JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz aynı anda mekanik test tarif ve insan direnç arterler ve elastin ve kolajen mekansal organizasyon ve birim yoğunlukları miktar için Fiji ve Ilastik görüntü analizleri 3D görüntüleme izole, atardamar duvarı yaşıyor. Atardamar duvarı mekaniğinin matematiksel modellerinde bu veri kullanımını tartışın.

Özet

Direnç arter yeniden patojenik katkı temel hipertansiyon, şeker hastalığı ve metabolik sendrom belgelenmiştir. Araştırma ve Geliştirme Sağlık ve hastalık insan direnç arterlerde mekanik özelliklerini anlamak için microstructurally motive matematiksel modellerin anlama yardım potansiyeli var nasıl hastalık ve tıbbi tedaviler insan mikro etkiler. Bu matematiksel modeller geliştirmek için mikrovasküler duvar mekanik ve mikro mimari özellikleri arasındaki ilişkiyi çözmeye esastır. Bu çalışmada, pasif mekanik test ve mikro mimarisi izole insan direnç arter arter duvarındaki kollajen ve elastin eşzamanlı etiket içermeyen üç boyutlu görüntüleme için bir ex vivo yöntemi açıklanmaktadır. Görüntüleme Protokolü ilgi herhangi bir tür direniş arterler için uygulanabilir. Görüntü analizleri i) basınç kaynaklı değişimler iç elastik lamina dallanma açıları ve Fiji ve Ilastik yazılım kullanarak kararlı II) kolajen ve elastin birim yoğunlukları kullanarak adventitial kollajen doğruluk miktarının için açıklanmıştır. Tercihen canlı, derin arterler üzerinde tüm mekanik ve görüntüleme ölçümler gerçekleştirilir, ancak, alternatif bir yaklaşım standart video mikroskobu basınç birlikte myography ile yeniden basınçlı kapların sonrası fiksasyon Imaging'i kullanma tartışıldı. Bu alternatif yöntem kullanıcılara çözümleme yaklaşımlar için farklı seçenekler sağlar. Atardamar duvarı mekaniğinin matematiksel modeller mekanik ve görüntüleme verilerde dahil anlatılan ve gelecekteki gelişimi ve protokol eklemeler önerildi.

Giriş

Patojenik katkı ve direnç arter remodeling etkilerini temel hipertansiyon, şeker hastalığı ve metabolik sendrom1,2,3,4,5belgelenmiştir. Mikrovasküler duvar mekanik ve mikro mimari özellikleri arasındaki ilişki deşifre bu ilişkinin matematiksel modeller geliştirmek için önemlidir. Modelleri gibi remodeling işlemini anlama artıracak ve geliştirilmesi için test farmakolojik stratejileri atardamar duvarı yeniden hedefleme hastalığı ile ilgili yararlı silis modellerinde destekleyecektir.

Önceki çalışmalar nasıl mikro mimarisi Arteryel duvardaki Arteryel duvar mekaniği için mekanik önlemler içeren ile ilgilidir ve hücre dışı Matriks (ECM) mikro mimarisi neredeyse sadece büyük üzerinde gerçekleştirilir anlamakta odaklı , elastik conduit arterler fareler veya domuz6,7,8,9,10,11. Duvardaki microstructures görüntüleme genellikle tarafından kollajen, elastin ve ikinci harmonik üretimi autofluorescence yararlanarak doğrusal olmayan optik teknikleri kullanılarak gerçekleştirilir. Bu iki önemli bileşeni hücre dışı Matriks, elastin ve kolajen, boyama için ihtiyaç olmadan kronolojik zamanmekansal görüntüleme sağlar. Arteryel duvardaki tam kalınlıkta görüntüleme dağılım kalın tunica medya ışık nedeniyle büyük boru arterler bir mücadeledir. Ancak, nasıl mikro mimarisi Arteryel duvardaki yapısal bileşenlerinin ilgili gözlenen mekanik özellikleri belirlemek için üç boyutlu bilgi mekanik test sırasında alınması gerekir. İnsan aort gibi büyük arterler için bu biaxial montaj, mekanik test ve 1-2 cm2 adet atardamar duvarı7,9,10, ilgi bölgelerin Imaging gerektirir 12. yansıma ve mekanik test sadece duvar parçası.

