Fabrication de langue matrice extracellulaire et Reconstitution de langue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Résumé

Une méthode est indiquée ici, pour la préparation de la matrice extracellulaire de langue (TEM) avec DÉCELLULARISATION efficace. Le TEM peut servir d’échafaudages fonctionnelles pour la reconstruction d’un modèle de carcinome épidermoïde (TSCC) langue maternelle dans des conditions de culture statique ou agité.

Résumé

Afin de construire un modèle efficace et réaliste pour langue épidermoïde carcinome (TSCC) in vitro, les méthodes ont été créés pour produire DECELLULARISE langue matrice extracellulaire (TEM) qui prévoit les échafaudages fonctionnelles TSCC construction. TEM prévoit une niche in vitro la croissance cellulaire, la différenciation et la migration cellulaire. Les microstructures de native matrice extracellulaire (ECM) et des compositions biochimiques conservées dans la matrice DECELLULARISE fournissent des créneaux spécifiques des tissus pour l’ancrage des cellules. La fabrication du TEM peut être réalisée par digestion désoxyribonucléase (DNase) accompagnée d’un graves de prétraitement organique ou inorganique. Ce protocole est facile à utiliser et assure un rendement élevé pour la DÉCELLULARISATION. Le TEM a montré favorable cytocompatibility pour cellules TSCC dans des conditions de culture statique ou agité, qui permet la construction du modèle TSCC. Un self-made bioréacteur a également été utilisé pour la condition remuée persistante pour la culture cellulaire. TSCC reconstituée à l’aide de TEM a montré les caractéristiques et les propriétés ressemblant à l’histopathologie TSCC clinique, ce qui suggère le potentiel en recherche TSCC.

Introduction

La langue a diverses fonctions importantes, comme la déglutition, articulation et dégustation. Ainsi, l’altération de la fonction de la langue a grand impact sur la qualité de vie de patients'¹. La malignité plus courante dans la cavité buccale est langue carcinome spinocellulaire (TSCC), qui survient généralement chez les personnes qui boivent de l’alcool ou fument du tabac².

Ces dernières années, petits progrès ont été accomplis dans la recherche fondamentale sur le TSCC. Le manque de recherche efficace in vitro des modèles reste un des plus grands problèmes. Ainsi, la matrice extracellulaire (ECM) s’avère pour être une solution potentielle. ECM étant une trame réseau complexe composée de constituants de la matrice hautement organisée, échafaudage matières ayant un ECM-comme la structure et la composition seraient compétentes pour la recherche sur le cancer. ECM DECELLULARISE peut parfaitement fournir la niche pour les cellules de la même origine in vitro, qui s’avère pour être le plus important avantage d’ECM.

ECM peut être gardé avec les composants cellulaires étant retirés les tissus par le biais de la DÉCELLULARISATION à l’aide de détergents et enzymes. Divers composants de l’ECM, notamment de collagène, fibronectine et laminine dans la matrice DECELLULARISE prévoient un micro-environnement natif-tissu-comme des cellules, favorisant la survie, la prolifération et la différenciation des cellules³. En outre, l’immunogénicité destinés à la transplantation peut être réduite à un niveau minimal avec l’absence des composantes cellulaires dans l’ECM.

Jusqu'à présent, les méthodes de fabrication chez ECM DECELLULARISE ont été essayées dans différents tissus et organes, tels que le coeur^4,5,6,7, foie^{8,9,10 ,11}, poumon^{12,13,14,15,16,17}et rein^{18,19 , 20}. Toutefois, aucune recherche pertinente n’a se trouve sur un travail semblable dans la langue au meilleur de nos connaissances.

Dans cette étude, matrice extracellulaire DECELLULARISE langue (TEM) a été fabriquée tant efficacement et à moindre coût par une série de traitement physique, chimique et enzymatique. Puis le TEM servait à récapituler TSCC in vitro, montrant une simulation appropriée pour TSCC comportement et le développement. TEM a bonne biocompatibilité, mais aussi la capacité de guider les cellules à la niche tissu-spécifique, ce qui indique que TEM mai ont un grand potentiel dans le TSCC recherche³. Le protocole présenté ici offre un choix pour les chercheurs qui étudient sur la pathogénie ou thérapies cliniques du TSCC.

Protocole

Tous les travaux d’animaux a été effectuée conformément à la Loi sur le bien-être animal, lignes directrices et approuvé par animalier institutionnel et le Comité de l’urbanisme, de l’Université Sun Yat-sen.

1. préparation du TEM

1. Exécuter des souris par dislocation cervicale et retirer les languettes à l’aide de la pince à épiler et des ciseaux chirurgicaux stériles.
2. Plonger les languettes dans l’éthanol à 75 % pendant 3 min, puis mettre chaque langue dans un 1,5 mL tube Eppendorf (EP) avec 1 mL de phosphate stérile 10 mM mis en mémoire tampon solution (PBS).
   Remarque : La concentration de PBS dans toutes les étapes suivantes est identique à la concentration dans cette étape.
3. Lyse de la cellule de congélation décongélation : geler les languettes dans les tubes EP à-80 ° C pendant 1 h et ensuite décongeler les languettes à température ambiante pendant 45 min pour 3 cycles.
4. Chargez chaque langue sur un morceau de suture chirurgicale à l’aide d’une aiguille chirurgicale et enrouler l’extrémité de la suture avec un petit morceau de papier d’aluminium stérile. Effectuer l’opération dans une boîte de Petri 3,5 cm ou 6 cm contenant 75 % d’éthanol dans des conditions stériles.
   Remarque : La durée de chaque morceau de suture chirurgicale adéquate est d’environ 20 cm et la taille appropriée de chaque morceau de papier d’aluminium est d’environ 0,3 cm² (1 cm × 0,3 cm). La langue doit être chargée près de la feuille d’étain.
5. Rincer avec 3 mL de PBS stérile, chaque langue dans une boîte de Petri 3,5 cm ou 6 cm pendant 30 s. effectuer cette opération dans des conditions stériles.
6. Laver la langue avec de l’eau ultrapure : ajoutez ampicilin dans un flacon de large-bouche avec 250 mL d’eau ultrapure stérile à une concentration finale de 90 µg/mL. Mettre les langues dans le flacon contenant une barre de remuer. Serrer le bouchon de la bouteille avec une partie de la suture restaient en dehors de la bouteille. Effectuer cette opération dans des conditions stériles.
   NOTE : Jusqu'à 5 langues peuvent être mis dans la même bouteille en contrepartie de l’enroulement du fil de suture. La feuille d’étain est à la fin de la suture dans la bouteille pour empêcher la langue de glisser. Les langues doivent être placés à 2 centimètres du fond de la bouteille en ajustant la longueur de la suture restant à l’intérieur de la bouteille. Cette note est également pour obtenir la procédure 1.8, 1.10, 1.12 et 1,16.
7. Mettre la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 12 h.
8. Laver les languettes avec NaCl : ajoutez ampicilin dans une bouteille de large-bouche avec 250 mL de stérile 1 M NaCl à une concentration finale de 90 µg/mL. Déplacez les langues et le bar de l’émoi dans la bouteille. Serrer le bouchon de la bouteille avec une partie de la suture restaient en dehors de la bouteille. Effectuer cette opération dans des conditions stériles.
9. Mettre la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 24 h.
10. Cell lyse par Triton X-100 : Ajouter ampicilin à une concentration finale de 90 µg/mL dans un flacon à large ouverture avec 250 mL de stérile 2 % Triton X-100 dans du PBS. Déplacez les langues et le bar de l’émoi dans la bouteille. Serrer le bouchon de la bouteille avec une partie de la suture restaient en dehors de la bouteille. Effectuer cette opération dans des conditions stériles.
11. Mettre la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 48 h.
12. Laver la langue avec CaCl₂/MgCl₂: Ajouter ampicilin dans un flacon de large-bouche avec 250 mL de stérile 5 mM CaCl₂/MgCl₂ à une concentration finale de 90 µg/mL. Déplacez les langues et le bar de l’émoi dans la bouteille. Serrer le bouchon de la bouteille avec une partie de la suture restaient en dehors de la bouteille. Effectuer cette opération dans des conditions stériles.
13. Mettre la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 24 h.
14. Digestion par la DNase : ajouter 1 mL de Hank équilibré de solution saline (HBSS) dans chaque tube de EP. Ajouter DNase dans HBSS respectivement à une concentration finale de 300 µM. remuer chaque langue dans chaque tube de EP, avec une partie de la suture à l’extérieur du tube. Effectuer cette opération dans des conditions stériles.
    Remarque : Assurez-vous que la partie de la suture qui reste à l’intérieur des bouteilles dans les étapes précédentes reste également à l’intérieur du tube pour pé dans cette étape et s’assurer que la partie de la suture qui reste à l’extérieur des bouteilles dans les étapes précédentes reste également à l’extérieur du tube pour pé dans cette étape.
15. Incuber les languettes en EP tubes à 37 ° C pendant 24 h.
16. Laver la langue avec du PBS : ajoutez ampicilin dans un flacon de large-bouche avec 250 mL de PBS stérile à une concentration finale de 90 µg/mL. Déplacez les langues et le bar de l’émoi dans la bouteille. Serrer le bouchon de la bouteille avec une partie de la suture restaient en dehors de la bouteille. Effectuer cette opération dans des conditions stériles.
17. Mettre la bouteille sur un agitateur magnétique pendant 24 h.
18. Conserver le TEM préparé dans du PBS stérile à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.

2. en trois dimensions (3D) Reconstitution du TSCC

1. Construction du modèle TSCC statique
   1. Semences 1,0 x 10⁶ TSCC monocellules (Cal27) dans une boîte de Petri de 3,5 cm. Ajouter 3 mL de Dulbecco modifiée d’aigle moyen/F12 (DF12) contenant 10 % bovin sérum fœtal (SVF), ampicilin de 90 µg/mL et 90 µg/mL kanamycine.
   2. La culture des cellules Cal27 à 37 ° C pendant 2 à 3 jours. Assurez-vous que les cellules portent sur au moins 60 % zone du fond plat.
   3. Chargez TEM à la monocouche Cal27 dans la boîte de Pétri.
   4. Mettre le plat dans un incubateur à CO₂ à 37 ° C pendant 28 jours.
   5. Actualiser le milieu de culture tous les jours pendant le processus de culture cellulaire. La concentration de CO₂ dans l’incubateur est de 5 %.
2. Construction de modèle TSCC brassée
   1. Préparation d’un self-made minibioreactor brassé
      1. Retirez le piston d’une seringue de 10 mL.
      2. Creusez un trou (diamètre de 1 cm) près de la borne inférieure de la tige et charger un bar sauté dans le trou.
      3. Creusez un trou (diamètre de 0,5 cm) au centre de la capsule d’une bouteille en plastique de large-bouche et mettre la tige de piston par la PAC.
      4. Couper la moitié d’un tube à centrifuger 50 mL et souder sur le côté extérieur du bouchon de la bouteille.
      5. Fixer des hameçons à la tige en encapsulant la tige avec des lignes de pêche qui sont liés à l’hameçons.
         NOTE : Jusqu'à 4 hameçons peuvent être fixés à une tige.
      6. Autoclave le self-made complexe avant utilisation.
         Remarque : Ne pas stériliser la bouteille en plastique de large-bouche. Utilisez un nouveau flacon stérile de large-bouche en plastique tout en cultivant les cellules.
3. Culture cellulaire dynamique
   1. Semences 1,0 x 10⁶ Cal27 cellules individuelles dans le self-made minibioreactor. Ajouter 150 mL de milieu de DF12 qui contient 10 % FBS, 90 µg/mL ampicilin et kanamycine 90 µg/mL.
   2. Chargez TEM à le minibioreactor à l’aide de l’hameçons fixés à la tige.
   3. Serrer le bouchon de la bouteille et mettre le minibioreactor sur un agitateur magnétique. Activer le minibioreactor à 200 tr/min dans un incubateur à CO₂ à 37 ° C pendant 7 à 14 jours.
      Remarque : La concentration de CO₂ dans un incubateur à CO₂ est de 5 %.

Résultats

Ce protocole pour la préparation du TEM s’avère pour être efficace et approprié. Le TEM a montré parfaite DÉCELLULARISATION comparée aux tissus de la langue maternelle. L’efficacité de DÉCELLULARISATION a été confirmée par l’hématoxyline-éosine (HE) coloration (Figure 1A-B). Coloration des résultats qu’il a révélé une disparition complète de la coloration des noyaux en TEM (Figure 1

Discussion

Un protocole bien établi pour la fabrication de ECM DECELLULARISE devrait conserver la composition ECM native tout en supprimant les composants cellulaires dans les tissus presque complètement²¹. Malgré les protocoles actuellement déclarés DÉCELLULARISATION nécessitant une perfusion par le système vasculaire pour enlever les matériaux alvéolaires par transport convectif, agitation mécanique a été adoptée ici, connu comme une méthode simple et bon marché traditionnelle

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57-BL/6J mice	Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-2.5L
Sodium chloride	Sangon Biotech	A501218
Potassium chloride	Sangon Biotech	A100395
Dibasic Sodium Phosphate	Guangzhou Chemical Reagent Factory	BE14-GR-500G
Potassium Phosphate Monobasic	Sangon Biotech	A501211
1.5 mL EP tube	Axygen	MCT-150-A
Ultra-low temperature freezer	Thermo Fisher Scientific
3.5 cm cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	153066
6 cm cell culture dish	Greiner	628160
Triton X-100	Sigma-Aldrich	V900502
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	746495
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	449164
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Magnesium sulphate	Sangon Biotech	A601988
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9393
Kanamycin	Sigma-Aldrich	PHR1487
Surgical suture	Shanghai Jinhuan
250 mL wide-mouth bottle	SHUNIU	1407
Magnetic stirrer	AS ONE	1-4602-32
CO2 incubator	SHEL LAB	SCO5A
10 mL syringe	Hunan Pingan
50 mL centrifuge tube	Greiner	227270
Cal27 cell	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Tongue squamous cell carcinoma cell line
U2OS cell	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Human osteosarcoma cell line
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Hepes free acid	BBI	A600264
FBS	Hyclone	SH30084.03
4 °C fridge	Haier
Water purifier	ELGA
Hemocytometer	BLAU	717805