    2. Örneklerin Fluorometrik Nefelometri tekniği kullanarak DNA konsantrasyonu belirlemek ( Tablo malzemelerigörmek).
    3. H. felis üreaz B gen (ureB)21325-baz çifti (bp) parçası hedefleyen PCR reaksiyonları kadar ayarla. Her reaksiyon içermelidir: 100 ng genomik DNA; 1 mM her ileri (5'-AAA ATC CAC GAA GAC TGG GG-3') ve ters (5'-CTT TTA TCC AAG TGG TGG CAC ACC-3') astar; 200 mM dNTPs; Taq polimeraz ve arabellek ve nükleaz ücretsiz su uygun miktarda 0.5 birim.
      Not: Bu oligonükleotid çifti tanımak ve homolog dizileri H. pylori ve H. felis ureB genlerdeki ama PCR koşullar altında bu ureB içinde mevcut tabi bağlamak için tasarlanmıştır enterohepatic Helicobacter spp. genler
    4. PCR güçlendirme aşağıdaki termal profili kullanarak gerçekleştirmek: 94 ° c 5 min için Isıtma, 35 94 ° C devredir 30 ardından s, 61 ° C 30 s ve 72 ° C için 1 dk önce 20 ° C'de tutan
    5. PCR ürünlerinin % 2 özel jel 100 V 30 dk için çalıştırın.

5. histolojik analizler Helicobacter-fare mide bölümleri enfekte

  1. Mide mendil işleme
    1. Mide doku formalin ve yer temiz Petri yemeklerinde kaldırın.
    2. Bir neşter kurcalayarak mide birkaç eşit boyutlu uzunlamasına şeritler halinde (her 2-3 mm kalınlığında) kesin ve köpük doldurma içeren etiketli gömme kaset içinde yer.
    3. Mide doku gömme kaset % 80 etanol ile dolu bir kavanoza koyarak düzeltmek.
      Not: Mideleri hemen işlenir veya sonraki adıma geçmeden önce 1-2 güne kadar saklı.
    4. Aşağıdaki ayarları kullanarak programlanmış bir otomatik doku işlemci işlem mideleri:
      Dehidratasyon: % 70 etanol - 1 döngüsü, 20 dk; % 90 etanol - 1 döngüsü, 20 dk; % 100 etanol - 2 döngüleri, 20 dk + 1 döngüsü, 40 dk + 1 döngüsü, 1 h.
      Takas: ksilen – 2 döngüleri, 30 dk + 1 döngüsü, 45 dk.
      Emprenye: parafin 60 ° c - 1 döngüsü, 45 dk + 1 döngüsü, 1 h + 1 döngüsü, 1.25 h.
    5. İşlenmiş örnekleri makineden çıkarın ve parafin katıştırma için oda sıcaklığında saklayın.
  2. Parafin işlenmiş gastrik dokuların katıştırma
    1. Paslanmaz çelik taban kalıplar kalıpları üsleri ısıtmak için gömme birim sahnesinde yerini.
      Not: makine katıştırma 60 ° C'de verimli parafin katıştırma için ayarlanmalıdır.
    2. Balmumu tamamen eriyene kadar bir sıcak balmumu sıcak banyo/plaka alanına gömme biriminin örnekleri içeren mumlu kaset yerleştirin.
      Not: Kısa bir süre sonra balmumu erir sonra örnek katıştırılması önerilir. Bu dokuların sertleşme meydana gelmez sağlar.
    3. Paslanmaz çelik kalıpları yarısı parafin ile doldurun. Sıcak forseps kullanarak, mide doku şeritler kaset ve nazikçe kalıp tabanına parafin ile mide şeritler itme kaldırın. Böylece onların dilimlenmiş uçları yukarı bakacak şekilde dikkatle doku şeritler kalıpları tabanına doğru açıyla yönlendirmek.
      Not: Aşağıdaki adımları olarak mümkün olduğunca çabuk sertleştirme ve parafin katmanları katıştırılmış blokları içindeki ayrılığı önlemek yapılmalıdır. Mide dokuların uygun yönlendirmeyi aşağı akım analizleri için önemlidir.
    4. Kalıpları numuneler yerde düzeltmek ve doku gerekirse yeniden yönlendirmek için gömme birim soğuk tabağa yerleştirin.
      Not: dokular yerinden olmak ve parafin sertleşmesine başlar, kalıpları geri balmumu eritmek ve dokuları yeniden kalıpları içinde katıştırmak için sıcak plaka üzerine koyun.
    5. (Bu doku işleme için kullanılan) etiketli gömme kaset üzerine kalıpları üst yarısını koyun ve yavaşça sıcak balmumu ile doldurun. Parafin taşmasına izin vermez.
    6. Yavaşça kalıpları soğuk bir tabak üzerine yerleştirin ve soğumasını bekleyin.
    7. Parafin tam olarak ayarladığınızda katıştırılmış blok kalıpları ayırın. Sıcak bir tabak (80 ° C üzerinde ayarla) veya bir kazıyıcı kullanarak kaset kenarları temiz fazla parafin. Kesit gerçekleştirilene kadar blok oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
  3. Dokuların kesit
    1. Parafin gömülü doku blok buz soğuk ve 40-45 ° C'ye Ultrasaf Su ile dolu bir su banyosu ısı
    2. Bıçak microtome tutucu güvenli ve boşluk açısı arasında 1-5 arasında parafin blok takmadan önce blok yüz ve bıçak tarafı, temas önlemek için ° ayarlayın.
      Not: Bu blok uyum engelleyebilir gibi bloklar fazla parafin katıştırma üzerinden alınan açık olduğundan emin olun.
    3. Düz kesim için bıçak blok arasında yönlendirmek. Yavaşça bloğunu doğru konumlandırma emin olmak için 2-3 ince kesitler kesti.
    4. Blok yaklaşık 10 – 30 mm kalınlığında tarafından kırpın. Bu adım maksimal yüzölçümü her doku şerit kesilir sağlar.
    5. 10 µm bölümleri ve delik çıkararak neden herhangi bir içeren atma kesti.
    6. Dikkatle Cımbız kullanarak bölümleri seç ve onları düzleştirme için su banyosu içinde yüzer. Her bölümü birbirinden ayırmak için cımbız kullanın.
    7. Bölümler ( Tablo malzemelerigörmek) şarj edilmiş cam slayta yeri ve su banyosu toplamak.
    8. Slaytları bir slayt rafa dik depolama ve kuluçka 37 ° C'de yer Kuru bölümlerde gecede.
    9. Bölümler belirsiz daha sonraki analizler için oda sıcaklığında saklayın.
  4. Haematoxylin ve eozin (H & E) mide dokuların boyama
    1. 5 dk her, ksilen 3 yıkar kullanarak slaytları 3 min için % 100 etanol içinde 3 yıkar ve ardından dewax. Taze çözümler her aşamada kullanıldığından emin olun.
    2. 30 – 60 s için musluk suyundaki slaytlar durulayın.
    3. Aşırı su yavaşça bir kağıt havlu slaytlarda alt dokunarak kaldırın. 3 dk. bölümleri sağlamak için filtre uygulanmış Haematoxylin ile leke yeterince çözüm ile kaplı.
    4. Slaytlar su açık çalıştırır kadar akan musluk su altında yıkayın.
    5. Scott'ın musluk suyu 8 – 10 s için slaytları daldırma. 10'dan daha fazla çözüm slaytlara maruz bırakmayın s bu kadar yoğun ve koyu lekeler neden olacaktır. Bölümlerini boyama mikroskop altında görüntülenebilir. Bu aşamada verimli boyama bebek mavi bir renk neden olur.
      Not: 2 g sodyum hidrojen karbonat (NaHCO3) ve 20 g magnezyum sülfat (MgSO4) 1 L distile su içinde çözülerek Scott'ın musluk suyu hazırlayın.
    6. 30 – 60 s için musluk suyundaki slaytlar durulayın.
    7. 3. adımda açıklandığı gibi aşırı su kaldırmak ve sonra filtre uygulanan % 1'i ile leke sulu eozin 3 dk için.
    8. Slaytlar su açık çalıştırır kadar akan musluk su altında yıkayın.
      Not: Boyama hafif bir mikroskop kullanarak değerlendirilebilir. Boyama çok karanlıksa, slaytlar % 100 etanol belirtilen süreden daha uzun süre susuz. Daha koyu boyama gerekiyorsa, slaytlar eozin ile 1-2 min için artık bu, sonraki adımlara geçmeden önce boyanabilen.
    9. Slaytlar için %30 100 etanol 3 yıkar kullanarak kurutmak s her, ksilen 2 min için 3 yıkar izledi. Taze çözümler her aşamada kullanıldığından emin olun.
    10. Slaytlar montaj orta ile bağlayın. Yavaşça aşağı doğru bakan bölümleri ile üst üzerinde slayt yerleştirerek önce temiz bir coverslip ortasına montaj orta bir damla ekleyin.
      Not: slaytlar kapağı kaymasını önce kuru değil.
    11. Slaytlar düz bir yüzeye yerleştirin ve hava kuru sağlar. Slaytlar ayrıca kuruma süresi hızlandırmak için bir duman mahallede kurutulmuş.
  5. Mide dokuların Giemsa boyama
    1. Histolene 2 yıkama 5 dk her, kullanarak slaytlar ardından % 100 etanol için 3 dk. 2 yıkar ve sonra % 70 etanol 3 dk. taze çözümler her yıkama için kullanılır sağlamak için son bir makinaya dewax.
    2. 30 – 60 s için musluk suyundaki slaytlar durulayın.
    3. Giemsa çözüm % 20 Giemsa leke % 80'i distile su ile karıştırılarak hazır olun. Slaytlar için 1 h Giemsa çözüm ile leke.
    4. 100 mL distile su 3-4 damla asetik asit, 2-3 sn için içeren slaytlar yerleştirin.
      Not: Kullanmadan önce iyi çözüm karışık olmalı. Bu aşamada, slaytlar soluk mavi renkte görünmesi gerekir.
    5. Slaytlar için %30 96 etanol yıkayın s.
    6. 3 isopropanol 2 dk her, hamamları slaytları 3 histolene 2 min için hamamları ardından yıkayın. Taze isopropanol ve histolene her yıkama için kullanın.
    7. Coverslip ile montaj orta, daha önce açıklandığı gibi kayıyor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı ile H. pylori ya da H. felis intragastric enfeksiyon fare fare modelleri (Şekil 1) elde etmek için bir oral gavaj tekniği açıklar. Ötenazi, mideleri kaldırılır, tartılır ve test, vücut ve glandüler gastrik dokuları (Şekil 2) bölgelerinde oluşan 2 eşit yarıya bölünmüş. Glandüler olmayan bölge herhangi bir analizleri gerçekleştirmeden önce kaldırılır.

Hayvanların ba?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı bir vivo içinde fare modeli Helicobacter enfeksiyon için açıklar. Yordam kritik adımlar şunlardır: 1) canlı ve hareketli bakteri; içeren Helicobacter inocula hazırlanması 2) için fareyi intragastric sonda ile besleme yoluyla bakteri uygun sayıda teslim; 3) koloni sayımı ve/veya PCR bakteriyel enfeksiyon tespiti; ve 4) işleme histopatoloji içinde değerlendirilmesi etkinleştirmek için mide dokuların enfekte mideleri. Değişiklikler, sorun giderme ve tekn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Bayan A. De Paoli ve Bayan Georgie Wray-McCann teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar tesislerinin kullanımı ve Monash Histoloji Platform, anatomi bölümü ve gelişim biyolojisi, Monash Üniversitesi Teknik yardım kabul edersiniz. Laboratuvar Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC) RLF (APP1079930, APP1107930) için fon tarafından desteklenir. RLF NHMRC (APP1079904) bir üst düzey araştırma bursu tarafından desteklenmektedir. KD ve MC her ikisi de Monash Lisansüstü Bursları tarafından desteklenir. MC bir uluslararası yüksek lisans burs Tıp Fakültesi, Hemşirelik ve Sağlık Bilimleri, Monash Üniversitesi varken KD doğuştan gelen bağışıklık ve enfeksiyöz hastalıklar, Hudson Enstitüsü tıbbi araştırma, aynı zamanda merkezi tarafından desteklenir. Araştırma, Hudson Enstitüsü tıbbi araştırma Victoria Hükümeti'nın operasyonel altyapı desteği programı tarafından desteklenir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Bacteriological reagents
Oxoid Blood Agar Base No.2Thermo Fischer ScientificCM0271BDissolve in deinonized water prior to sterilization
Premium Defibrinated Horse bloodAustralian Ethical BiologicalsPDHB100
Bacto Brain Heart Infusion BrothBD Bioscience237500Dissolve in deinonized water prior to sterilization
CampyGen gas packsThermo Fischer ScientificCN0035A/CN0025A
Histological reagents
Formalin, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128
Absolute alcohol, 100% DenaturedChemSupplyAL048-20L-P
Isopropanol (2-propanol)Merck100995
Xylene (sulphur free)ChemSupplyXT003-20L
Mayer's HaematoxylinAmber ScientificMH-1LFilter before use
Eosin, Aqueous StainAmber ScientificEOCA-1LFilter before use