Daha küçük arterlerin eden her türü için (örneğin, insan Perikardiyal13, pulmoner14 ve subkutan15 arterler, sıçan Mezenterik arterler16,17,18, 19 , 20, fare cremaster, Mezenterik, beyin, femur ve Karotid arter21,22,23,24,25,26, tüm duvar kalınlığı 27) görüntüleme mümkündür ve mekanik test ile birleştirilebilir. Bu mekanik özellikleri ve duvar içinde yapısal düzenlemeler aynı anda kayıt sağlar. Ancak, doğrudan bir matematiksel modelleme ECM üç boyutlu yapısını gözlenen değişiklikler ve direnç Arteryel duvardaki, değiştirilen mekanik özelliklerinin arasındaki ilişkinin sadece bizim bilgi en iyi şekilde bildirilmiştir üzerine Son zamanlarda insan direnç arterler13,15' te.

Bu çalışmada, pasif mekanik test ve mikro mimarisi izole insan direnç arter arter duvarındaki kollajen ve elastin aynı anda üç boyutlu görüntüleme için bir ex vivo yöntemi açıklanmıştır. Görüntüleme Protokolü ilgi herhangi bir tür direniş arterler için uygulanabilir. Görüntü analizleri iç elastik lamina dallanma açıları ve adventitial kollajen doğruluk13 Fiji28kullanarak elde etmek için açıklanmıştır. Kollajen ve elastin birim yoğunlukları Ilastik yazılım29 kullanarak belirlenir ve son olarak, atardamar duvarı mekaniğinin matematiksel modeller mekanik ve görüntüleme verilerde dahil tartışılmaktadır.

Görüntüleme ve görüntü analizi teknikleri matematiksel modelleme ile birlikte olan müfettişler anlamak ve açıklamak için sistematik bir yaklaşım sağlamak için açıklayan amacı direnç arterler ECM indüklenen basınç değişiklikleri görülmektedir. Açıklanan yöntemi bir gemi ECM değişimler basınçlandırma sırasında 20, 40 ve 100 mmHg, ECM yapısını karşılaştırarak miktarının içinde odaklanmıştır. Bu baskılar sırasıyla daha uyumlu (20 mmHg), sert (100 mmHg) ve ara (40 mmHg) durumu, Arteryel duvar yapısını belirlemek için seçilmiştir. Ancak, herhangi bir işlem indüklenen vazoaktif bileşenleri, histeresis ve akış, değişiklikler de dahil olmak üzere canlı damar damar duvarında, araştırmacı tarafından söz konusu araştırma hipotezi bağlı olarak sayısal.

İki fotonlu uyarma Floresans mikroskobu (TPEM) canlı arter basıncı myograph basınç (veya diğer) indüklenen eğitim değişikliklere ECM ile birlikte kullanımı olduğunu vurguladı. Bu yüksek kaliteli üç boyutlu etiket içermeyen edinimi ile birlikte Arteryel duvardaki (çap ve duvar kalınlığı) genel olarak üç boyutlu yapısının aynı anda satın alma izin verdiğinden, ilk olarak, kolajen ve elastin görüntülerini ayrıntılı microarchitectures autofluorescence elastin ve kolajen ikinci harmonik üretimi sinyal (SHG)30yararlanan tarafından açıklanan13 olarak. İkinci olarak, TPEM düşük enerjili yakın kızılötesi uyarma ışık, doku ve böylece, vasküler duvar içinde tam olarak aynı konumda tekrarlanan görüntüleme duyarlilik en aza indirerek, izin tekrarlanan ölçüler analizlerini gözlenen izin verilir sağlar değiştirir.

TPEM erişimi olmayan kullanıcılar açıklanan yöntemi de kullanmak bir fırsat sağlamak için alternatif bir yaklaşım arter sabit basınç confocal Imaging'i kullanma kullanımı açıklanmıştır. Bilgi ECM yapısı ve birim yoğunluğunu da dokuların seri,31,32tarafından açıklanan olarak örneğin kesitli iki boyutlu analizler alınabilir. Ancak, arter yanı sıra bu yöntemi kullanarak koşulları değiştirme sırasında uzunluğu ölçekler üzerinde üç boyutlu yapısal bilgi almak imkanı olmaması nedeniyle öyle bir baskı araştırmalar için bu yaklaşım kullanmanızı öneririz değil ve tedavi ECM üç boyutlu değişiklikler indüklenen.

Burada açıklanan yöntemi uygulamak için dedektif için en düşük gereksinimi cannulation ve basınçlandırma arter confocal veya İki fotonlu uyarma floresan mikroskop ile birlikte bir kurulum için erişimdir. Aşağıdaki iletişim kuralında tanımlanan bir ölçüye göre baskı myograph özel yapılı ters İki fotonlu uyarma floresan mikroskop üzerinde sığdırmak için inşa bir boyuna güç çevirici ile kurulumudur.

Protokol

Bu eser olarak kullanılmak üzere insan parietal kalp zarını biyopsi topluluğu yazılı onay sonra yukarıda açıklanan33gerçekleştirildi. Çalışma insan dokuların Helsinki Bildirgesi34 özetlenen ilkelere uygun olması ve Sağlık Araştırma etik Güney Danimarka (S-20100044 ve S-20140202) ve Danca veri koruma ajansı için bölgesel Komiteler tarafından kabul edildi.

1. doku ve izole (insan) direnç arter toplamak

  1. Doku örnekleri hemen sonra bir cerrahi eksizyon ilgi toplamak. Transferi doku 4 ° c HEPES fizyolojik tuz solüsyonu (HBS) hemen koleksiyon üzerine arabelleğe alınmış ve HBS içinde saklayın.
    Not: İnsan doku sadece onayını hastaların yazılı Onam yanı sıra ilgili Kurumsal ve etik Komiteler tarafından toplanır. HBS kompozisyon mm: NaCl 144, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1,2, KH2PO4 1.2, HEPES 14,9, glikoz 5.5. NaOH ile pH 7.4 ayarlamak ve çözüm olsa 0.2 µm filtre.
  2. Toplanan doku 4 ° C'de steril HBS anestezikler yıkamak için gece bırakın.
    Not: Gece depolama gemi bütünlüğü ve işlevselliği üzerinde herhangi bir etkisi bireysel araştırma laboratuvarı tarafından kontrol edilmelidir.
  3. Dikkatli bir çift keskin uçlu forseps ve mikro-diseksiyon makası kullanarak boyutlu direnç arterler (± 200 µm Lümen çapı) izole et.
  4. 4 ° C'de arterler içinde buz gibi HBS görüntüleme/basınç odasında priming saklayın.

2. basınç Myograph izole arter montaj

  1. Cam Kanüller ~ 80 µm uç çapı Kanüller tutucular bağlayın. İpuçları yaklaşık 150 µm odası cam alt üzerinde konumlandırın.
    Not: 45° kıvrık ucu Kanüller cam alt yukarıda geminin hassas konumlandırma izin verebilir.
  2. Giriş ve çıkış boru HBS ile % 1 BSA ile doldurun ve basınç sisteme bağlayın.
    Not: BSA endotel hücre işlevi korumak için eklenmiştir.
  3. İzole arter kanül başına iki çift düğüm dikişler kullanarak bağlayın.
    Not: Deniz mili önceden hazırlanmış ve ihtiyaç kadar Çift Kişilik yapışkan bant üzerinde depolanır.
  4. Odası HBS ile doldurun ve iki kişilik deniz mili her cam kanül yerleştirin.
    Not: myogenic sesi görüntüleme arterler kullanırken, HBS ile ücretsiz HBS 3 µM EGTA ve 3 µM sodyum nitroprusside ile desteklenmiş kalsiyum değiştirilmelidir.
  5. Arter yavaşça iki çift keskin ucu forseps kullanarak bir ucunda tutun. Arter Lümen açın ve yavaşça kanül kaydırın. İki deniz mili kullanarak kanül düzeltmek.
  6. Yavaşça Lümen HBS / % 1 temizlemek için 5 mmHg baskıyı BSA.
  7. Arter diğer ucunu cannulate ve iki kişilik deniz mili kullanarak kanül güvenli.
  8. Myograph mikroskop Sahne Alanı'na transfer ve Arter ile 5 mmHg basınç (giriş basıncı çıkış basıncı =), sonra ısı 37 ° c 30 dk için.
  9. İsteğe bağlı: boyuna kuvvet dönüştürücü üretici yönergelerine (1 g = 9,81 mN) göre kalibre edin.
    Not: Bu sıcaklık duyarlı olduğu için Isıtma sonra güç dönüştürücü ayarlamak için önemlidir.

3. deney gerçekleştirmek: Arter çapı, duvar kalınlığı ve kollajen ve Elastin mikro mimarisi TPEM kullanarak görüntüleme

  1. Hızlı bir şekilde 5 mmHg damar çapı ve duvar kalınlığı 5 mmHg, değerlendirmek için bir 20 X objektif (sayısal diyafram (NA) ≥ 0,8) ve düşük güç uyarma ışığı kullanarak basınç altında cannulated arter tarama.
    Not: bir su daldırma amaç ters mikroskoplar için kullanın; dik mikroskoplar için amaç daldırma bir su kullanın. Amaç kapak notu kalınlığı için düzeltmek için düzeltme tasma varsa, kullanılan amacı ile kullanılan kapak notu eşleştirmek emin olun. Yazılım ayarları ve açıklamalar kullanıcı-interfaz ve mikroskop ve kullanılan yazılıma bağlı olarak değişebilir.
    1. Optik yol Kur.
      1. Mai Tai İki fotonlu lazer etkinleştirmek ve 820 nm uyarma ışık için ayarlayın.
        Dikkat: herhangi bir ışığa maruz kalma görünür hem de görünmez lazer kaçının.
      2. Aynı anda iki kanaldaki emisyon toplamak. Emisyon hafif bir 460 nm uzun pası dikroik ayna ve toplamak emisyon 520 merkezli 30-60 nm geniş bant filtreleri kullanarak kullanarak photomultipliers arasında bölünmüş nm (elastin) ve 410 nm (kollajen), anılan sıraya göre.
    2. Sürekli 10 µs lazer Işınma Zamanı/piksel ve 512 × 512 ile %100 görüntüleme alanı için piksel taranmasını sağlamak.
    3. Maksimum çapı nerede gözlenen derinlik belirlemek için arter el ile inceden inceye gözden geçirmek.
    4. Arter'ın en geniş çaplı kapsayan dikdörtgen bir dilim seçin ve tek bir kare piksel boyutu ≤ 300 nm/piksel (şekil 2C) ile tarayın. Düşük uyarma ışık güç ve piksel Işınma Zamanı photodamaging canlı arter önlemek mümkün olduğunca olarak kullanın.
      Not: Bu dikdörtgen, e.gelde etmek için tavsiye edilir., zaman kazanmak ve doku foton pozlama (şekil 2C) sınırlamak için bu konumda ikinci dereceden görüntü yerine 100 × 1024 piksel görüntü.
    5. Daha sonraki analizler için resmi kaydedin.
  2. Lümen çapı ve duvar kalınlığının arter maksimum çapı, belirler.
    1. Fiji'de resim yükleyin.
    2. Ana menüden tıklayarak ölçeği ayarlayın | Analiz | ayarla ölçek ve µm/piksel ve piksel oranı (yüksek oranda önerilir piksel oranı 1:1 tutmak için) girin.
    3. Fiji çizgi aracını seçin ve Arteryel Lümen her tarafında iki iç elastik lamina arasında bir çizgi çizin ve ctrl + M'ıtıklatın. Fiji uzunluğu sonuçları tablosundaki varsayılan olarak raporlar.
    4. Aynı şekilde, her bir duvar kalınlığını ölçmek için daha fazla çizgi çizmek ve aşağıdaki biçimlendirme ölçmek için ctrl + M'i tıklatın.
    5. Ölçümler kaydedin.
  3. Görüntü mikromimarisi tüm kalınlığı 1-3 bölgeleri arter uzunluğu boyunca ilgi için iyi kalitede 3D görüntü yığınları alma Arteryel duvardaki tarayarak 5 mmHg, kolajen ve elastin.
    1. Görüntü yığınları bir 60 X amaç, NA ≥ 1, en iyi duruma getirilmiş piksel boyutları ve z-aralığı kullanarak arter tüm duvar aracılığıyla elde edilir.
      1. En iyi görüntüleme koşulları (piksel boyutları ve z-adım aralığı) optik yolu, daldırma orta uygun olarak hesaplamak ve kırılma endeksi bilimsel birim görüntüleme Nyquist hesap makinesi (https://svi.nl/NyquistCalculator) kullanarak örnek.
        Not: Burada bölüm 3.4 optimum piksel boyutunu ve z-aralıklarını tavsiye karşı arasındaki fark dikkat ediniz. yukarıda kullanımı en büyük piksel boyutu ile ilgili.
    2. Aynı uyarma ve emisyon olarak yukarıdaki ayarları (3.1.1.) kullanın.
    3. Hızlı bir şekilde gemi duvar z-yığın kalınlığını belirlemek üzere yukarıda açıklandığı gibi tarama.
    4. Z-yığın başlangıç ve bitiş derinlik, z-adım aralığı ve piksel yoğunluğu (3.3.1.1 içinde hesaplanan.) tanımlamak ve z-taraması gerçekleştirin. Her kanalı ayrı ayrı kaydedin.
      Not: Görüntüleri kadar küçük örneğin 30 µm x 30 veya 50 × 50 µm sonraki görüntü analizleri eğrilik herhangi bir etkisi önlemek için gemi boyutuna bağlı olarak olması gerekir.
  4. Arter çapı, duvar kalınlığı ve iletişim kuralının kalan baskılar, elastin ve kolajen mikro mimarisi belirlemek.
    1. 3.1-3.2 baskılar 10 ve 20 mmHg'de tekrar ediyorum, 3.3 basınç 20 mmHg, tekrarlayın.
    2. 3.1 ve 3.2'de basınç 40 mmHg yineleyin.
    3. 3.1-3.2'de baskılara 60, 80 ve 100 mmHg yineleyin ve 3,3 100 mmHg, tekrarlayın.
      Not: 3.1-3,3 tüm baskılar ve baskılar (örneğin bir serisi/arada artan de azalan baskılar), hipotez test edilecek bağlı olarak oluşan birleşimler için tekrar edilebilir. Eozin konsantrasyon 0.3 - 1 µM elastin autofluorescence photobleaching durumunda geliştirmek için eklenebilir. Photobleaching düşük güç uyarma mümkün olduğunca hafif olarak uygulayarak önlenebilir.
    4. Myograph odası arabellekte her basınç adımdan sonra taze 37 ° C HBS ile değiştirin. Arter basıncında her değişiklik şu görüntüleme önce 5 min için uyum sağlar.
  5. Kanal yığınları görüntü analizleri için ayrı ayrı saklar.
  6. Arter canlılığı sınayın.
    1. 10 uygulamak µM U46619 myograph odasında takip 10 µM bradikinin eklenmesi tarafından ne zaman istikrarlı bir daralma görülmektedir.
    2. Çapı ve duvar kalınlığının yukarıda 3.1 her bileşiklerin uygulama aşağıdaki bölümde açıklandığı gibi kaydedin.
    3. Arter tam bradikinin ve kayıt çapı ve duvar kalınlığının eklenmesi aşağıdaki açıldı değil 3 µM sodyum nitroprusside ekleyin.
      Not: diğer vasoconstrictor ve (endotel bağımlı) vazodilatör bileşikler faiz (vasküler yatağın ve türler) arter farmakolojik özelliklerine bağlı olarak kullanılabilir.
  7. İsteğe bağlı: Basınçlı arter düzeltmek veya görüntüleme kollajen ve elastin birim yoğunlukları (7. adım) için devam.
    1. %4 formaldehit 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) 37 ° c için 1 h x ekleyin.
    2. Sabit arter üç kez 1 x PBS yıkama ve yavaşça arter arter düğümleri dışında sadece parçalar dokunmadan Kanüller, kapalı kaydırın. Değil deniz mili kaldırmak için onları bir depolama tüp aktarırken arter tutmak için kullanın.
    3. 1 x PBS / % 0.05 deposunda sodyum azid 4 ° c kadar görüntüleme elastin ve kolajen cilt yoğunluğu veya başka amaçlar için.
      Not:-Ebilmek var olmak stok sabit arterler en az 3 ay 1 x PBS / % 0.05 sodyum azid 4 ° C'de

4. stres zorlanma ilişkileri ve iç duvar sertlik hesaplanması

  1. Formüller ve gerilmeler, suşları ve Bloksgaard, M. ve ark. açıklandığı gibi duvar sertlik hesaplamak için hesaplama adımlarını takip edin 13 ve referansları burada.

5. görüntü analizi - (iç elastik Lamina) IEL dallanma açıları

  1. Fiji açık Görüntü yığınında. Gidin dosyasının | açık görüntü görüntü yığını seçmek için.
    Not: Max yoğunluk projeksiyon 2-7 ardışık z-bölüm IEL (1-2 µm kalınlık) kapsayan IEL elastin lif dallanma açıları Fiji28,35açı aracını kullanarak belirlemek için kullanılır. -Den sözetmek şekil 4A için resim için.
  2. Gidin görüntü | yığınları | z proje..... görüntüleri ve "Max yoğunluk projeksiyon" seçmek için.
  3. Maksimum yoğunluk projeksiyon TIFF olarak kaydedin.
  4. "Açı aracı" kullanarak mümkün olduğunca çok sayıda IEL fiber dallanma noktaları seçin ve sistematik olarak resimlerle çalışmak. Her açı ölçmek için ctrl + M'yi tıklatın.
  5. Fiji sonuçları sayfayı kaydedin.

6. görüntü analizi - Adventitial kollajen dalgalılık

  1. Fiji açık Görüntü yığınında. Gidin dosyasının | açmak görüntü görüntü yığını seçin.
    Not: Max yoğunluk projeksiyon 2-7 ardışık z-bölümleri kollajen dalgalılık Fiji NeuronJ eklenti36 Rezakhaniha, R açıklandığı gibi kullanarak belirlemek için kullanılan kolajen hemen dışında dış elastik lamina (yılan balığı, 1-4 µm kalınlık) kapsayan . ve ark. 37 (Şekil 4B).
  2. Ölçeği ayarlayın. Gidin analiz | ayarla ölçek piksel boyutları girmek için.
  3. Gidin görüntü | yığınları | z proje..... görüntüleri ile çalışmak için ve "Max yoğunluk projeksiyon" seçmek için.
  4. Tıklatarak 8 bitt TIFF görüntü türünü değiştirmek görüntü | türü | 8 bitt ve maksimum yoğunluk projeksiyon TIFF olarak kaydedin.
  5. Fiji nöron J eklentisi kullanarak kollajen lif doğruluk ölçmek.
    1. NeuronJ eklenti açmak Fiji | Eklentileri | Nöron J.
    2. 8 bit TIFF NeuronJ içinde yük görüntü açmak | Dosyayı seçin.
    3. Tracings Ekle' ı tıklatın ve başlangıç ve bitiş her lif tıklatarak analiz etmek için lifleri seçin.
    4. Ölçü tracingstıklatın, (Lf) izleme görüntülemek ve vertex ölçümleri iletişim kutusunda seçin.
  6. L0/Lf hesaplamak excel (veya benzeri) ve sonuçları kaydedebilirsiniz.
    1. Fiji nöron J tracings ve köşeleri çıkış Excel'e kopyala yapıştır (veya benzeri) ve L0 hesaplamak Pythagoras'ın teoremi köşe ölçüler üzerinden kullanarak. Satırdaki ilk ve son noktasını belirtmek hipotenüs uçları pozisyon 2B koordinat sisteminde.
      Not: Devam eden L0/Lf [kollajen lif paket uçtan uca uzunluğu (L0) düz bir çizgi üzerinden / tam uzunluğu (Lf)] 1 yakın bir düzgün kollajen lif gösterir.

7. görüntüleme için kollajen ve Elastin birim yoğunlukları

  1. (Sabit) arter 1 yıkama PBS x ve 15 dakika içinde 1 x PBS karanlıkta 1 µM Eozin leke. Sabit arterler için oda sıcaklığında bu adımı gerçekleştirin.
    Not: Eozin elastin Floresans geliştirir. Numune boyama çözümde uzun süre bırakılırsa Eozin kollajen ve hücre sitoplazma gibi diğer yapıların leke. Diğer yapıların boyama çok yoğun ise, 0.3 µM Eozin konsantrasyonu düşük veya çamaşır yineleyin.
  2. Arter 3 yıkama x 1 x PBS
    1. Sabit arterler için: arter görüntüleme için mount.
      Dikkat: Görüntü olmayan basınçlı kapların herhangi bir geometrik nicel bilgi alınmasını izin vermez. Mutlak miktarları gerekli olduğunda, bunlar her zaman canlı, basınçlı arterler üzerinde alınmalıdır. Ses oranlarına sigara basınçlı arterler üzerinde bu yöntemi ile elde edilebilir.
      1. Yer iki adet Çift Kişilik yapıştırıcı 1-1.5 cm bir nesne camı üzerinde ayrı teyp. Çift Kişilik yapışkan bant yaklaşık 100 µm kalınlığında olduğunu. Teyp takılacak arter çapı eşleştirmek için bir veya daha fazla kat uygulanır.
      2. 10-20 µL PBS, meydanın ortasında camına yerleştirin ve Arter PBS düşüş yerleştirin.
        Not: Açılan olarak küçük ve düz ne zaman montaj kapak notu pozisyon dışında arter iterek önlemek için mümkün olduğunca olmalıdır.
      3. Coverslip yerleştirin ve Çift Kişilik yapışkan bant bastırın.
      4. Rezervuar coverslip ve nesne camı arasında 1 x PBS ile doldurun. Örnek kurutma önlemek için her saat tekrar doldur.
  3. Görüntü-yığınları kollajen ve elastin NA ile 20 X amacı istimal ses yoğunluğu elde etmek > 1 Arteryel duvardaki kadar hala iyi bir optik çözünürlük (2D rakam, 2 G ve 2 H) yaparken mümkün olduğunca kapsayacak.
    Not: bir coverslip altında sabit arter görüntüleme için bir su daldırma hedefi kullanın ve amaç için düşsel hayati arter daldırma bir su kullanın. Amaç kapak notu kalınlığı için düzeltmek için düzeltme tasma varsa, coverslip amaç için eşleşen emin olun. Tercihen en uygun piksel boyutları ve z-aralığı kullanın. Bunlar Nyquist hesap makinesi (Adım 3.3.1.1.) kullanarak hesaplar. Alternatif olarak, en az piksel boyutu 300 nm ve z-1 µm aralığını kullanın. Bu arter içi-tahlil değişkenlik belirlemek kullanıcının izin uzunluğu boyunca üç görüntüleri elde etmek için tavsiye edilir.
  4. 820 nm uyarma ışık ve toplamak emisyon kullanarak 30-60 nm geniş bant filtre kullanarak görüntü elastin merkezli 520 nm.
  5. Görüntü kollajen ve elastin ve diğer autofluorescent proteinler herhangi bir uyarma önlemek için emisyon 10-30 nm geniş bant filtre 495 merkezli kullanarak toplamak 990 nm uyarma ışık kullanarak nm.
  6. Görüntü yığınları her kanalı ayrı ayrı TIFF dosyaları olarak kaydedin

8. görüntü analizi Elastin ve kolajen cilt yoğunlukları Ilastik kullanarak ayıklamak için

  1. Seç dosya tıklayarak Fiji28,35 kullanarak TIFF görüntü yığınları HDF5 için dönüştürmek | Farklı Kaydet... HDF5.
  2. İki veri dosya klasörleri bilgisayar sabit disk, elastin için kollajen görüntü yığınları için sırasıyla oluşturun. İlgili görüntü yığınları ilgili klasörüne kopyalayın.
  3. İki yeni Ilastik projeler sırasıyla Ilastik yazılım, elastin, kollajen, bir tane oluşturun.
    1. Açık Ilastik | Yeni proje oluşturmak | piksel sınıflandırma | Yeni proje | veri ekleme ve 8.2. adımda oluşturduğunuz seçin görüntü klasör.
      Not: Ilastik Sihirbazı'nı izleyin.
  4. Yazılım eğitmek için bir 3D görüntü yığını alın.
    1. Giriş veri uygulaması seçin | ana çalışma alanı alanı | Ham veri sekmesini | Yeni ekle | Ayrı görüntüleri eklemek ve istediğiniz görüntü verileri seçin
  5. İlgili özellikler yazılımı seçin.
    1. Açık özellik seçimi uygulaması | Özellik seçin yeni bir iletişim kutusu açılır. Şekil 5A Ayrıntılar için bkz.
  6. Eğitim uygulaması altında Etiket Ekle düğmesini kullanarak en az iki etiket ekleyin.
    Not: Her etiket ayrılması gereken bir nesne türüne karşılık gelir. Bu çalışmada, üç etiket elastin için kullanılır: elastin kendisi, parlak noktalar (hariç için) ve (hariç) arka planı.
  7. Etiketleri ek açıklama aracı tarz boya fırçası kullanarak ham görüntü yığını üzerine çizin.
    1. Uygun etiket seçin: fırça aracı ve çizim Başlat'ı tıklatın.
  8. Görüntü yığını analiz etmek ve Live Update etkinleştir'itıklatarak benzer özellikleri arayın Ilastik-e sevketmek.
  9. Dikkatle tahmin harita (şekil 5 d) kontrol edin.
    Not: Ham görüntü işleminden tam tahmin Haritası şekil 5' te gösterilmiştir. Görüntü segmentlere ayırmak için tahmin harita yığını hangi etiket bir piksel olması daha muhtemeldir göre Ilastik kullanır (şekil 5 d) ilişkili.
  10. Bir eşik uygulanır.
    1. Eşik uygulamasıseçin, seçin bir uygun yöntemi, giriş etiket, pürüzsüz, eşik ve filtre parametrelerini boyutu ve son olarak Uygula'yı tıklatın.
      Not: Bu görüntünün benzer şekilde etiketlenmiş parçalarını ayrı nesneler olarak harmanlama. Elastin ve kollajen gibi son derece bağlı doku ayrılmış olabilir gerekmez, bu nedenle, bir eşiği 0,4 uygulanır (0,5 varsayılandır). Şekil 5E ve 5F bir eşik uygulandıktan sonraki sonucu göstermektedir.
  11. Sonuç tatmin edici kadar Ilastik eğitim yineleyin (sırasıyla kollajen elastin yalnızca tanınan ilgili analizler için).
    1. Sık eğitim ve bölümleme (ve bazen de eşik) arasında geçiş yapma küçük uygulamalar bu işlem sırasında. Ilastik yeniden eğitim etkisini örneği şekil 6' da gösterilmiştir.
  12. Toplu iş benzer görüntü verilerini analiz: seçin toplu iş tahmin giriş seçimi ve ilgili dosyaları ekleyin.
    Not: Ilastik çıkış topluluğudur pseudo - 1 bit 3D görüntü yığınları (imge maskeleri) 0 (sıfır) elastin (veya kollajen) ve 1 (bir) varlığı bütününü ifade eden ifade eden (gerçek bit derinliği 8-bit).
  13. Her görüntü yığını için sonuçları görsel imge maskeleri ve raw resim dosyalarını karşılaştırarak doğrulayın.
  14. Ilastik maskesi (Adım 8,4-8,9) en iyi duruma getirmek ve herhangi bir görüntü yığınları ile tatmin edici sonuçlar yeniden analiz.
  15. Ilastik imge maskeleri MATLAB kullanma--dan elastin ve kolajen cilt yoğunluğunu hesaplamak
    1. MATLABaçın.
    2. MATLAB "geçerli klasör" ilastik imge maskeleri ile klasörü seçin pencere.
    3. MATLAB komut dosyası ek dosya 1 ' den MATLAB düzenleyicisine kopyalayın ve bilgisayarınızın sabit diskinde volumeCalculator.m MATLAB klasöründe kodu kaydedin.
    4. Piksel boyutları ve piksel Yükseklik komut satırlarında girin
      pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; % mikron * mikron
      pixelHeight = 0,9; % mikron
    5. Komut dosyasını kaydedin.
    6. MATLAB komut penceresine gidin ve girin "volumeCalculator (' yolu verilerini ')" script yüklemek için.
    7. Tıklayın girin. Her resim maskesini şimdi özetlenebilir ve (bilinen) piksel/Voksel birim (z ekseni kararı ile çarpılan bir pikselin fiziksel boyutları) ile çarpılır. MATLAB çıktısı hacmi elastin ve kolajen her görüntü yığını var.
  16. Sonuçları kaydedin.

Sonuçlar

Bu çalışmada kullanılan görüntüleme için özel olarak oluşturulmuş basınç myograph şekil 1' de gösterilen. Myograph tasarım için özel dikkat i) odası küçük hacimli (2 mL) ve II) olasılığı için Kapat ve cam alt (şekil 1B) ile paralel Kanüller konumlandırma için ödenmiştir. Alt odasının bir 50 × 24 mm #1.5 cam coverslip (değiştirilebilir) uyuyor. Basınç denetleyicisi standart 1 L cam şişe ve...

Tartışmalar

Bu eser bir standart, kombine görüntüleme ve basınç myography bir yaklaşım için eşzamanlı direnç arterler ve basınç ile ilgili değişiklikler arter yapısı mekanik özelliklerinin değerlendirilmesi için önemli bir yer bizim öneri temsil eder. bir baskı Aralık 0 için 100 mmHg duvardan. Sunulan yaklaşım özel yapılı ekipman kullanılarak geliştirilen, görüntüleme Arteryel duvardaki her iki aletleri tasarımı sağlar ancak, İki fotonlu uyarma floresan mikroskop üzerinde uygun herhangi bir ba...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Danimarka moleküler Biyomedikal görüntüleme Merkezi, Doğa Bilimleri Fakültesi, Güney Danimarka Üniversitesi laboratuvarları ve mikroskoplar kullanımı için teşekkür ederiz. Kristoffer Rosenstand ve Ulla Melchior basınç ile mükemmel teknik destek için myography ve görüntüleme kabul vardır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Fine Science Tools15401-12
Fine Science Tools11251-23
NikonSMZ800N
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.761028for dissection purpose
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
EthiconEthilon 11-0
Custom builtDK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.B3259
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.A7030
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.C5670
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.G7021
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.E3889
Merck Millipore, Hellerup, Denmark1.00496.9010Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution 
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.H3784
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.P9666
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.P5655
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.M2643
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.S2002
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.S5886
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.S5761
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific10010015
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.PHR1423
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.Z370525
 Tocris Bioscience, Bristol, UK538944
NikonCustom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
NikonCFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
NikonCFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, DenmarkH7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany).ChromaET 460 nm long pass dichroic
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany).Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany).Chroma ET402/15X 
Scotch TM
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip

Referanslar

  1. Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
  2. Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
  3. van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
  4. Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
  5. Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
  6. Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
  7. Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
  8. Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
  9. Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
  10. Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001 (2015).
  11. Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
  12. Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
  13. Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
  14. Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
  15. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
  16. Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
  17. Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
  18. Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
  19. Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
  21. Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
  22. Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108 (2010).
  23. Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022 (2008).
  24. Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
  25. Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
  26. Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
  27. Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. , 230-233 (2011).
  30. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
  31. Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
  32. Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
  33. Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients' Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
  34. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  37. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  38. Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
  39. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
  40. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
  41. Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
  42. Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
  43. Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
  44. Fung, Y. C. . Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , (1993).
  45. Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998 (2014).
  46. VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
  47. Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
  48. Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
  49. Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
  50. Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760 (2013).
  51. Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111 (2015).
  52. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
  53. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksay 134ki fotonlu uyarma Floresans mikroskobuh cre d Matriksg r nt analizleridiren arterlerIlastikFijiMikroyapmekanikmatematiksel modelleme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır