ExCYT: yüksek boyutlu sitometresi veri analizi düzene için bir grafik kullanıcı arabirimi

Özet

ExCYT bir MATLAB tabanlı grafiksel kullanıcı arayüzü (kullanıcıların kendi akış sitometresi veri yolu ile yaygın olarak analiz olanak sağlayan GUI) dimensionality azaltma yolu ile t-SNE, otomatik ve el ile çeşitli dahil olmak üzere yüksek boyutlu verileri için analitik teknikler istihdam olduğunu kümeleme yöntemleri, heatmaps ve Roman yüksek boyutlu Akış grafiğini çizer.

Özet

Akış cytometers parametreleri giderek artan sayıda ölçme yeteneğine sahip çıkmasıyla, bilim adamları phenotypically onların hücresel örnekleri özelliklerini keşfetmek için daha büyük paneller geliştirmeye devam. Ancak, bu teknolojik gelişmeler objektif manuel tabanlı geleneksel gating programları içinde analiz için giderek daha zor hale gelmiştir yüksek boyutlu veri kümeleri verim. Daha iyi analiz ve veri sunmak için akış sitometresi verilerini ayrıştırmak için yüksek boyutlu veri çözümleme uzmanlık ile bioinformaticians ile bilim adamları ortak. Bu yöntemler akış sitometresi okumak çok değerli olduğu gösterilmiştir iken, onlar henüz basit ve kullanımı kolay bir pakette Hesaplamalı veya programlama uzmanlık eksikliği bilim adamları için dahil olmak gerek. Bu gereksinimi karşılamak için biz ExCYT, bir MATLAB tabanlı grafik kullanıcı arabirimi (yüksek boyutlu akış sitometresi verilerin analizi yüksek boyutlu veri de dahil olmak üzere yaygın olarak istihdam analitik tekniklerini uygulayarak akıcılık GUI) geliştirdik t-SNE tarafından dimensionality azaltma, otomatik ve el ile kümeleme yöntem, heatmaps ve Roman yüksek boyutlu akış çeşitli çizer. Ayrıca, ExCYT daha fazla t-SNE ve Kümeleme Analizi yanı sıra yetenek gates doğrudan t-SNE araziler üzerinde uygulamak için ilgi seçin örneğin alınma olasılığını geleneksel gating seçenekleri sağlar. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı da telafi işe ek avantajı veya uncompensated FCS dosyaları sağlar. Olay bu sonrası edinme tazminat gereklidir, Kullanıcı bir dizin tek lekeleri ve günahı bir örnek program sağlamak seçebilirsiniz. Program tüm kanalları olumlu olayları algılar ve bu verileri seçme daha objektif olarak tazminat matris hesaplamak için kullanır. Özetle, ExCYT akış sitometresi veri FCS dosyaları şeklinde almak ve herhangi bir bireysel hesaplama verilerini anlamada en son algoritmik yaklaşımlar kullanmak için eğitim, ne olursa olsun, izin vermek için kapsamlı bir analiz boru hattı sağlar.

Giriş

Akış Sitometresi yanı sıra kitle sitometresi gelişiyle gelişmeler klinisyenler ve bilim adamları hızla belirlemek ve phenotypically biyolojik ve klinik olarak ilginç örnekleri çözünürlük büyük oluşturma, yeni seviyeleri ile karakterize izin verdi bilgi zengin^1,2,3olan yüksek boyutlu veri kümeleri. Ise manuel geçişi gibi akış sitometresi veri analizi için geleneksel yöntemler orada birkaç işaretleri ve görsel olarak discernable nüfus bu işaretleri var deneyler için daha basit olabilirdi, bu yaklaşım oluşturmak başarısız olabilir yüksek boyutlu veri kümeleri ya da bir spektrum üzerinde boyama işaretçileri olan analiz ederken tekrarlanabilir sonuçlar. Örneğin, bir çok kurumsal çalışmada, intra hücresel nerede (ICS) boyama deneyleri antijen spesifik T hücre yanıt-e doğru iyi inter-laboratory hassas, analiz, rağmen özellikle quantitating tekrarlanabilirlik değerlendirmek için gerçekleştirilen perdeleme, değişkenlik⁴önemli bir kaynak tanıttı. Ayrıca, el ile popülasyon çıkarlarının, son derece öznel olmasının yanı sıra perdeleme süreci son derece zaman alıcı ve emek yoğun olduğunu. Ancak, sağlam, verimli ve zamanında bir şekilde yüksek boyutlu veri kümeleri çözümleme sorunu araştırma Bilimleri yeni biri değil. Gen ifade çalışmalar genellikle son derece yüksek boyutlu veri kümeleri nerede analiz manuel formları sadece olanaksız olurdu (genellikle sırasına genler yüzlerce) oluşturur. Bu veri kümeleri çözümleme mücadele için bioinformatic araçları gen ifadesi verileri⁵ayrıştırmak için gelişmekte olan fazla çalışma olmuştur. Parametre sayısı artmıştır ve bu yüksek boyutlu veri kümeleri^6,7analizinde çok değerli olduğu kanıtlanmıştır algoritmik bu yaklaşımlar sadece son zamanlarda sitometresi veri analizi benimsenmiştir.

