JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bir yöntem etkili decellularization ile dil hücre dışı matriks (TEM) hazırlanması için burada gösterilir. TEM fonksiyonel iskele dil Skuamöz Hücre Karsinomu (TSCC) manken çalkalanmış mı statik kültür koşullar altında yeniden inşası için kullanılabilir.

Özet

Dil Skuamöz Hücre Karsinomu (TSCC) vitroiçin etkili ve gerçekçi bir model oluşturmak için yöntemleri TSCC İnşaat için fonksiyonel iskele sağlayan decellularized üretmek dil hücre dışı matriks (TEM) oluşturulmuştur. TEM vitro niş hücre büyümesi, farklılaşma ve hücre geçiş sağlar. Yerel hücre dışı matriks (ECM) ve biyokimyasal besteleri decellularized matris içinde muhafaza microstructures doku özel niş hücreleri demirleme için sağlar. TEM imalatı deoksiribonükleaz (DNaz) sindirim bir ciddi organik veya inorganik Önarıtma ile eşlik tarafından gerçekleştirilebilir. Bu iletişim kuralı kullanımı kolay ve decellularization için yüksek verimlilik sağlar. TEM inşaat TSCC modeli sağlayan olumlu cytocompatibility TSCC hücrelerin çalkalanmış mı statik kültür koşullarda gösterdi. Kendini yetiştirmiş bir biyoreaktör Ayrıca hücre kültürü için kalıcı karıştırılmış koşul için kullanıldı. Yeniden oluşturulan TSCC TEM kullanarak özellikleri ve klinik TSCC histopatoloji, benzer özellikleri TSCC araştırma potansiyeli düşündüren gösterdi.

Giriş

Dil deglutition, eklem ve tatma gibi çeşitli önemli işlevleri vardır. Böylece, dil işlev bozukluğu hastaların yaşam kalitesi1üzerinde büyük etkisi vardır. Oral kavite içinde en yaygın malignite dil Skuamöz Hücre alkol veya sigara tütün2insan genellikle oluşan Karsinomu (TSCC), olduğunu.

Son yıllarda, TSCC üzerinde temel araştırma az bir gelişme sağlanmıştır. Verimli vitro araştırma eksikliği en büyük sorunlardan biri kalır modelleri. Böylece, hücre dışı matriks (ECM) olası bir çözüm olarak ortaya çıktı. ECM son derece organize matris bileşenlerden oluşan bir karmaşık ağ çerçeve olduğu bir ECM benzeri yapıda ve kompozisyon sahip İskele malzemeleri kanser araştırmaları için yetkili gerekir. Decellularized ECM mükemmel niş için hangi ECM en önemli avantajı için çıkıyor aynı kökenli vitro, hücrelerden sağlar.

ECM doku deterjanlar ve enzimler kullanarak decellularization aracılığıyla gelen kaldırılmakta olan hücresel bileşenleri ile muhafaza edilebilir. Kolajen, fibronektin ve laminin decellularized matris içinde de dahil olmak üzere çeşitli ECM bileşenleri yerel doku gibi microenvironment kültürlü hücreler için hayatta kalma, yayılması ve hücreleri3farklılaşma teşvik sağlar. Ayrıca, ECM hücresel bileşenleri yokluğu ile en az düzeye immünojenisite nakli için azaltılabilir.

Şimdiye kadar decellularized ECM imalat yöntemleri farklı doku ve organlarında, kalp4,5,6,7, karaciğer8,gibi9,10 denendi ,11, akciğer12,13,14,15,16,17ve böbrek18,19 , 20. ancak, ilgili hiçbir araştırma olmak buldu en iyi bildiğimiz kadarıyla dilinde benzer iş.

Bu çalışmada, decellularized dil hücre dışı matriks (TEM) verimli ve uygun fiyatla rezervasyon yaptırın fiziksel, kimyasal ve enzimatik tedavi bir dizi tarafından fabrikasyon. Sonra TEM TSCC vitro, özetlemek için TSCC davranış ve Kalkınma için uygun bir simülasyon gösterilen kullanıldı. TEM iyi biyouyumluluk hücreleri TEM TSCC araştırma3' te büyük potansiyeli olabilir gösterir doku özel niş Kılavuzu yeteneği vardır. Burada gösterilen iletişim kuralı Patogenez ya da TSCC klinik tedaviler üzerinde eğitim araştırmacılar için bir seçim sağlar.

Protokol

Tüm hayvan iş hayvan refahı Yasası, kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilen ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Sun Yat-Sen'in Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. TEM hazırlanması

  1. Fareler tarafından servikal çıkığı yürütmek ve steril cerrahi makas ve cımbız kullanarak dilleri kaldırın.
  2. Tongues yılında % 75 etanol 3 min için bırakın, sonra her dil bir 1,5 mL koymak Eppendorf (EP) tüp ile 1 mL 10 mM steril fosfat tamponlu çözüm (PBS).
    Not: PBS konsantrasyonu aşağıdaki adımlarda bu adımda konsantrasyon olarak aynıdır.
  3. Lizis donma çözülme tarafından hücre:-80 ° c için 1 h EP tüpler dilleri donma ve 3 kür için dilleri için 45 dakika oda sıcaklığında erimek.
  4. Cerrahi sütür cerrahi iğne kullanarak bir parça üzerine her dil yüklemek ve steril folyo küçük bir parça ile dikiş sonu sarın. % 75 etanol steril koşullarda içeren bir 3,5 cm veya 6 cm kültür tabağına işlemi.
    Not: Uygun da cerrahi sütür her parçası yaklaşık 20 cm uzunluğunda ve 0,3 cm2 hakkında (1 cm × 0,3 cm) folyo her parçasının uygun boyutudur. Dil folyo yüklü olmalıdır.
  5. Her dil 3 mL steril PBS ile 30 s. gerçekleştir steril koşullarda bu işlem için bir 3,5 cm veya 6 cm kültür tabak içinde yıkayın.
  6. Dilleri Ultrasaf Su ile yıkamak: ampicilin geniş ağız şişe içine steril Ultrasaf Su 250 mL ile 90 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Dilleri içeren bir heyecan bar şişe içine koymak. Şişe kapağı şişe dışında kalan dikiş parçası ile sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirmek.
    Not: en fazla 5 dilleri dikiş twining söz konusu aynı şişe içine koyabilirsiniz. Folyo şişe dil kapalı kaymasını önlemek için dikiş sonu altındadır. Dilleri şişe içinde kalan dikiş uzunluğunu ayarlayarak şişenin alttan 2 cm yüksekliğinde yerleştirilmelidir. Bu Not için adımları 1.8, 1.10, 1.12 ve 1,16 da.
  7. Manyetik karıştırıcı 12 h için şişe koymak.
  8. Dilleri NaCl ile yıkayın: ampicilin geniş ağız şişe içine steril 1 250 mL ile eklemek M NaCl 90 µg/mL nihai bir konsantrasyon için. Dilleri ve heyecan bar şişe içine taşıyın. Şişe kapağı şişe dışında kalan dikiş parçası ile sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirmek.
  9. Manyetik karıştırıcı 24 h için şişe koymak.
  10. Hücre lizis Triton X-100 tarafından: 90 µg/mL 250 mL steril % 2 ile son bir konsantrasyon geniş ağız şişe içine ampicilin eklemek PBS Triton X-100. Dilleri ve heyecan bar şişe içine taşıyın. Şişe kapağı şişe dışında kalan dikiş parçası ile sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirmek.
  11. Manyetik karıştırıcı 48 h için şişe koymak.
  12. Dilleri CaCl2/MgCl2yıkama: ampicilin geniş ağız şişe içine steril 5 mM CaCl2/MgCl2 250 mL ile 90 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Dilleri ve heyecan bar şişe içine taşıyın. Şişe kapağı şişe dışında kalan dikiş parçası ile sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirmek.
  13. Manyetik karıştırıcı 24 h için şişe koymak.
  14. DNaz tarafından sindirim: Hank'in 1 mL dengeli tuz solüsyonu (HBSS) her EP tüp için ekleyin. DNaz HBSS sırasıyla 300 son bir konsantrasyon için eklemek µM. taşımak her dil tüp dışında dikiş parçası ile her EP tüpün içine. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirmek.
    Not: yukarıdaki adımı şişelerde içinde kalır dikiş parçası da bu adımda EP tüp içinde kalır emin olun ve önceki adımları şişelerde dışında kalır dikiş parçası da bu adımda EP tüp dışında kalır emin olun.
  15. EP tüpler için 24 h 37 ° C'de dilleri kuluçkaya.
  16. Dilleri PBS ile yıkayın: ampicilin geniş ağız şişe içine steril PBS 250 mL ile 90 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Dilleri ve heyecan bar şişe içine taşıyın. Şişe kapağı şişe dışında kalan dikiş parçası ile sıkın. Bu işlemi steril koşullarda gerçekleştirmek.
  17. Manyetik karıştırıcı 24 h için şişe koymak.
  18. Hazırlanan TEM 4 ° C'de steril PBS kadar kullanmak saklayın.

2. TSCC üç boyutlu (3D) sulandırma

  1. Statik TSCC modeli İnşaat
    1. Tohum 1.0 x 106 tek TSCC hücreler (Cal27) 3.5 cm kültür çanak içine. Dulbecco'nın 3 mL kartal orta/F12 (DF12) içeren % 10 fetal Sığır serum (FBS), 90 µg/mL ampicilin ve 90 µg/mL sefaloridin modifiye ekleyin.
    2. Cal27 hücreleri 37 ° C'de 2-3 gün için kültür. Hücreleri en az % 60 cover emin olun alan çanak alt.
    3. TEM Cal27 monolayer kültür tabağına üzerine yükleyin.
    4. Çanak 28 gün boyunca bir CO2 kuluçka 37 ° C'de koyun.
    5. Kültür Orta hücre kültür işlemi sırasında her gün yenileyin. Kuluçka CO2 konsantrasyonu % 5 var.
  2. Karıştırılmış TSCC modeli İnşaat
    1. Kendi yaptığınız karıştırılmış minibioreactor hazırlanması
      1. Dalgıç 10 mL şırınga dan çıkar.
      2. Çubuk daha düşük terminal bir delik (1 cm çapında) kazmak ve delik bir heyecan bar yük.
      3. Bir delik (çapı 0.5 cm) geniş ağız şişe Plastik şişe kapağı merkezinde kazmak ve piston kolu ile kap koymak.
      4. 50 mL santrifüj tüpü yarısı kesilmiş ve şişe kapağı dış tarafında kaynak.
      5. Eşyaları için çubuk çubuk eşyaları için bağlı balıkçılık satırlar ile sarma tarafından iliştirin.
        Not: en fazla 4 eşyaları bir çubuk için eklenebilir.
      6. Otoklav kullanmadan önce kendi kendine yapılan karmaşık.
        Not: değil basınçlı kap plastik geniş ağız şişe var. Yeni bir steril plastik geniş ağız şişe hücre kültürü çalışmalarının ise kullanın.
  3. Dinamik hücre kültürü
    1. Tohum 1.0 x 106 tek Cal27 hücrelerde kendi kendine yapılan minibioreactor. %10 FBS, 90 µg/mL ampicilin ve 90 µg/mL sefaloridin içeren DF12 orta 150 mL ekleyin.
    2. TEM çubuk bağlı eşyaları kullanarak minibioreactor üzerine yükleyin.
    3. Şişe kapağı sıkın ve minibioreactor bir manyetik karıştırıcı tarih koymak. CO2 kuluçka 37 ° C'de 200 devirde minibioreactor 7-14 gün için etkinleştirin.
      Not: CO2 kuluçka CO2 konsantrasyonu % 5 olduğunu.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı TEM hazırlanması için verimli ve uygun olduğu ortaya çıkıyor. TEM anadili kurcalayarak kıyasla mükemmel decellularization gösterdi. Decellularization etkinliğini hematoksilen-(Şekil 1A-B) boyama eozin tarafından (o) doğrulandı. Sonuçları boyama o nükleer TEM (Şekil 1B) boyama tam ortadan kalkması saptandı. Ayrıca, önceki işten DNA içerik miktar DNA TE...

Tartışmalar

Decellularized ECM imalat için köklü bir protokol dokularda hücresel bileşenleri kaldırma sırasında yerel ECM kompozisyon tutmak gerekir neredeyse tamamen21. Perfüzyon konvektif taşıma ile hücresel malzemeleri kaldırmak için damarlara aracılığıyla gerektiren şu anda bildirilen decellularization protokolleri rağmen mekanik ajitasyon burada, geleneksel basit ve ucuz Yöntem22 bilinen kabul edilmiştir , 23 ,

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar, Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31371390), devlet yüksek teknoloji geliştirme projesi (2014AA020702) programı ve programın Guangdong bilim ve teknoloji (2016B030231001) araştırma hibe destek kabul etmiş oluyorsunuz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
C57-BL/6J miceSun Yat-sen University Laboratory Animal Center
EthanolGuangzhou Chemical Reagent FactoryHB15-GR-2.5L
Sodium chlorideSangon BiotechA501218
Potassium chlorideSangon BiotechA100395
Dibasic Sodium PhosphateGuangzhou Chemical Reagent FactoryBE14-GR-500G
Potassium Phosphate Monobasic Sangon BiotechA501211
1.5 mL EP tubeAxygenMCT-150-A
Ultra-low temperature freezer Thermo Fisher Scientific
3.5 cm cell culture dishThermo Fisher Scientific153066
6 cm cell culture dishGreiner628160
Triton X-100Sigma-AldrichV900502
Calcium chlorideSigma-Aldrich746495
Magnesium chlorideSigma-Aldrich449164
DNaseSigma-AldrichD5025
Magnesium sulphateSangon BiotechA601988
GlucoseSigma-Aldrich158968
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761
AmpicillinSigma-AldrichA9393
KanamycinSigma-AldrichPHR1487
Surgical sutureShanghai Jinhuan
250 mL wide-mouth bottleSHUNIU1407
Magnetic stirrerAS ONE1-4602-32
CO2 incubatorSHEL LABSCO5A
10 mL syringeHunan Pingan
50 mL centrifuge tubeGreiner227270
Cal27 cellChinese Academy of Science, Shanghai Cell BankTongue squamous cell carcinoma cell line
U2OS cellChinese Academy of Science, Shanghai Cell BankHuman osteosarcoma cell line
DMEM/F12Sigma-AldrichD0547
Sodium pyruvateSigma-AldrichP5280
Hepes free acidBBIA600264
FBSHycloneSH30084.03
4 °C fridgeHaier
Water purifierELGA
HemocytometerBLAU717805

Referanslar

  1. Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer. J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).
  2. Patel, S. C., et al. Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years. J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).
  3. Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).
  4. Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart. Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).
  5. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
  6. Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. J. Vis. Exp. (6), e50059 (2012).
  7. Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).
  8. Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
  9. Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
  10. Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).
  11. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
  12. Bonvillain, R. W., et al. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).
  13. Daly, A. B., et al. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).
  14. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
  15. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
  16. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).
  17. Wallis, J. M., et al. Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization. Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).
  18. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  19. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat. Med. 19, 646-651 (2013).
  20. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  21. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  22. Song, J. J., Ott, H. C. Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds. Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).
  23. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
  24. Shamis, Y., et al. Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells. Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).
  25. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).
  26. Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarsay 136h cre d matriksdecellularizationdiloral Skuam z H cre Karsinomubiyoreakt rmodeli n aat

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır