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요약

우리는 동시에 기계적 테스트 설명 하 고 절연, 동맥 벽의 3D 이미징 라이브 인간의 저항 동맥, 및 엘라 스 틴과 콜라겐 공간 조직 및 볼륨 밀도의 정량화에 대 한 피지 및 Ilastik 이미지 분석. 우리는 동맥 벽 역학의 수학적 모델에 이러한 데이터를 사용 하 여 논의.

초록

저항 동맥 개장의 병원 성 기여는 고혈압, 당뇨병 및 변화 증후군에서 설명 됩니다. 조사 및 건강 및 질병에 있는 인간의 저항 동맥의 기계적 성질을 이해 하기 위한 microstructurally 동기 수학적 모델의 개발을 이해를 돕기 위해 잠재력을가지고 어떻게 질병 및 치료 인간의 미세 혈관을 영향을 줍니다. 이러한 수학적 모델을 개발, microvascular 벽의 기계 및 마이크로아키텍처 속성 사이의 관계를 해독 하기 위해 필수적 이다. 이 작품에서는, 우리는 수동 기계 테스트 및 엘라 스 틴과 콜라겐 고립 된 인간의 저항 동맥의 동맥 벽에서의 마이크로 아키텍처의 동시 레이블-무료 3 차원 영상에 대 한 vivo 예 방법을 설명합니다. 관심의 어떤 종의 저항 동맥에 이미징 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 이미지 분석 측정 내부 탄력 있는 lamina 분기 각도 adventitial 콜라겐 직진도 피지 및 Ilastik 소프트웨어를 사용 하 여 결정 ii) 콜라겐과 엘라 스 틴 볼륨 밀도 사용 하 여 i) 압력 유도 된 변화에 대 한 설명 합니다. 그러나 가급적 모든 기계 및 이미징 측정 라이브, 끼얹는다 동맥에 수행 됩니다, 그리고, 다시 가압된 혈관의 후 고정 이미지와 표준 비디오 현미경 압력에에서 myography를 사용 하 여 다른 접근 방법 논의 했다. 이 대체 방법은 분석 방법에 대 한 다른 옵션이 있는 사용자를 제공 한다. 동맥 벽 역학의 수학적 모델에 기계 및 이미지 데이터의 포함을 논의 하 고 향후 개발 및 추가 프로토콜을 제안 하는.

서문

병원 성 기여 및 저항 동맥 리 모델링의 효과 고혈압, 당뇨병 및 변화 증후군1,2,3,,45에 설명 되어 있습니다. Microvascular 벽의 기계 및 마이크로아키텍처 속성 사이의 관계를 파악 하는 것은이 협회의 수학적 모델을 개발 하기 위한 필수적입니다. 이러한 모델 리 모델링 프로세스를 이해 하는 것을 향상 됩니다 고 철 모델 동맥 벽의 개장 대상 질환 관련 약리 전략을 테스트 하는 데 유용의 개발을 지원 합니다.

동맥 벽의 마이크로아키텍처 기계적 측정을 통합 하 여 동맥 벽 역학에 관한 방법과 마이크로아키텍처는 세포 외 기질 (ECM)의 대형에서 거의 독점적으로 수행 이해에 초점을 맞춘 사전 연구 쥐 또는 돼지6,7,,89,10,11에서 탄성 도관 동맥. 벽의 마이크로 구조의 화상 진 찰은 일반적으로 콜라겐, 엘라 스 틴과 제 2 고조파 발생의 autofluorescence를 활용 하는 비선형 광학 기술을 사용 하 여 수행 됩니다. Spatiotemporal 이미징을의 기질, 엘라 스 틴과 콜라겐, 얼룩이 지기를 위한 필요 없이 두 가지 주요 구성 요소 수 있습니다. 영상 전체 두께에 동맥 벽의 큰 도관 동맥 두꺼운 tunica 매체에 있는 빛의 분산 때문에 도전 이다. 그러나 어떻게 동맥 벽의 구조적 구성 요소의 마이크로아키텍처 관찰된 기계적 성질에 관련 된 결정, 3 차원 정보는 기계적 테스트 하는 동안 얻어야 합니다. 인간의 대동맥 같은 큰 동맥이 필요 합니다 biaxial 장착, 기계적 테스트 및 동맥 벽7,,910, 의 1-2 cm2 조각에 관심 영역의 이미징 12. 벽의 일부만 몇 군데 및 기계적으로 테스트할 수.

어떤 종류의 작은 동맥에 대 한 (예를 들어, 인간의 pericardial13, 폐14 및 피하15 동맥, 쥐 mesenteric 동맥16,,1718, 19 , 20, 마우스 cremaster, mesenteric, 대뇌, 대 퇴 및 경 동맥21,22,23,,2425,26, 전체 벽 두께의 27) 이미징이 가능 하며 기계적 테스트와 결합 될 수 있다. 기계적 성질 및 벽에서 구조적 조치의 동시 녹음 수 있습니다. 그러나, 직접 수학적 모델링 ECM의 3 차원 구조에서 관찰 된 변경 및 저항 동맥 벽의 변경 된 기계적 성질 사이 관계의 우리의 지식의 최선을 보고 되었습니다 따라 최근 인간의 저항 동맥13,15.

이 작품에서는, 수동 기계 테스트 및 엘라 스 틴과 콜라겐 고립 된 인간의 저항 동맥의 동맥 벽에서의 마이크로 아키텍처의 동시 3-차원 영상 비보 전 방법을 설명 합니다. 관심의 어떤 종의 저항 동맥에 이미징 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 이미지 분석 내부 탄력 있는 lamina 분기 각도 및 adventitial 콜라겐 직진도13 피지28를 사용 하 여 측정을 얻기 위해 설명 합니다. 콜라겐과 엘라 스 틴 볼륨 밀도 Ilastik 소프트웨어29 를 사용 하 여 결정 하며 마지막으로, 동맥 벽 역학의 수학적 모델에 기계 및 이미징 데이터를 포함 합니다.

설명 하는 수학적 모델링을 함께 기술 조사 설명 하 고 이해 하는 체계적인 접근 방법을 제공 하는 영상 및 이미지 분석의 목표는 저항 동맥의 ECM에 압력 유도 된 변화 관찰. 설명된 방법 20, 40, 100 mmHg에서 ECM의 구조를 비교 하 여 가압, 동안 선박에 ECM에 변화를 측정에 집중 된다. 이러한 압력은 각각의 더 준수 (20 mmHg), 뻣 뻣 한 (100 mmHg) 및 중간 (40 mmHg) 상태에서 동맥 벽의 구조를 결정 하기 위한 선정 됐다. 그러나, vasoactive 구성 요소, 히스테리시스 및 흐름에 의해 유도 된 변화를 포함 하 여 라이브 동맥의 혈관 벽에 어떤 과정 든 지 수 측정할 수, 조사 하 여 문제의 연구 가설에 따라.

라이브 동맥의 압력 (또는 다른) 유도 공부 하 고 변화는 ECM에 대 한 압력 myograph와 함께에서 2 광자 여기 형광 현미경 (TPEM)의 사용을 강조 했다. 첫째,이 동시 취득은의 높은 품질의 3 차원 레이블 없는 인수와 함께 동맥 벽 (직경 및 벽 두께)의 전체 3 차원 구조를 사용 하면 때문에 상세한 콜라겐과 엘라 스 틴의 이미지 엘라 스 틴 autofluorescence 및 콜라겐 두 번째 고조파 발생 신호 (SHG)30의 활용 하 여 설명13 마이크로아키텍처가. 둘째, TPEM 수 저-에너지 근처-적외선 여기 빛, photodamage 조직과 따라서, 혈관 벽 내에서 정확 하 게 동일한 위치에서 반복된 이미지의 최소화는 허용, 허용 반복 측정 분석의 관찰 변경합니다.

고정 동맥 압력의 공초점 이미지를 사용 하 여 다른 접근 방법의 사용 TPEM에 액세스 하지 않고 사용자가 뿐만 아니라 설명된 메서드를 사용 하는 기회 수 있도록 설명 되어 있습니다. ECM 구조와 볼륨 밀도 대 한 정보 예:31,32에 의해 설명 된 대로 직렬 구분 조직의 2 차원 분석에서 검색할 수 있습니다. 그러나,이 메서드를 사용 하 여 상태를 변경 하는 동안 뿐만 아니라 동맥의 길이 비늘 통해 3 차원 구조 정보를 검색 하는 가능성의 부족, 그것은 압력의 수사를 위해이 접근을 사용 하 여 권장 하지 고 치료는 ECM에서 3 차원 변화를 유도 한다.

여기에서 설명한 메서드를 적용할 수 사관에 대 한 최소 요구 cannulation 및 형광 현미경 confocal 또는 2 광자 여기와 함께에서 동맥의 가압에 대 한 설치 프로그램에 액세스입니다. 다음 프로토콜에서 설명 하는 설치 사용자 지정 내장된 거꾸로 2 광자 여기 형광 현미경에 내장 경도 힘 변환기와 맞춤식 압력 myograph 이다.

프로토콜

이 작품에 사용 하기 위해 인간의 정수 리 심장 막의 검의 컬렉션은 앞에서 설명한33후 서 면된 동의 수행 되었다. 인간의 조직 연구34 헬싱키의 선언 명시 된 원칙을 준수 하 고 (S-20100044 및 S-20140202) 남쪽 덴마크와 덴마크 데이터 보호 기관에 대 한 건강 연구 윤리에는 지역 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 수집 조직과 격리 (인간) 저항 동맥

  1. 수술 동안 절단 되는 즉시 관심의 조직 샘플을 수집 합니다. 4 ° c HEPES 전송 조직 생리 적 소금물 (HBS) 즉시 수집을 버퍼링 되 고 HBS에 저장.
    참고: 인간의 조직만 수집 됩니다 승인 다음 환자 서 면된 동의 서 관련 기관 및 윤리 위원회에 의해. Mm에서 HBS 구성: 144 NaCl, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH2포4 1.2, HEPES 14.9, 포도 5.5. NaOH로 pH 7.4에 조정 하 고 솔루션 비록 0.2 µ m 필터를 필터링.
  2. 마 취약을 씻어 하룻밤 4 ° C에서 살 균 HBS에서 수집 된 조직을 둡니다.
    참고: 선박 무결성 및 기능에 하룻밤 스토리지의 모든 효과 개별 연구 실험실에 의해 검사 되어야 한다.
  3. 신중 하 게 저항 크기의 동맥 (± 200 µ m 루멘 직경) 한 쌍의 날카로운 팁 집게와 마이크로 해 부가 위를 사용 하 여 격리 합니다.
  4. 이미징/압력 챔버를 못쓰게 하는 동안 얼음 HBS에 4 ° C에서 동맥을 저장 합니다.

2. 격리 된 동맥 압력 Myograph에 탑재

  1. Cannulae 보유자에 팁 직경 ~ 80 µ m의 유리 cannulae를 탑재 합니다. 팁 약 150 µ m을 챔버 유리 바닥 위에 놓습니다.
    참고: 45 ° 구부려 진 팁 cannulae 유리 바닥 위에 선박의 정확한 위치를 수 있습니다.
  2. 입구와 출구 튜브 1 %BSA HBS 압력 시스템에 연결.
    참고: BSA 내 피 세포의 기능을 유지 하기 위해 포함 됩니다.
  3. 정 당 2 개의 두 배 매듭 봉합을 사용 하 여 격리 된 동맥을 탑재 합니다.
    참고: 노트 미리 준비 고 필요할 때까지 두 배 접착 테이프에 저장 될 수 있습니다.
  4. HBS와 챔버를 입력 하 고 각 유리 정에 2 개의 두 배 매듭을 놓습니다.
    참고: 지금까지 조직적 톤을 표시 하는 동맥을 사용 하는 경우에 HBS 무료 HBS 3 µ M EGTA와 3 µ M 나트륨 nitroprusside 보충 칼슘 대체 되어야 한다.
  5. 날카로운 팁 집게의 두 쌍을 사용 하 여 한쪽에 동맥을 부드럽게 잡으십시오. 동맥의 루멘 열고 부드럽게는 정 맥에 그것을 슬라이드. 두 개의 노트를 사용 하 여 정에 수정.
  6. 부드럽게 루멘 HBS / 1%를 5 mmHg의 압력 BSA.
  7. 동맥의 다른 쪽 끝을 cannulate 하 고 2 개의 두 배 매듭을 사용 하 여 정 맥에 그것을 확보.
  8. 현미경 단계에는 myograph를 전송 하 고 5 mmHg에 동맥 압력 (입구 압력 출구 압력 =), 다음 30 분 동안 37 ° C에 열.
  9. 선택 사항: 보정 (1 g = 9.81 미네소타) 제조업체의 지침에 따라 경도 힘 변환기.
    참고: 그것은 중요 한 온도가 열 후 힘 변환기를 보정 필수적 이다.

3. 실험 수행: 이미징의 간선 직경, 벽 두께 및 콜라겐과 엘라 스 틴 마이크로아키텍처 TPEM를 사용 하 여

  1. 신속 하 게 스캔 5 mmHg에서 선박 직경 및 벽 두께 평가 하는 20 X 목표 (수 가늠 구멍 (NA) ≥ 0.8) 및 저전력 여기 빛을 사용 하 여 5 mmHg 압력 cannulated 동맥.
    참고: 거꾸로 현미경 사용 물 침수 목표; 똑바로 현미경 목표를 담그고 물 사용 하 여. 목표에 커버 슬립 두께 대 한 해결 하기 위해 수정 칼라 없는 경우 사용 하는 목적으로 사용 된 커버 슬립에 맞게 있는지 확인 합니다. 소프트웨어 설정 및 설명 사용자 interphase 현미경 및 사용 소프트웨어에 따라 달라질 수 있습니다.
    1. 광학 경로 설치.
      1. 마이 타이 2 광자 레이저를 활성화 하 고 820 nm 여기 빛을 설정 합니다.
        주의: 어떤 표시 뿐만 아니라 눈에 보이지 않는 레이저 빛에 노출을 하지 마십시오.
      2. 2 개의 채널에서 동시에 방출을 수집 합니다. 460 nm 긴 패스 dichroic 거울 및 수집 방출 가운데 520에 30-60 nm 넓은 대역 통과 필터를 사용 하 여 사용 하 여 photomultipliers 사이의 빛 방출 분할 (엘라 스 틴) 및 410 nm (콜라겐), 각각.
    2. 10 µs 레이저 면만 시간/픽셀 및 512 × 512 연속 스캔 100%의 시야에 대 한 픽셀을 사용 합니다.
    3. 수동으로 최대 직경을 관찰 하는 깊이 결정 하는 동맥을 통해 검사 합니다.
    4. 동맥의 가장 넓은 직경 취재 사각형 슬라이스를 선택 하 고 픽셀 크기 ≤ 300 nm/픽셀 (그림 2C) 단일 프레임 스캔. 낮은 빛 전원 및 라이브 동맥 photodamaging을 피하기 위해 가능한 픽셀 면만 시간으로 사용 합니다.
      참고: 것이 좋습니다 예를 들어직사각형,., 시간을 절약 하 고 조직의 광자 노출 (그림 2C) 제한에이 위치에 이차 이미지 보다는 100 × 1024 픽셀 이미지.
    5. 나중에 분석을 위해 이미지를 저장 합니다.
  2. 동맥의 최대 직경에 루멘 직경과 벽 두께 결정 합니다.
    1. 피지에서 이미지를 로드 합니다.
    2. 메인 메뉴를 클릭 하 여 눈금을 설정 | 분석 | 설정 규모 µ m/픽셀 픽셀 비율 (좋습니다 계속 픽셀 비율 1:1)을 입력 하십시오.
    3. 피지 선 도구 선택 및 동맥 루멘의 각 측면에 두 개의 내부 탄성 하기 사이 선을 인출 하 고 ctrl + M을클릭 합니다. 피지는 결과 테이블에는 기본으로 길이 보고합니다.
    4. 마찬가지로, 더 많은 선을 각 벽의 두께 측정 하 고 ctrl + M을 측정 하는 다음 태그를 클릭 합니다.
    5. 측정을 저장 합니다.
  3. 검색 전체 벽의 두께 동맥, 동맥의 길이 따라 관심의 1-3 지구에 대 한 좋은 품질을 가진 3D 이미지 스택을 취득 하 여 5 mmHg에서 이미지 콜라겐과 엘라 스 틴 마이크로아키텍처.
    1. 목표, 나 ≥ 1, 최적화 된 픽셀 크기와 z-간격 X 60을 사용 하 여 동맥의 전체 벽을 통해 이미지 스택을 가져옵니다.
      1. 광학 경로, 침수 매체에 따라 최적의 이미징 조건 (픽셀 크기와 z-단계 간격)를 계산 하 고 과학적인 볼륨 이미징 Nyquist 계산기 (https://svi.nl/NyquistCalculator)를 사용 하 여 굴절 인덱스 샘플.
        참고: 여기 섹션 3.4에에서 최적의 픽셀 크기와 z-조언 대 간격의 차이에 관심을 지불 하시기 바랍니다. 위의 최대 픽셀 크기의 사용에.
    2. 동일한 여기 및 방출 설정을 (3.1.1) 위에 사용 합니다.
    3. Z 스택의 두께 확인 하려면 위에서 설명한 대로 신속 하 게 혈관 벽을 검사 합니다.
    4. Z-스택 시작 및 끝 깊이, z 단계 간격 및 픽셀 밀도 (3.3.1.1의 계산)을 정의 하 고 z-스캔을 수행. 각 채널을 별도로 저장 합니다.
      참고: 이미지 다음 이미지 분석에서 곡률의 어떤 영향을 피하기 위해 선박 크기에 따라 충분히 작은 예를 들어 30 µ m x 30 또는 50 × 50 µ m 이어야 합니다.
  4. 동맥 직경, 벽 두께, 그리고 프로토콜의 나머지 압력에서 엘라 스 틴과 콜라겐 마이크로 아키텍처를 결정 합니다.
    1. 3.1-3.2 압력 10 및 20 mmHg에서 반복, 반복 압력 20 mmHg에서 3.3.
    2. 3.1 및 3.2 압력 40 mmHg에서 반복 합니다.
    3. 3.1-3.2 압력 60, 80, 및 100 mmHg에서 반복 하 고 반복 3.3 100 mmHg에서.
      참고: 3.1-3.3 모든 압력, 그리고 테스트를 가설에 따라 (예: 시리즈/조합의 증가 뿐만 아니라 감소 압력), 압력의 조합에 대 한 반복 수 있습니다. 오신 농도 0.3-1 µ M photobleaching의 경우 엘라 스 틴 autofluorescence 향상에 추가할 수 있습니다. Photobleaching은 저전력 구동 가능한 빛으로 적용 하 여 피할 수 있습니다.
    4. 각 압력 단계 후 신선한 37 ° C HBS 가진 myograph 챔버에 버퍼를 교체 합니다. 동맥 압력에 각 변경 다음 이미징 이전 5 분에 대 한 적응 하실 수 있습니다.
  5. 채널 스택 이미지 분석을 위한 별도로 저장 합니다.
  6. 동맥의 생존 능력을 테스트 합니다.
    1. 10 적용 안정적인 수축 관찰 µ M U46619 myograph 상공에서 10 µ M bradykinin의 추가 의해 따라.
    2. 3.1 화합물의 각각의 응용 프로그램을 다음 섹션에서 설명한 것 처럼 직경 및 벽 두께 기록 합니다.
    3. 동맥은 하지 완전히 열려진 bradykinin 및 기록 직경과 벽 두께의 추가 따라 3 µ M 나트륨 nitroprusside를 추가 합니다.
      참고: (혈관 침대 및 종) 동맥의 약리학 속성에 따라 다른 vasoconstrictor 및 (endothelium 종속) vasodilator 화합물 사용할 수 있습니다.
  7. 선택 사항: 가압된 동맥을 수정 하거나 콜라겐과 엘라 스 틴 볼륨 밀도 (단계 7)에 대 한의 이미지를 계속 합니다.
    1. 4% 포름알데히드 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 37 ° C 1 시간에서 x 1에 추가 합니다.
    2. 1 x PBS에 고정된 동맥 세 번 세척 하 고 매듭 외부 동맥의 부분만 만지기 cannulae에서 동맥을 부드럽게 밀어. 매듭 제거, 스토리지 튜브를 전송할 때 동맥을 들고 그들을 사용 하지.
    3. PBS x / 0.05 %1에 게 엘라 스 틴과 콜라겐 볼륨 밀도 또는 다른 목적에 대 한 이미지까지 4 ° C에서 나트륨 아 지 드.
      참고: 고정 된 동맥은 PBS x / 0.05 %1에서 3 개월 이상 저장 될 수 있다 나트륨 아 지 드 4 ° c.에

4. 스트레스 긴장 관계 및 내장 벽 강성 계산

  1. 수식 및 계산 계산 하는 스트레스, 긴장, 및 벽 강성 Bloksgaard, M. 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 단계를 따르십시오 13 그리고 여기 참조입니다.

5. 이미지 분석-(내부 탄력 있는 Lamina) IEL 분기 각도

  1. 피지에서 이미지 열기 스택입니다. 이동 파일 | 열기 이미지 이미지 스택을 선택 하.
    참고: 2-7 연속 z-섹션 (1-2 µ m 두께) IEL 취재의 최대 강도 예측 IEL 엘라 스 틴 섬유 분기 각도 피지28,35에서 각 도구를 사용 하 여 결정 하는 데 사용 됩니다. 그림 그림 4A 를 참조 하십시오.
  2. 이동 이미지 | 스택 | z 프로젝트... "최대 강도 투영" 이미지를 선택 하.
  3. 최대 강도 프로젝션 TIFF로 저장 합니다.
  4. "각도 도구"를 사용 하 여 가능한 많은 IEL 섬유 분기 포인트를 선택 하 고 이미지를 통해 체계적으로 작동. Ctrl + M 각 각도 측정을 클릭 합니다.
  5. 피지 결과 시트를 저장 합니다.

6. 이미지 분석-Adventitial 콜라겐 파형

  1. 피지에서 이미지 열기 스택입니다. 이동 파일 | 열기 이미지를 이미지 스택을 선택.
    참고: 최대 강도 계획 2-7 연속 z-섹션의 콜라겐 파형 Rezakhaniha, R에 의해 설명 된 대로36 피지 NeuronJ 플러그인 사용 하 여 결정 하는 데 사용 됩니다 취재 콜라겐 바로 외부 탄력 있는 lamina (장 어, 1-4 µ m 두께) 밖 . 외. 37 (그림 4B)입니다.
  2. 규모를 설정 합니다. 이동 분석 | 규모 설정 픽셀 크기를 입력 하.
  3. 이동 이미지 | 스택 | z 프로젝트... 와 함께 작동 하도록 이미지와 "최대 강도 투영"를 선택 하.
  4. 클릭 하 여 8 bitt TIFF 이미지 형식을 변경 이미지 | 종류 | 8 bitt 최대 강도 프로젝션 TIFF로 저장 하 고.
  5. 콜라겐 섬유 직진도 피지 뉴런 J 플러그인을 사용 하 여 측정 합니다.
    1. 피지를 클릭 하 여 NeuronJ 플러그인을 엽니다 | 플러그인 | 뉴런 J.
    2. 부하 이미지를 클릭 하 여 NeuronJ에서 8 비트 TIFF를 엽니다 | 선택 파일.
    3. 경시를 추가클릭 하 고 시작 및 각 섬유의 끝을 클릭 하 여 분석 하는 섬유를 선택 합니다.
    4. 대화 상자에서 추적 표시 (Lf) 및 정점 측정 을 선택, 측정 경시를 클릭 합니다.
  6. L0/Lf 계산에서 excel (또는 비슷한) 결과 저장 하 고.
    1. 복사 및 붙여넣기 excel 피지 뉴런 J 경시 및 정점 출력 (또는 유사한) L0 계산 및 꼭지점 측정에서 피타고라스의 정리를 사용 하 여. 줄에 첫 번째 및 마지막 포인트 2D 좌표계에서 사변의 끝의 위치를 나타냅니다.
      참고:는 L0/Lf [직선 (L0) 통해 콜라겐 섬유 번들 엔드-투-엔드 길이 / 전체 길이 (Lf)] 1 가까이 거의 직선 콜라겐 섬유를 나타냅니다.

7. 콜라겐과 엘라 스 틴 볼륨 밀도 대 한 이미징

  1. (고정된) 동맥 1 세척 PBS에 x와 어둠 속에서 1 x PBS에서 1 µ M 오신에 15 분 동안 그것을 얼룩. 고정된 동맥에 대 한 실 온에서이 단계를 수행 합니다.
    참고: 오신 엘라 스 틴 형광을 향상 시킵니다. 오신 경우 샘플은 얼룩 솔루션에 오랜된 시간에 대 한 콜라겐과 세포 세포질 같은 다른 구조를 얼룩 것입니다. 다른 구조의 얼룩이 너무 강렬 하지 않으면, 오신 0.3 μ m의 농도 낮추거나 세척을 반복.
  2. 씻어 동맥 3 x 1 x PBS에서
    1. 고정 동맥: 이미징 동맥을 탑재.
      주의: 비 가압 혈관의 영상 기하학 양적 정보 검색을 허용 하지 않습니다. 절대 양이 필요한 때, 이들은 항상 라이브, 가압 동맥에 얻은 합니다. 볼륨 비율 비 가압 동맥에이 방법으로 얻을 수 있습니다.
      1. 장소 두 조각의 두 배 접착제 테이프 1-1.5 c m 간격 개체 유리에. 두 배 접착 테이프 약 100 µ m 두께입니다. 테이프를 장착할 동맥의 직경에 맞게 하나 이상의 레이어를 적용 합니다.
      2. 광장 한가운데에 유리에 PBS의 10-20 µ L를 놓고 PBS 드롭에서 동맥을 배치 합니다.
        참고: 드롭 작은 고을 피하기 위해 커버 슬립을 장착 위치에서 동맥을 추진 가능한 평면 이어야 한다.
      3. coverslip 놓고 이중 접착 테이프에 누릅니다.
      4. 1 x PBS에 coverslip 개체 유리 사이 저수지를 채우십시오. 그것은 샘플의 건조를 피하기 위해 매 시간 마다 리필.
  3. 콜라겐과 엘라 스 틴에 대 한 이미지-스택 볼륨 밀도 나 20 X 목표를 사용 하 여 얻을 여전히 좋은 광학 해상도 (2D 그림, 2 세대 그리고 2 H) 하면서 가능한 동맥 벽의 많은 커버 > 1.
    참고:는 coverslip 아래 고정된 동맥의 이미징에 대 한 물 침수 목표를 사용 하 고 중요 한 동맥의 이미징에 대 한 목표를 담그고 물을 사용. 목표에 커버 슬립 두께 대 한 해결 하기 위해 수정 칼라 없는 경우 일치 하는 목표에 coverslip 있는지 확인 합니다. 가급적 최적의 픽셀 크기와 z-간격을 사용 합니다. 나이 키스 트 계산기 (단계 3.3.1.1.)를 사용 하 여이 계산 합니다. 또는, 300 nm의 최소 픽셀 크기와 z-1 µ m의 간격을 사용 합니다. 그것은 사용자를 내부 분석 결과 변화를 결정할 수 있도록 동맥의 길이 따라 3 개의 이미지를 구하는 것이 좋습니다.
  4. 820 nm 여기 빛 및 수집 방출 사용 하 여 30-60 nm 넓은 대역 통과 필터를 사용 하 여 이미지 엘라 가운데 520에 nm.
  5. 엘라 스 틴과 다른 autofluorescent 단백질의 어떤 자극을 방지 하 고 방출 사용 하 여 10-30 nm 넓은 대역 통과 필터 가운데 495에 수집을 990 nm 여기 빛을 사용 하 여 이미지 콜라겐 nm.
  6. 별도로 TIFF 파일로 이미지 스택을 각 채널에서 저장

8. 이미지 분석 엘라 스 틴과 콜라겐 볼륨 밀도 Ilastik를 사용 하 여 추출에 대 한

  1. TIFF 이미지 스택을 HDF5 선택 파일을 클릭 하 여 피지28,35 를 사용 하 여 변환 | 다른 이름으로 저장... HDF5.
  2. 컴퓨터 하드 드라이브, 한 엘라 스 틴, 콜라겐 이미지 스택 하나에 각각 두 개의 데이터 파일 폴더를 만듭니다. 관련 이미지 스택을 관련 폴더에 복사 합니다.
  3. 엘라 스 틴, 콜라겐, 한 중 Ilastik 소프트웨어에 각각 두 개의 새로운 Ilastik 프로젝트를 만듭니다.
    1. Ilastik를 열고 | 새 프로젝트 만들기 | 픽셀 분류 | 새 프로젝트 | 데이터 추가 및 선택 이미지 폴더 단계 8.2에서에서 만든.
      주: Ilastik 마법사를 따릅니다.
  4. 소프트웨어를 훈련 한 3D 이미지 스택을 가져옵니다.
    1. 입력 데이터 애플릿 선택 | 주요 작업 영역 | 원시 데이터 탭 | 추가 새로운... | 별도 이미지를 추가 원하는 이미지 데이터를 선택 하 고
  5. 소프트웨어에 관련 된 기능을 선택 합니다.
    1. 오픈 기능 선택 애플릿 | 기능 선택 는 새로운 대화 상자를 엽니다. 자세한 내용은 그림 5A 를 참조 하십시오.
  6. 훈련 애플릿 아래 레이블 추가 단추를 사용 하 여 두 개 이상의 레이블을 추가 합니다.
    참고: 각 레이블을 구분 하는 개체 형식에 대응 됩니다. 이 작품에서 세 레이블을 엘라 스 틴 사용 됩니다: 엘라 스 틴 자체, (제외)에 밝은 반점, 및 배경 (제외).
  7. 페인트 브러시 스타일 주석 도구를 사용 하 여 raw 이미지 스택 위에 라벨을 그립니다.
    1. 적절 한 레이블을 선택: 브러시 도구와 그리기 시작을 클릭 합니다.
  8. 이미지 스택 분석 하 고 라이브 업데이트 사용을 클릭 하 여 비슷한 기능을 찾고 하는 Ilastik 라는 표시.
  9. 확인 신중 하 게 예측 지도 (그림 5D).
    참고: 프로세스 raw 이미지에서 완전 한 예측 지도를 그림 5에 표시 됩니다. Ilastik 사용 하 여 이미지를 세그먼트에 예측 지도 레이블 픽셀은 더 될 것에 따라 스택 (그림 5D) 관련.
  10. 임계값을 적용 합니다.
    1. 임계 처리 애플릿선택, 적절 한 방법, 입력된 레이블, 부드러운, 임계값 및 필터 매개 변수를 크기 선택한 마지막으로 적용을 클릭 합니다.
      참고:이 개별 개체에 이미지의 유사 하 게 레이블이 지정 된 부분을 분리. 엘라 스 틴과 콜라겐 같은 고도로 연결 된 조직 분리 될 필요는 없습니다, 따라서, 0.4의 임계값이 적용 됩니다 (기본값은 0.5). 그림 5E 및 5F 임계값을 적용 한 결과를 보여 줍니다.
  11. 결과 만족 될 때까지 Ilastik의 훈련을 반복 (엘라 스 틴, 콜라겐 각각은 각각 분석에 대 한 인식).
    1. 자주 전환 훈련 및 세분화 (및 또한 때때로 임계 처리) 애플릿을이 과정. 다시 Ilastik를 교육의 효과의 예는 그림 6에 표시 됩니다.
  12. 비슷한 이미지 데이터를 분석 하는 일괄 처리: 일괄 처리 예측 입력된 선택 선택 하 고 관련 파일을 추가.
    참고:는 Ilastik 출력 엘라 스 틴 (콜라겐)의 부재와 조의 존재를 나타내는 1 (하나) (0) 나타내는 0 의사-1 비트 3D 이미지 스택 (이미지 마스크)의 모음입니다 (실제 비트 깊이 8-비트).
  13. 이미지 마스크와 raw 이미지 파일을 시각적으로 비교 하 여 각 이미지 스택에 대 한 결과 확인 합니다.
  14. Ilastik 마스크 (단계 8.4-8.9)을 최적화 하 고 다시 모든 이미지 스택을 불만족 결과 분석.
  15. Ilastik 이미지 마스크를 사용 하 여 MATLAB에서 엘라 스 틴과 콜라겐 볼륨 밀도 계산
    1. MATLAB을 엽니다.
    2. Ilastik 이미지 마스크 MATLAB "현재 폴더" 폴더 선택 창.
    3. MATLAB 편집기로 보충 파일 1 에서 MATLAB 스크립트를 복사 하 고 컴퓨터 하드 드라이브에 MATLAB 폴더에 volumeCalculator.m로 코드를 저장 합니다.
    4. 픽셀 크기와 픽셀 높이 스크립트 라인에 입력 한다
      pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; % 미크론 * 미크론
      pixelHeight = 0.9; % 미크론
    5. 스크립트를 저장 합니다.
    6. MATLAB 명령 창으로 이동 하 고 입력 "volumeCalculator (' 경로 데이터 ')" 스크립트를 로드.
    7. 클릭 입력 합니다. 각 이미지 마스크 이제 정리 하 고 (알려진된) 픽셀/복 볼륨 (z 축 해상도 곱한 픽셀의 물리적 크기)를 곱한. MATLAB에서 출력은 엘라 스 틴과 콜라겐 각 이미지 스택의 총 볼륨입니다.
  16. 결과 저장 합니다.

결과

이 작품에 사용 된 이미지에 대 한 맞춤식 압력 myograph는 그림 1에 표시 됩니다. 작은 볼륨 (2 mL)와 ii) 가까이, 그리고 유리 바닥 (그림 1B) 병렬 cannulae 포지셔닝을 위한 가능성 i)는 챔버는 myograph의 디자인에 대 한 특별 한 주의 지불 했다. 챔버의 바닥에는 50 × 24 mm #1.5 유리 coverslip (교체) 맞는. 압력 컨트롤러는 표준 1 L 유리 병 및...

토론

이 작품이 나타냅니다 접근을 위한 표준화 된, 결합 된 이미징 및 압력 myography, 저항 동맥과 압력 관련 된 변화는 동맥의 구조에서의 기계적 특성의 동시 평가 대 한 귀중 한 우리의 제안을 0에서 100 mmHg의 압력 범위 벽. 그러나 제시 방법은 사용자 지정 건설된 장비를 사용 하 여 개발 되었다,, 어떤 압력 myograph 2 광자 여기 형광 현미경에 맞는 경우 사용할 수 있습니다, 두 장비의 디자인 수 동맥 벽?...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자는 실험실과 현미경의 사용에 대 한 덴마크어 분자 생체 이미징 센터에서 학부의 자연과학 대학 남부의 덴마크를 감사합니다. Myography 및 이미징 Kristoffer Rosenstand 및 Ulla Melchior에 압력을 가진 우수한 기술 지원을 인정 됩니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Fine Science Tools15401-12
Fine Science Tools11251-23
NikonSMZ800N
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.761028for dissection purpose
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
EthiconEthilon 11-0
Custom builtDK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.B3259
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.A7030
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.C5670
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.G7021
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.E3889
Merck Millipore, Hellerup, Denmark1.00496.9010Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution 
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.H3784
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.P9666
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.P5655
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.M2643
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.S2002
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.S5886
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.S5761
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific10010015
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.PHR1423
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.Z370525
 Tocris Bioscience, Bristol, UK538944
NikonCustom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
NikonCFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
NikonCFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, DenmarkH7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany).ChromaET 460 nm long pass dichroic
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany).Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany).Chroma ET402/15X 
Scotch TM
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip

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