Üretimi ve çeşitli algoritmalar ve bilim adamları bu yüksek boyutlu bioinformatic yaklaşımlar onların akış sitometresi verilere uygulamak izin yazılım paketleri uygulanmasına rağmen bu analitik teknikler hala büyük ölçüde kullanılmayan kalır. Bu yaklaşımların sitometresi veri⁸yaygınlaşmasının sınırlı olan faktörler çeşitli olsa, biz şüpheli büyük engel bu yaklaşımlar bilim adamları tarafından kullanımı, Hesaplamalı bilgi eksikliğidir. Aslında, çok sayıda bu yazılım paketi (Yani, flowCore, flowMeans ve OpenCyto) programlama hala önemli programlama bilgisi gerektiren dillerinde R gibi uygulanmak üzere yazılmıştır. FlowJo gibi yazılım paketlerini iyilik kolaylığı kullanım ve 'Tak ve Çalıştır' doğa gibi PC işletim sistemi ile uyumluluk nedeniyle bilim adamları arasında bulduk. Biz ExCYT, en son teknikleri çok çeker PC/Mac'te kolayca kurulabilir bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) geliştirilen çeşitli bilim adamı yabancı programlama için analitik teknikler kabul edilen ve değerli sağlamak, dimensionality azaltma sezgisel görselleştirme, kümeleme Yöntemler çıktı bu keşfetmek için yeni özellikler ile birlikte literatürde atıf için kümeleme algoritmaları ile heatmaps ve Roman yüksek boyutlu akış/kutu araziler de dahil olmak üzere.

ExCYT MATLAB'de yerleşik bir grafik kullanıcı arabirimidir ve bu nedenle de MATLAB içinde doğrudan çalıştırılabilir veya herhangi bir PC/Mac yazılım yüklemek için kullanılabilir bir yükleyici sağlanır Https://github.com/sidhomj/ExCYT kullanılabilir bir yazılımdır. Biz nasıl veri almak, ön işlemden, kuralları t-SNE dimensionality azaltma, küme veri, sıralama ve Kullanıcı tercihlerini ve faiz kümeleri üzerinden heatmaps ve roman hakkında bilgi görüntüler dayalı kümeleri filtre için detaylı bir iletişim kuralı mevcut yüksek boyutlu akış/kutu araziler ()Şekil 1). Eksenleri t-SNE parsellerde keyfi ve rasgele birimlerinde ve bu nedenle her zaman kullanıcı kolaylığı için rakamlar gösterildiği gibi arabirim. Boyama "t-SNE Heatmaps" veri noktalarının belirtilen işaretleyici sinyal dayalı sarı maviden etmektir. Çözümler kümeleme, veri noktası rengini rasgele küme sayısına dayanır. İş akışının tüm parçalar tek panelinde GUI ()Şekil 2 yürütülen olabilir & Tablo 1). Son olarak, biz ExCYT kullanımı daha önce yayımlanmış veri renal hücreli karsinom da benzer yöntemlerle analiz literatürde bağışıklık manzara keşfetmek Tarih gösterecektir. Bir hesap kayıt üzerine https://premium.cytobank.org/cytobank/projects/875, rakamlar bu el yazması ile birlikte aşağıdaki iletişim kuralı oluşturmak için kullanılan örnek veri kümesi bulunabilir.

Protokol

1. toplama ve sitometresi veri hazırlama

1. Tüm tek lekeleri bir klasörde kendilerini ve etiket tarafından kanal adıyla (fluorophore tarafından imini içermeden) yerleştirin.

2. veri ithalat & ön işleme

1. Duraklatmak veya bu analiz boru hattı kaydetmek için çalışma alanı olarak kaydetme için programın sol alt Çalışma alanını Kaydet'i düğmesini kullanın bir '. MAT' Yük çalışma alanı düğmesi ile daha sonra yüklenebilir dosya. Program birden fazla örneğini bir anda çalıştırmayın. Bu nedenle, yeni bir çalışma alanı yüklerken, ExCYT çalışan diğer hiçbir örnek kontrol etmek emin olun.
2. Analiz boru hattı başlamak için ilk sitometresi (akış sitometresi veya kitle sitometresi – CYTOF), Dosya seçimi parametrelerini seçin numarası (Bu örnek kullanımı için 2.000) dosyasından örnek olayların altında türünü seçin. Veri başarıyla alındıktan sonra bir iletişim kutusu kullanıcıya verileri başarıyla alındığını bildiren yukarı açılır.
3. Bagwell & Adams⁹tarafından yapılan bir isteğe bağlı otomatik-tazminat adım yapmak için Auto-tazminat düğmesine basın. Tek leke içeren dizini seçin. Kullanıcı arabirimi diyalog içinde günahı örnek seçin.
   1. Bir ileri/yan-dağılım kapı herhangi tazminat matris hesaplamak için olayları seçmek için kullanılan bu dizindeki örneklerinin yerleştirin. Bu günahı örneği bu amaç için kullanmak için tavsiye edilir. Bu noktada, bir algoritma her tazminat matris hesaplamak için tek lekeler içinde olumlu olayları tanımlamak için günahı örnek 99^inci yüzdelik tutarlı eşikleri ayarlamak için uygulamaya konmuştur. Bu bittiği zaman, bir diyalog kutusu tazminat gerçekleştirilen kullanıcı bilgi verecektir.
4. Daha sonra Kapı nüfus basın ve Kongre akışında Sitometresi Analizi olarak faiz, hücrelerin nüfus seçin. Nüfus hücre seçildiğinde, olayları aşağı akım Analizi (10.000 bu olaylarda) yüzdesini girin.
5. Sonra liste kutusunda önceden işleme kutusunun sağ analizde kullanılacak numara kanalları seçin (örnekte gösterilen belirli kanalları kullanın).

3. t-SNE Analizi

1. Programın başlangıç başlamak için t-SNE düğmesine basın t-SNE butonunun altında penceredeki görselleştirme için azaltılmış dimensionality veri kümesi hesaplamak için. T-SNE görüntü kaydetmek için TSNE görüntü kaydetmekbasın. 8 ile bir makinede @ 3.4 GHz ve 8 Bu adım yaklaşık 2 dakika 10,000 olayları, 50.000 olaylar için 10 dakika ve 100.000 olaylar için 20 dakika boyunca almalı GM RAM CPU.
2. 'T-SNE heatmap oluşturmak için ', birkaç CYTOF yayınları^10,11' de seçim İşaretçisi özgü t-SNE açılır menüsünden bir seçeneği görüldüğü gibi (CD64 veya CD3 belirli işaretleri örnekte gösterildiği gibi kullanın). Bir şekil şekil oluşturmak için kaydedilebilir t-SNE arsa bir heatmap temsil göstermek yukarıya açılır.
3. T-SNE parsellerde daha da aşağı akım analizleri Kapısı t-SNE düğmesini kullanarak Kullanıcı tarafından ilgi alanları seçin.

4. küme analizi

1. Kümeleme Analizi başlamak için Kümeleme yöntemi listbox (örnekte bize DBSCAN mesafe faktörü 5 diyalog kutusu listbox sağında) bir seçenek seçin. Küme düğmesine basın.
2. 'Otomatik kümeleme parametreler' panelinde bulunan otomatik kümeleme algoritmaları için aşağıdaki seçeneklerden birini kullanın:
   1. Zor KMEANS (üzerinde t-SNE): azaltılmış 2 boyutlu t-SNE verileri için kümeleme k ortalamalar uygulamak ve algoritma¹²' ye sağlanacak küme sayısı gerektirir.
   2. (Üzerinde HD veri) zor KMEANS: k ortalamalar kümeleme için t-SNE algoritması verildi özgün yüksek boyutlu verilere uygulamak. Bir kez daha, küme sayısı algoritması için sağlanması gerekiyor.
   3. DBSCAN: Azaltılmış 2 boyutlu t-SNE veri kümeleri ve genel boyutunu belirler bir boyutlu mesafe faktörü gerektiren gürültü¹³ ile kayma kümeleme yoğunluğu tabanlı uygulamalar denilen kümeleme, kümeleme yöntemi uygulamak kümeleri. Çoğu kez azaltılmış t-SNE temsilciliği mevcut küme yuvarsı olmayan küme mümkün olduğu gibi kümeleme algoritması bu tür küme t-SNE azaltılması için son derece uygundur. 2-boyutlu veriler üzerinde faaliyet nedeniyle gerçeğini, Ayrıca, daha hızlı kümeleme algoritmaları biridir.
   4. Hiyerarşik kümeleme: Geleneksel hiyerarşik kümeleme yöntem burada tüm Öklid uzaklığı matris algoritma küme boyutunu ayarlar bir mesafe faktörü sağlayarak önce tüm olayları arasında hesaplanır yüksek boyutlu verilere uygulamak.
   5. Ağ grafik- Temel:^11,14algılamak için kullanıcının istediği nadir altgrupları olduğunda akış sitometresi verileri analiz içine en son zamanlarda kullanılmaya başlanan bir kümeleme yöntem uygulanır. Bu yöntem ilk veri tüm olaylar arasındaki bağlantıları belirler bir grafik oluşturmaya dayanır. Bu adım k-en yakın komşular sayısıdır grafik oluşturmak için bir başlangıç parametresi sağlama oluşur. Bu parametre genellikle küme boyutu belirler. Bu noktada, bir grafiğe uygulanan algoritma kümeleme 5 istihdam kullanıcıya isteyen başka bir diyalog kutusu açılır. Bu grafik, Danon yöntemi ve bir spektral kümeleme algoritması^{14,15,16,17,18}modüler en üst düzeye çıkarmak için 3 seçenek içerir. Genellikle daha hızlı küme çözümü isteyen, spektral kümeleme veya hızlı açgözlü modülerlik maksimizasyonu öneririz. Danon yöntemi yanı sıra modülerlik maksimizasyonu yöntemleri kümeleri en iyi sayısını belirlemek, spektral kümeleme programa verilecek küme sayısı gerektirir.
   6. Kendi kendine organize harita: Yüksek boyutlu veri küme için bir yapay sinir ağı kullanır.
   7. GMM-Beklenti Maximization: yüksek boyutlu veri küme için Beklenti Maximization (EM) tekniği kullanarak bir Gauss karışım modeli oluşturun. ¹⁹ kümeleme yöntem bu tür aynı zamanda küme sayısını girmek kullanıcı gerektirir.
   8. Variational Bayesian kesmesi için GMM: Gauss karışım Model oluşturmak, ancak program verilecek küme sayısı gerektiren süre EM farklı olarak, bu otomatik olarak karışımı bileşenleri k.²⁰ sayısını belirleyebilirsiniz (daha büyük beklenen küme sayısı), algoritma kendi başına en iyi numarasını belirler.
3. T-SNE Arsa belirli bir alanda çalışmaya, Kullanıcı tanımlı kümeleri bir dizi çizmek için Küme el ile Seç düğmesine basın. Not, kümeleri Üyeler (her olay sadece 1 kümeye ait olabilirYani, ) paylaşamazsınız.

5. küme filtrasyon

1. Kümelerini kümelerinin ya el ile tanımlanan veya üzerinden aşağıdaki şekilde filtreleyin yukarıda açıklanan otomatik yöntemlerinden birini yoluyla olabilir.
   1. Kümeleri ( Küme filtre panelinde) herhangi bir denemede ölçülen işaretleri göre sıralamak için sıralama açılır menüsünden bir seçenek belirleyin. Sipariş artan veya azalan düzende olup olmadığını belirlemek için sıralama açılır menüsünün sağındaki Artan/azalan düğmesine basın. Bu kümeleri listesini 'Kümeleri (filtreleme)' liste kutusu güncelleştirmek ve bu marker medyan küme ifadesinin azalan düzende yeniden düzenleyin. 'Kümeleri (filtreleme)' liste kutusunda belirtilen yüzdesi bu küme temsil eden nüfusun yüzde gösterir.
   2. Belirli bir kanal boyunca belirli bir küme için minimum eşik değerini ayarlamak için eşik açılır menüsünden bir seçenek belirleyin (Bu örnekte bize işaret CD65 ve küme bir eşik, 0,75). Grafik aşağıdaki sayısal kutuya bir değer yazın veya bir eşik ayarlamak için kaydırma çubuğunu kullanın. Eşiği ayarlandıktan sonra eşik yönünü belirtmek için Eşik Ekle yukarıda ya da Aşağıda eşik Ekle tuşuna basın. Bu eşik ayarladığınızda, Kullanıcı hangi eşikleri Şu anda uygulanmakta olan farkında bu yüzden nerede marker, eşik değerini ve yön listelenir eşikleri yanındaki metin kutusuna 'Küme filtre' panelinde listelenir. Son olarak, t-SNE Arsa filtrasyon gereksinimlerini karşılamayan kümeleri bulanıklık tarafından güncellenir ve 'Kümeleri (filtreleme)' listbox filtrasyon gereksinimlerini karşılamak kümelerini göstermek için güncellenir.
   3. Frekans bir küme için minimum bir eşik ayarlamak için sayısal bir kesme Küme sıklığı eşik (%) girin (Bu örnek kullanım %1) olarak küme filtre panelinde kutu.

6. küme analizi ve görselleştirme

1. Kümeleri daha fazla analiz ve görselleştirme için seçmek için kümeler kümeler (filtreleme) liste kutusunda seçin ve bunları Küme analiz liste kutusuna taşımak için seçin à düğmesine basın.
2. Heatmaps kümeleri oluşturmak için Küme analiz listbox ilgi kümelerini seçin ve Kümeleri HeatMap düğmesine basın. Bu düğmeye basıldığında bir rakam bir ısı haritası ile birlikte dendrograms küme ve parametre eksen içeren açılır. Dendrogram dikey eksende kümeleri tarafından bu süre yatay olarak dendrogram yakından ilişkili Grup eksen Co ilişkili işaretçileri grubu. Heatmap kaydetmek için dosyasını basın | Kurulum ihracat | İhracat.
3. Bir 'Boyutlu yüksek kutu arsa' veya 'Yüksek boyutlu akış çizim' oluşturmak için Küme analiz listbox ilgi kümelerini seçin ve Yüksek boyutlu kutusu çiz düğmesini veya Yüksek boyutlu akış Arsa düğmesine basın. Bu araziler görsel olarak dağılımı değerlendirmek için kullanılan çeşitli kümeleri kanal tüm boyutları verilen.
4. Kümeleri geleneksel 2D akışı araziler içinde göstermek için dönüştürme (doğrusal, log10, arcsinh) seçin ve kanal Akışı geleneksel çizim masası ve basın akışı geleneksel arsa.

Sonuçlar

ExCYT kullanılabilirliğini sınamak için analiz ettik adlı bir veri kümesinin Chevrier ve ark. 'Bir bağışıklık Atlas, açık hücre böbrek nerede grubu CyTOF analiz 73 alınan tümör örnekler üzerinde kapsamlı bir bağışıklık paneliyle yürütülen Karsinomu' başlıklı tarafından yayınlandı hastalar¹¹. İki ayrı panel, myeloid ve lenfoid bir panel, phenotypically tümör microenvironment karakterize etmek için kullanılmıştır. ...

Tartışmalar

Burada en son yüksek boyutlu veri uygulamak için programlama arka plan ile bireylerin izin ExCYT, MATLAB tabanlı algoritmalar yüksek boyutlu sitometresi, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için çalışan bir roman grafik kullanıcı arabirimi mevcut analiz algoritmaları. Bu yazılım daha geniş bilimsel topluluk için kullanılabilirliğini akış sitometresi verilerine bir sezgisel ve kolay iş akışı içinde keşfetmek bilim adamları sağlayacaktır. T-SNE dimensionality azaltma iletken bir kümeleme yönt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Desktop	SuperMicro	Custom Build	Computer used to run analysis
MATLAB	Mathworks	N/A	Software used to develop ExCYT