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Résumé

Souris représentent un modèle inestimable en vivo pour étudier les maladies infectieuses et maladies causées par des micro-organismes gastro-intestinaux. Nous décrivons ici les méthodes utilisées pour étudier les changements histopathologiques dans des modèles murins de Helicobacter pyloriet colonisation bactérienne-maladie liée.

Résumé

Helicobacter pylori est un pathogène gastrique qui est présent dans la moitié de la population mondiale et est une cause importante de morbidité et de mortalité chez l’homme. Plusieurs modèles de souris de l’infection à Helicobacter gastrique ont été développés pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires, par lequel les bactéries Helicobacter pylori colonisent l’estomac des hôtes humains et causer la maladie. Ici, nous décrivons les protocoles à : 1) préparer des suspensions bactériennes à l’infection en vivo de souris par gavage gastrique ; 2) déterminer les niveaux de colonisation bactérienne en tissus gastriques de souris, par réaction en chaîne par polymérase (PCR) et compter viable ; et 3) évaluer les changements pathologiques, en histologie. Pour établir Helicobacter infection chez la souris, animaux (SPF) exempts de micro-organismes pathogènes est d’abord inoculées avec des suspensions (contenant ≥ 105 d’unités formant des colonies, UFC) des souches colonisatrices de souris de l' Helicobacter pylori ou autres gastrique Helicobacter spp animaux, tels que Helicobacter felis. À l’heure-points appropriés après l’infection, les estomacs sont excisés et disséqués sagittally en deux fragments de tissus égale, chacun comprenant les régions de l’antre et du corps. Un de ces fragments est ensuite utilisé pour comptage viable ou extraction de l’ADN, tandis que l’autre est soumis à traitement histologique. La colonisation bactérienne et changements histopathologiques dans l’estomac peuvent être évalués régulièrement dans des sections de tissu gastrique tachées de taches (H & E) Warthin-Starry, Giemsa ou hématoxyline et éosine, selon le cas. D’autres analyses immunologiques peuvent également être entreprises par immunohistochimie ou par immunofluorescence sur coupes de tissus gastriques de souris. Les protocoles décrits ci-dessous sont spécialement conçus pour permettre l’évaluation chez les souris des pathologies gastriques ressemblant à ceux d’anthropique Helicobacter pylori maladies, y compris l’inflammation, atrophie de la glande et la formation de follicules lymphoïdes. La préparation de l’inoculum et protocoles de gavage gastrique peuvent également être adaptées à l’étude de la pathogenèse des autres agents entéropathogènes humains qui colonisent les souris, tels que Salmonella Typhimurium ou Citrobacter rodentium.

Introduction

Helicobacter pylori est un pathogène humain, Gram négatif, en forme de spirale gastrique présent dans toutes les populations à travers le monde, avec des taux d’infection dans les pays en développement, estimées à environ 80 %1. Bien que la plupart Helicobacter pylori-personnes atteintes sont asymptomatiques, certains développent des maladies plus graves, allant de l’ulcération peptique de cancer gastrique2. Helicobacter pylori-cancers associés se caractérisent globalement par modifications malignes dans les cellules épithéliales (SCAE) ou par la formation des tissus lymphoïdes extra nodales dans l’estomac, qui en résulte dans l’Adénocarcinome gastrique ou associé aux muqueuses lymphoïde Lymphome du tissu (MALT), respectivement. H. pylori est très adapté pour survivre dans la niche écologique sévère de l’estomac en raison de la présence de divers facteurs de virulence et de mécanismes facilitant son adhésion, la croissance et le métabolisme dans ce créneau. En particulier, les souches virulentes de H. pylori possèdent le 40KO cag Pathogenicity Island (cagPAI) qui encode approximativement 30 gènes nécessaires à la production d’un Type 4 sécrétion système (T4SS)3,4 . ACG PAI-positive des souches de H. pylori sont associés à l’induction des niveaux plus élevés d’inflammation chronique chez l’hôte, qui est considéré comme un précurseur essentiel de l’Adénocarcinome gastrique5.

In vivo des modèles animaux, en particulier les souris, ont été très instructives en permettant aux chercheurs d’étudier les contributions relatives de l’hôte, des facteurs environnementaux et bactériennes sur l’infection à H. pylori et maladie issue6. Des études ont démontré précédemment que prolongé Helicobacter pylori infection de la souris sur les résultats de fond génétique C57BL/6 dans le développement d’une gastrite chronique et la glande s’atrophier, les deux maîtres mots de H. pylori infection7. Par ailleurs, l’infection avec des espèces bactériennes feline/canine, H. felis, s’est avérée induire la formation de MALT chez les souris présentant une pathologie similaire et la progression de la maladie comme on le voit l’homme MALT lymphome8,9. Le plus couramment utilisé de H. pylori isolat dans les études de colonisation de la souris est la souche « Sydney 1 » (SS1) souche10, qui est ACGPAI+ mais a un T4SS non fonctionnel (T4SS−)11. Autres souches largement utilisés sont le Helicobacter pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 et X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. Pour les infections de H. felis , la souche CS1 (« Cat spirale 1 », ACGPAI–/T4SS−) est généralement utilisé14.

Ici, nous fournissons un protocole décrivant la préparation des inoculums de Helicobacter pour in vivo de l’infection, la procédure pour gavage intragastrique de souris, ainsi que des méthodes pour le traitement des tissus pour l’étude des changements histopathologiques dans l’estomac. En particulier, cet article se concentrera sur les méthodes histologiques permet de visualiser la colonisation bactérienne et d’évaluer les changements histopathologiques, incluant la formation de MALT, dans la muqueuse gastrique de souris infectées. Certaines des méthodes décrites ici peuvent être adaptées à l’étude d’autres pathogènes de l’intestin tels que S. Typhimurium ou c. rodentium.

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Protocole

1. croissance et préparation de l’inoculum bactérien

  1. Décongeler les stocks de glycérol de H. pylori ou felis H.15 de-80 ° C et repiquage sur plaques de gélose au sang (HBA) cheval comprenant : gélose au sang de Base n ° 2 (voir la Table des matières) ; une mis à jour le « Supplément sélectif antibiotique de Skirrow » (consistant à la vancomycine, 10 μg/mL ; polymyxine B, 25 ng/mL triméthoprime 5 µg/mL ; amphotéricine B, 2,5 μg/mL) ; et 5 à 10 % (v/v) cheval sang15,16. Les bactéries développent bien en microaérobiose en 2.5 ou 3.5 L anaérobie bocaux contenant les packs gaz approprié (voir la Table des matières), à 37 ° C.
    NOTE : Souches de H. pylori cultivées dans ces conditions doivent être repiqués après 1 – 1,5 jours d’incubation, alors que pour H. felis, au moins 2 jours d’incubation est généralement exigé. Milieu de culture et de stockage approprié ont été décrits en détail auparavant15.
  2. Préparer inoculum bactérien infection de souris provenant de cultures de début à milieu phase logarithmique. Récolter des bactéries doucement de géloses en inondant chaque plaque avec 1 à 2 mL de bouillon de cerveau coeur cervelle (BHI). Aspirer les suspensions des plaques avec des pipettes Pasteur.
    1. Vous pouvez également préparer inoculums de bactéries Helicobacter qui ont été propagées dans le bouillon BHI pour 16 – 18 h15. Dans ce cas, recueillir des bactéries par centrifugation à faible vitesse à 2 200 x g pendant 10 min à 4 ° C.
  3. Évaluer la viabilité et la motilité des bactéries en examinant les préparations préparation humide sous microscopie à contraste de phase (objectif de X 100). Préparer les supports humides en resuspendant une anse de bactéries dans une goutte de μL de 10 – 20 de BHI bouillon sur une lame de microscope de verre. Dans le cas de H. felis, qui est une bactérie beaucoup plus grande que H. pylori, utilisez un hémocytomètre de compter avec précision le nombre de bactéries viables. Confirmer la culture pureté en effectuant une coloration de Gram.
    Remarque : Utilisez uniquement des inoculums de H. pylori , si la majorité des bactéries ont une forme bacillaire ou en spirale (la morphologie peut varier selon les souches). H. felis inoculums doivent contenir principalement de bactéries en forme d’hélice. Ne pas utiliser les inoculums si la plupart des bactéries ont une morphologie coccoïde, que ces formes ne sont pas viables et n’établira pas une infection chez la souris.
  4. Estimer le nombre de bactéries dans l’inoculum en comptant sous microscopie à contraste de phase, le nombre approximatif de bactéries par champ (objectif de X 100) et en utilisant le guide suivant : 1 bactérie par champ = environ 10 (6 ) unités formatrices de colonies CFU) d’Helicobacter/ml ; 10 bactéries par champ = environ 107 UFC/mL ; 100 bactéries par champ = environ 108 UFC/mL, etc.
    1. Lorsque vous utilisez un hémocytomètre, calculer UFC/mL à l’aide de la formule suivante :
      UFC/mL = (nombre moyen de bactéries dans un domaine de 4 x 4) x (facteur de dilution) x (104).
  5. Ajuster la densité de la cellule bactérienne de l’inoculum pour environ 107– 108 UFC/mL de la dilution en bouillon BHI, si nécessaire.
    1. Afin d’assurer la viabilité bactérienne maximale, utiliser des inoculums pour gavage gastrique dès que possible après la préparation.
    2. Toujours vérifier la densité cellulaire Helicobacter pylori et la viabilité en effectuant un comptage viable des inoculums immédiatement après l’intervention de gavage (voir ci-dessous). Ce n’est pas toujours possible pour H. felis, car elle ne fait pas habituellement des colonies isolées sur milieu de culture. Les numéros de viable Helicobacters inocula ne peuvent être déterminées par la mesure de la densité optique (une600) seul comme cette méthode ne fait aucune distinction entre viables (c'est-à-direbacillaire/spirale/hélicoïdal) et non viables ( c'est-à-dire, coccoïdes) bactéries.
    3. Utiliser les valeurs de densité optique comme un moyen d’estimer le nombre de viable Helicobacter pylori bactérie dans les inoculums, mais dans ce cas, il s’est d’abord nécessaire pour générer une courbe de croissance. Pour ce faire, les valeurs de600 A des cultures de H. pylori sont surveillés au fil du temps et corrélées directement contre le nombre de bactéries viables, déterminées par comptage de la plaque.
      Remarque : Une méthode commode pour effectuer de telles déterminations de courbe de croissance est de bactéries de la culture en milieu liquide (Section 1.2), à l’aide de flacons de culture de tissu de fond plat standard placés dans une étuve à2 CO 10 %. Le nombre d’UFC, déterminée à partir de portions des cultures obtenues toutes les 4 à 6 h pendant 2 à 3 jours, est ensuite comparé à un600 valeurs17correspondantes. Ce qui est important, les courbes de croissance doivent être générés pour chaque souche de l’Helicobacter pylori , car elles peuvent croître à des taux différents et, en outre, pas toutes les souches poussent bien dans les 10 % de CO2.

2. intragastrique Gavage de souris avec Helicobacter

Remarque : Cette méthode de gavage gastrique peut être appliquée à d’autres espèces de bactéries qui colonisent le tube digestif par exemple S. Typhimuriumc. rodentium, Listeria monocytogenes.

  1. Utiliser les 6 – 8 semaines, spécifique exempts de micro-organismes pathogènes (SPF) et Helicobacter-gratuit souris mâles ou femelles. Utiliser des animaux avec un bagage génétique C57BL/6 pour les expériences d’infection par Helicobacter pylori ou H. felis. Dans la présente étude, nous utilisé sauvage (WT) et les OGM souris C57BL/6 manque un récepteur de système immunitaire inné clé (appelés knock out animaux KO).
    Note : Souris sur autres antécédents génétiques peuvent également être utilisés pour les infections de Helicobacter , cependant, les niveaux de colonisation et de la gravité de la maladie peuvent être affectés par le type d’hôte fond18,19.
  2. Aspirer les seringues jetables 1 mL de l’inoculum bactérien (étape 1.5) et remplacer les aiguilles fournies avec des aiguilles de calibre 23 sur laquelle sont apposées jetable polyéthylène cathéters (longueur, 6 à 8 cm ; diamètre intérieur, 0,58 mm). Fixez les cathéters aux aiguilles par l’application de petites bandes de plastique film (voir Table des matières). Sinon, remplacez l’ensemble aiguille/cathéter à l’aide de plastique stérile tubes alimentaires (x 38 de calibre 20 mm).
  3. Retenir physiquement le souris avec une poigne ferme à la peau du cou et le croupion.
    Remarque : Cette procédure peut être effectuée sans anesthésie ou, subsidiairement, à l’aide d’un anesthésique inhalé, comme par exemple le méthoxyflurane ou isoflurane15.
  4. Insérer le cathéter dans le centre du guide en direction caudale vers le œsophage et de la mâchoire ouverte. Étendre le cou de la souris pour permettre la facilité d’accès à l’estomac dans le œsophage (et loin de la trachée) jusqu'à ce que la plupart ou tous le cathéter n’est plus visible et une résistance se fasse sentir, correspondant à la base de l’estomac. Livrer une partie aliquote spécifique, généralement de 100 μL par inoculation (Figure 1).
    Remarque : La souris doivent être gavés avec ≥ 105 UFC pour pathologie optimale de colonisation et de la maladie.
  5. Maison des souris dans une animalerie SPF pour la durée de l’expérience.
    Remarque : Une pathologie grave et l’adénocarcinome chez WT C57BL/6 est seulement observée à environ après l’infection20 24 mois. Cependant, cet effet peut être accéléré chez certains animaux génétiquement modifiés, ou chez les souris avec autres antécédents génétiques.
  6. À l’issue de la procédure de gavage, effectuer une modification de la technique de Miles et Misra pour déterminer le nombre de viable Helicobacter pylori bactérie administré à des souris. Pour ce faire, l’inoculum est en série dilué (à partir de 10−1 à 10−5) en BHI en utilisant la méthode décrite en détail auparavant15.
    Remarque : Afin d’assurer l’isolement des colonies individuelles, plaques HBA devraient être réchauffés et séchés dans une étuve de biosécurité armoire ou 37 ° C pendant 10 à 15 min avant d’utiliser.

3. tissus de souris après expérience de récolte

  1. Euthanasier souris par inhalation de dioxyde de carbone ou dislocation cervicale, selon le Comité d’éthique pertinents à l’expérimentation animale.
  2. Ouvrir la cavité abdominale et d’accise de l’estomac à l’aide de ciseaux fine et incurvée.
    Remarque : Les sérums peuvent également être collectées par ponction cardiaque afin d’aider à l’enquête des réactions systémiques à l’infection à Helicobacter . En outre, la collection de la rate et les ganglions paragastric sont utiles dans l’étude des réponses immunitaires adaptatives.
  3. Couper l’estomac le long de la grande courbure et enlever les aliments résiduels par doux lavage en tampon de phosphate stérile saline (PBS) en un tube de 50 mL.
  4. Laver l’estomac encore une fois dans du PBS stérile et ensuite enregistrer le poids humide à l’aide de taré cm 6 boîtes de Pétri en plastique.
  5. Aplatir le ventre et disséquer sagittally en deux fragments de tissu égales, chacune comprenant : l’antre, les corps et les régions non glandulaire préestomac (Figure 2). Supprimer la région non glandulaire et peser une moitié de chacun à l’estomac avant d’ajouter à chaque 1 mL de BHI stérile (pour le comptage viable) ou snap congélation dans l’azote liquide (pour l’extraction de l’ADN/ARN).
    Remarque : Tubes contenant du tissu en BHI doivent être stockés sur la glace jusqu'à ce qu’elles sont prêtes à être traitées. Enclenchez les tissus congelés estomac permet également d’extraire les ARN ou les protéines pour qPCR (PCR quantitative) ou western blot analyses, respectivement.
  6. Ajouter l’autre estomac la moitié d’un tube de 15 mL contenant 10 % de formol. Immerger les tissus dans du formol 10 % pendant 10 s et puis aplatir sur le dessus des tubes. Permettre aux tissus fixer avant de re-plonger dans la solution de formol à 10 % pendant au moins 24 h.
    Remarque : Les tissus peuvent rester dans du formol 10 % pendant plusieurs semaines avant le traitement pour histologie. Un stockage prolongé du tissu peut, cependant, affecter son architecture et/ou l’antigénicité des résultats sous-optimaux en analyses en aval.

4. confirmation d’une colonisation bactérienne dans l’estomac après l’infection

  1. Comptage viable de H. pylori dans l’estomac
    1. Supplément stérile HBA plaques avec des antibiotiques supplémentaires (200 bacitracine μg/mL et 10 μg/mL d’acide nalidixique) avant d’effectuer des comptages de colonies de souris infectées estomacs16.
    2. Homogénéiser les sections de l’estomac soit manuellement, à l’aide de micropestles en polypropylène autoclavable, ou un instrument mécanique de dissociation (voir Table des matières).
    3. Préparer des dilutions en double (10−1 à 10−2) des homogénats gastriques qui en résulte en BHI stérile.
      NOTE : Dilutions doivent être décidées basé sur les charges bactériennes typiques obtenus pour une donnée Helicobacter pylori souche utilisée pour l’infection, ainsi que la durée de l’infection. Échantillons non dilués peuvent également être utilisés.
    4. Diviser préalablement séchées plaques HBA (voir la Note ci-dessus) en trois ou quatre segments. À l’aide d’une adaptation de la technique de Miles et Misra, ajouter 10 – 100 mL de chaque dilution sur un segment de la gélose et se propager à l’aide des boucles en plastique stérile,15.
    5. Laisser les plaques sécher et ensuite les placer en position inversée (côté couvercle vers le bas) dans des bocaux de gaz anaérobie. Pour maintenir l’humidité dans les cuves, comprennent une boîte de Pétri contenant de l’eau.
    6. Incuber les bocaux à 37 ° C jusqu'à ce que les colonies forment (généralement 4 à 7 jours).
    7. Énumérer ou des segments contenant entre 10 et 100 colonies isolées.
      NOTE : Colonies de H. pylori et H. felis croissance sur plaques se distingués de celles des autres membres de la murin microbiote gastrique à l’aide de tests standard de l’uréase, catalase et oxydase. H. pylori et H. felis sont positives pour les trois tests.
    8. Calculer les bactéries des charges (UFC/g de tissu), à l’aide de la formule suivante :
      [(Nombre moyen de colonies dénombrées) × (facteur de dilution) x (volume ensemencé)] / (poids à l’estomac).
  2. Détection de l’Infection à H. felis en tissus gastriques par la réaction en chaîne de la polymérase (PCR)
    1. Extraire l’ADN d’estomacs de souris en utilisant les protocoles standard d’isolement de l’ADN, ou un kit disponible dans le commerce.
    2. Déterminer la concentration de l’ADN des échantillons en utilisant une technique de dosage fluorimétrique (voir Table des matières).
    3. Mettre en place des réactions de PCR ciblant un fragment de paires de 325-bases (bp) du gène (recherche) H. felis uréase B21. Chaque réaction doit contenir : 100 ng d’ADN génomique ; 1 mM chaque attaquant (5'-AAA ATC ACC GAA GAC TGG GG-3') et inverse (5'-CTT TTA STC AAG TGG TGG ACC ACC-3') des amorces ; dNTPs 200 mM ; 0,5 unités de Taq polymérase et les montants appropriés de tampon et de l’eau exempte de nucléase.
      Remarque : Cette paire d’oligonucléotide a été conçue pour reconnaître et se lient à des séquences homologues à H. pylori et H. felis recherche gènes mais lorsqu’ils sont soumis aux conditions ci-dessous, pas ceux qui sont présents dans la recherche PCR gènes d’entérohépatique Helicobacter spp.
    4. Effectuer l’amplification par PCR en utilisant le profil thermique suivant : chauffage à 94 ° C pendant 5 min, suivie de 35 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 61 ° C pour 30 s et 72 ° C pendant 1 min, avant de tenir à 20 ° C.
    5. Exécutez des produits PCR sur un gel d’agarose de 2 % pendant 30 min à 100 V.

5. histologique analyse de Helicobacter -infecté souris estomac Sections

  1. Traitement des tissus de l’estomac
    1. Retirer les tissus de l’estomac de formol et la placer dans une vaisselle Petri.
    2. Couper les tissus d’estomac avec un scalpel en plusieurs bandes longitudinales taille égale (chaque 2-3 mm d’épaisseur) et placer dans des cassettes encastrement étiquetés contenant de mousse.
    3. Fixer les tissus de l’estomac en plaçant des cassettes encastrement dans un bocal rempli d’éthanol à 80 %.
      NOTE : Estomacs peuvent être traités immédiatement ou stockées pendant 1 à 2 jours avant de passer à l’étape suivante.
    4. Estomacs de processus sur un processeur de tissus automatisés, programmé avec les paramètres suivants :
      Déshydratation : 70 % éthanol - 1 cycle, 20 min ; éthanol à 90 % - 1 cycle, 20 min ; 100 % éthanol - 2 cycles, chaque 20 min + 1 cycle, cycle de 40 min + 1 h 1.
      Compensation : xylène – 2 cycles, chaque 30 min + 1 cycle, 45 min.
      Imprégnation : paraffine à 60 ° C - 1 cycle, cycle de 45 min + 1, cycle 1 h + 1, 1,25 h.
    5. Retirer les échantillons traités de la machine et conserver à température ambiante pour l’enrobage de paraffine.
  2. Enrobage de paraffine de tissus gastriques transformés
    1. Placez les moules de base en acier inoxydable sur la scène du corps d’encastrement pour réchauffer les bases des moules.
      Remarque : Embedding machine doit être réglée à 60 ° C pour l’enrobage de paraffine efficace.
    2. Place ciré cassettes contenant les échantillons dans une zone de plaque chaude bain/cire chaude du corps d’encastrement jusqu'à ce que la cire se dissout complètement.
      Remarque : Il est recommandé que l’échantillon sont incorporées au lendemain cire se dissout. Cela garantit que le durcissement des tissus ne se produit pas.
    3. Remplir la moitié des moules en acier inoxydable avec de la cire de paraffine. Avec une pincette chaud, retirer les bandes de tissus estomac les cassettes et doucement pousser que les bandes de l’estomac par l’intermédiaire de la paraffine à la base des moules. Soigneusement orienter les bandes de tissus à angle droit sur la base des moules afin que leurs extrémités en tranches sont vers le haut.
      Remarque : Les étapes suivantes devraient être effectuées aussi rapidement que possible afin d’éviter le durcissement et la séparation des couches paraffine dans des blocs d’embedded. L’orientation correcte des tissus de l’estomac est essentielle pour les analyses en aval.
    4. Placer les moules sur la plaque froide du corps d’encastrement pour fixer les spécimens en place et de réorienter les tissus si nécessaire.
      Remarque : Si les tissus sont déloge et la paraffine commence à durcir, placer les moules sur la plaque chaude pour faire fondre la cire et ré-intégrer des tissus dans les moules.
    5. Placer la moitié des étiquetés cassettes encastrement (qui étaient utilisées pour le traitement de tissus) sur la partie supérieure des moules et remplir doucement avec de la cire chaude. Ne laissez pas de paraffine à déborder.
    6. Doucement, placer les moules sur une plaque froide et laisser refroidir.
    7. Une fois la paraffine est entièrement définie, séparer les blocs embarqués de moules. Cire de paraffine propre excédent sur les bords de cassette à l’aide d’un grattoir ou une plaque chauffante (valeur supérieure à 80 ° C). Blocs peuvent être stockés à température ambiante jusqu'à ce que la section est effectuée.
  3. Découpe des tissus
    1. Refroidir les blocs de paraffine le tissu sur la glace et faire chauffer un bain d’eau rempli d’eau ultrapure à 40 – 45 ° C.
    2. Fixez la lame dans le support du microtome et régler l’angle de dégagement entre 1 et 5° pour éviter tout contact entre la facette de visage et couteau de bloc, avant d’insérer des blocs de paraffine.
      Remarque : Assurez-vous de blocs sont a pas d’excès paraffine acquis de l’intégration, comme cela peut entraver l’ajustement du bloc.
    3. Orienter la lame pour une coupe droite à travers le bloc. Doucement, couper 2-3 coupes minces afin d’assurer un positionnement correct du bloc.
    4. Tailler les blocs par une épaisseur d’environ 10 à 30 mm. Cette étape garantit qu’une superficie maximale de chaque bande de tissu sera coupée.
    5. Couper 10 µm sections et ignorer ceux qui contiennent des trous causés par la faucheuse.
    6. Avec précaution, ramasser des sections à l’aide de la pince à épiler et eux flottent dans le bain d’eau pour aplatir. Utiliser les pinces pour séparer chaque section.
    7. Recueillir des sections du bain-marie et mettre en place dans des lames de verre chargée (voir Table des matières).
    8. Stocker les lames verticalement dans une grille coulissante et placer dans un incubateur à 37 ° C. Sections secs du jour au lendemain.
    9. Stocker les sections à la température ambiante indéfiniment pour les analyses suivantes.
  4. Hématoxyline et éosine (H & E) coloration des tissus de l’estomac
    1. Déparaffinage diapositives à l’aide de 3 lavages de xylène de 5 min chacun, suivis de 3 lavages en éthanol à 100 %, pendant 3 min chaque. S’assurer que les solutions fraîches sont utilisées à chaque étape.
    2. Rincer les lames dans l’eau du robinet pendant 30 à 60 s.
    3. Enlevez l’eau excédentaire en tapotant doucement le bas de la glisse sur une serviette en papier. Coloration à l’hématoxyline filtrée pendant 3 min. veiller à ce que les sections sont suffisamment couverts par la solution.
    4. Rincer les lames sous l’eau courante jusqu'à ce que l’eau soit claire.
    5. Tremper les lames dans l’eau du robinet de Scott pour 8 à 10 s. N’exposez pas les diapositives à la solution plus de 10 s, comme cela se traduira par des taches plus sombres et intenses. Coloration de coupes peut être considérée sous un microscope. La coloration efficace à ce stade se traduira par une couleur « bleue ».
      NOTE : Préparer l’eau du robinet de Scott dissoudre 2 g de bicarbonate de sodium (NaHCO3) et 20 g de sulfate de magnésium (MgSO4) dans 1 L d’eau distillée.
    6. Rincer les lames dans l’eau du robinet pendant 30 à 60 s.
    7. Enlever l’excès d’eau tel que décrit à l’étape 3 et puis tache avec filtrée 1 % éosine aqueuse pendant 3 min.
    8. Rincer les lames sous l’eau courante jusqu'à ce que l’eau soit claire.
      NOTE : La coloration peut être évaluée à l’aide d’un microscope optique. Si la coloration est trop sombre, diapositives peuvent être déshydratés en éthanol à 100 % plus longtemps que la durée spécifiée. Si une coloration plus foncée est nécessaire, diapositives peuvent être colorés avec l’éosine pendant 1 à 2 min de plus, avant de procéder aux étapes suivantes.
    9. Déshydrater les diapositives à l’aide de 3 lavages d’éthanol à 100 % pendant 30 s chacune, suivie de 3 lavages de xylène pendant 2 min chaque. S’assurer que les solutions fraîches sont utilisées à chaque étape.
    10. Monter les lames avec du milieu de montage. Ajouter une goutte de milieu de montage dans le centre d’un lamelle couvre-objet propre avant de placer doucement glisser sur le dessus avec des sections vers le bas.
      Remarque : Ne séchez pas de diapositives avant de glisser la couverture.
    11. Placer les lames sur une surface plate et laisser sécher à l’air. Diapositives peuvent aussi être séchés sous une hotte pour accélérer les temps de séchage.
  5. Coloration de Giemsa des tissus de l’estomac
    1. Déparaffinage diapositives à l’aide de 2 lavages de histolene de 5 min chacun, suivis de 2 lavages d’éthanol à 100 % pendant 3 min chaque, puis un lavage final dans l’éthanol à 70 % pendant 3 min. s’assurer que les solutions fraîches sont utilisées pour chaque lavage.
    2. Rincer les lames dans l’eau du robinet pendant 30 à 60 s.
    3. Préparer la solution de Giemsa en mélangeant coloration de Giemsa de 20 % à 80 % d’eau distillée. Tacher les diapositives avec solution de Giemsa pendant 1 h.
    4. Placer les lames dans 100 mL d’eau distillée contenant 3 à 4 gouttes d’acide acétique pour 2 – 3 s.
      Remarque : La Solution doit être mélangée bien avant de l’utiliser. À ce stade, diapositives doivent apparaître de couleur bleu pâle.
    5. Les lames dans l’éthanol à 96 % pour 30 s.
    6. Les lames en 3 salles de bains d’isopropanol de 2 min chacun, suivie de 3 bains de histolene de 2 min chacun. Utilisez des fraîche isopropanol et histolene pour chaque lavage.
    7. Lamelle couvre-objet glisse avec milieu de montage, comme décrit précédemment.

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Résultats

Ce protocole décrit une technique de gavage oral pour atteindre intragastrique infection par Helicobacter pylori ou H. felis dans des modèles murins souris (Figure 1). Suite à l’euthanasie, les estomacs sont enlevés, pesés et divisés en 2 moitiés égales comprenant l’antre, les corps et les régions non glandulaire de tissus gastriques (Figure 2). La région non glandulaire est retirée avant d’effectuer les analyses.

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Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation d’un modèle de souris in vivo pour l’infection à Helicobacter . Les étapes critiques de la procédure sont la : 1) préparation des inoculums de Helicobacter contenant des bactéries viables et mobiles ; 2) livraison du nombre approprié de bactéries à la souris par gavage gastrique ; 3) détection de l’infection bactérienne par comptage des colonies et/ou PCR ; et 4) traitement des tissus gastriques pour permettre l’évaluation de l’hist...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs aimeraient remercier Mme A. De Paoli et Mme Georgie Wray-McCann pour l’assistance technique. Les auteurs reconnaissent l’utilisation des équipements et l’assistance technique de Monash histologie plate-forme, Département d’anatomie et biologie du développement, l’Université Monash. Le laboratoire est pris en charge par le financement de la National Health and Medical Research Council (NHMRC) à RLF (APP1079930, APP1107930). RLF est soutenu par une bourse de recherche Senior du NHMRC (APP1079904). KD et MC reposent tous deux bourses d’études supérieures de Monash. KD est également appuyé par le Centre pour l’immunité innée et Infectious Diseases, Hudson Institute of Medical Research, tandis que MC a une bourse d’études supérieures internationales de la faculté de médecine, les soins infirmiers et les Sciences de la santé, l’Université Monash. Recherche à l’Institut de recherche médicale de Hudson est pris en charge par programme du gouvernement de Victoria de soutien opérationnel Infrastructure.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Bacteriological reagents
Oxoid Blood Agar Base No.2Thermo Fischer ScientificCM0271BDissolve in deinonized water prior to sterilization
Premium Defibrinated Horse bloodAustralian Ethical BiologicalsPDHB100
Bacto Brain Heart Infusion BrothBD Bioscience237500Dissolve in deinonized water prior to sterilization
CampyGen gas packsThermo Fischer ScientificCN0035A/CN0025A
Histological reagents
Formalin, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128
Absolute alcohol, 100% DenaturedChemSupplyAL048-20L-P
Isopropanol (2-propanol)Merck100995
Xylene (sulphur free)ChemSupplyXT003-20L
Mayer's HaematoxylinAmber ScientificMH-1LFilter before use
Eosin, Aqueous StainAmber ScientificEOCA-1LFilter before use
Wright-Giemsa Stain, modifiedSigma AldrichWG80-2.5LDilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)
HistoleneGrale Scientific11031/5
DPX mounting mediumVWR1.00579.0500
Molecular biology reagents
Qubit dsDNA BR Assay KitThermo Fischer ScientificQ32850
OligonucleotidesSigma AldrichThe annealing temperature of ureB primers used in this study is 61 °C
GoTaq Flexi DNA PolymerasePromegaM8291Kit includes 10x PCR buffer and Magnesium Chloride
dNTPsBiolineBIO-39028Dilute to 10 mM in sterile nuclease free water before use
Molecular Grade AgaroseBiolineBIO-41025
Sodium Hydrogen CarbonateUnivar (Ajax Fine Chemicals)A475-500G
Magnesium Sulphate HeptahydrateChem-SupplyMA048-500G
Antibiotics
VancomycinSigma AldrichV2002-1GDissolve in deionized water
Polymyxin BSigma AldrichP4932-5MUDissolve in deionized water
Trimethoprim (≥98% HPLC)Sigma AldrichT7883Dissolve in 100% (absolute) Ethanol
AmphotericinAmresco (Astral Scientific)E437-100MGDissolve in deionized water
Bacitracin from Bacillus licheniformisSigma AldrichB0125Dissolve in deionized water
Naladixic acidSigma AldrichN8878Dissolve in deionized water
Other reagents
Methoxyflurane (Pentrhox)Medical Developments InternationalNot applicable
Paraffin WaxParaplast Plus, Leica Biosystems39601006
Equipment and plasticware
Oxoid Anaerobic JarsThermo Fischer ScientificHP0011/HP0031
COPAN Pasteur PipettesInterpath Services200CS01
Eppendorf 5810R centrifugeCollect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4 °C
23 g precision glide needleBD Bioscience301805
Parafilm MBemis, VWRPM996
Portex fine bore polythene tubingSmiths Medical800/100/200
Plastic feeding cathetersInstech  LaboratoriesFTP20-30
1 mL tuberculin luer slip disposable syringesBD Bioscience302100
Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubesSigma AldrichZ317314Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization
GentleMACs DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue
M Tubes (orange cap)Miltenyi Biotec30-093-236
Qubit FluorometerThermo Fischer ScientificQ33216
Sterile plastic loopLabServLBSLP7202
Cold Plate, Leica EG1160 Embedding SystemLeica BiosystemsNot applicable
Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6Sakura, Alphen aan den Rijn4124
Tissue-Tek III Uni-Casette SystemSakura, Alphen aan den Rijn4170
Microtome, Leica RM2235Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus glass slidesMenzel Glaser, Thermo Fischer Scientific4951PLUS4

Références

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