Wright-Giemsa Stain, modifiedSigma AldrichWG80-2.5LDilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)
HistoleneGrale Scientific11031/5
DPX mounting mediumVWR1.00579.0500
Molecular biology reagents
Qubit dsDNA BR Assay KitThermo Fischer ScientificQ32850
OligonucleotidesSigma AldrichThe annealing temperature of ureB primers used in this study is 61 °C
GoTaq Flexi DNA PolymerasePromegaM8291Kit includes 10x PCR buffer and Magnesium Chloride
dNTPsBiolineBIO-39028Dilute to 10 mM in sterile nuclease free water before use
Molecular Grade AgaroseBiolineBIO-41025
Sodium Hydrogen CarbonateUnivar (Ajax Fine Chemicals)A475-500G
Magnesium Sulphate HeptahydrateChem-SupplyMA048-500G
Antibiotics
VancomycinSigma AldrichV2002-1GDissolve in deionized water
Polymyxin BSigma AldrichP4932-5MUDissolve in deionized water
Trimethoprim (≥98% HPLC)Sigma AldrichT7883Dissolve in 100% (absolute) Ethanol
AmphotericinAmresco (Astral Scientific)E437-100MGDissolve in deionized water
Bacitracin from Bacillus licheniformisSigma AldrichB0125Dissolve in deionized water
Naladixic acidSigma AldrichN8878Dissolve in deionized water
Other reagents
Methoxyflurane (Pentrhox)Medical Developments InternationalNot applicable
Paraffin WaxParaplast Plus, Leica Biosystems39601006
Equipment and plasticware
Oxoid Anaerobic JarsThermo Fischer ScientificHP0011/HP0031
COPAN Pasteur PipettesInterpath Services200CS01
Eppendorf 5810R centrifugeCollect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4 °C
23 g precision glide needleBD Bioscience301805
Parafilm MBemis, VWRPM996
Portex fine bore polythene tubingSmiths Medical800/100/200
Plastic feeding cathetersInstech  LaboratoriesFTP20-30
1 mL tuberculin luer slip disposable syringesBD Bioscience302100
Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubesSigma AldrichZ317314Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization
GentleMACs DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue
M Tubes (orange cap)Miltenyi Biotec30-093-236
Qubit FluorometerThermo Fischer ScientificQ33216
Sterile plastic loopLabServLBSLP7202
Cold Plate, Leica EG1160 Embedding SystemLeica BiosystemsNot applicable
Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6Sakura, Alphen aan den Rijn4124
Tissue-Tek III Uni-Casette SystemSakura, Alphen aan den Rijn4170
Microtome, Leica RM2235Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus glass slidesMenzel Glaser, Thermo Fischer Scientific4951PLUS4

Referanslar

  1. Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
  2. Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
  3. Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
  4. Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
  5. Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
  6. O'Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
  7. Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
  8. Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
  9. Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
  10. Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
  11. Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
  12. Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
  13. Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
  14. Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
  15. Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
  16. Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
  17. Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 8, Unit8B 1 (2012).
  18. Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
  19. Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181(2012).
  20. Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
  21. Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
  22. Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
  23. Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9(2015).
  24. Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
  25. Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396(2009).
  26. Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
  27. McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
  28. Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
  29. Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
  30. Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
  31. Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonsay 140Helicobacter pyloriHelicobacter felisfare modeliMALT lenfomainflamasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır