ExCYT: 높은 차원 Cytometry 데이터의 분석을 합리화 하기 위한 그래픽 사용자 인터페이스

요약

ExCYT는 MATLAB 기반의 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 사용자가 일반적으로 통해 교류 cytometry 데이터 분석을 수 고용 t-SNE, 자동 및 수동의 다양 한 통해 차원 감소를 포함 하 여 높은 차원 데이터에 대 한 분석 기법 이다 클러스터링 메서드, heatmaps, 및 소설 높은 차원 흐름을 플롯 합니다.

초록

교류 cytometers 매개 변수의 증가 수를 측정의 도래와 함께 과학자 phenotypically 그들의 세포 샘플의 특성을 탐구 하는 더 큰 패널을 개발 하기 위해 계속 합니다. 그러나, 이러한 기술 발전 전통적인 수동 기반 제어 프로그램 내에서 객관적으로 분석 하는 점점 더 어렵게 되 고 차원 데이터 집합 생성. 더 분석 하 고 데이터 표시, 과학자와 그들의 흐름 cytometry 데이터를 구문 분석 하 고 차원 데이터 분석에 전문성을 갖춘 bioinformaticians 파트너. 동안 이러한 방법을 cytometry 공부에 매우 도움이 될 표시 되었습니다, 그들은 아직 과학자 들 계산 또는 프로그래밍 전문성 부족에 대 한 간단 하 고 사용 하기 쉬운 패키지에 통합 될 수 있다. 우리 ExCYT는 MATLAB 기반 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 높은 차원 데이터를 포함 한 일반적으로 고용된 분석 기법을 구현 하 여 높은 차원 흐름 cytometry 데이터의 분석을 간소화 하는이 필요를 해결 하기 위해 개발 t-SNE 차원 감소, 자동 및 수동 클러스터링 메서드, heatmaps, 및 소설 높은 차원 흐름의 다양 한 플롯합니다. 또한, ExCYT 추가 t SNE 및 클러스터링 분석 뿐만 아니라 빌 게이츠 t SNE 플롯에 직접 적용 하는 기능에 대 한 관심의 선택 인구의 전통적인 제어 옵션을 제공 합니다. 소프트웨어 보상 중 하나를 사용 하는의 추가적인 장점을 또는 uncompensated FCS 파일을 제공 합니다. 사후 수집 보상은 필요한, 그 사용자 단일 얼룩의 디렉토리와 흠 없는 샘플 프로그램을 제공 하기 위해 선택할 수 있습니다. 프로그램은 모든 채널에서 긍정적인 이벤트를 감지 하 고 더 객관적으로 보상 매트릭스 계산를 선택이 데이터를 사용 하 여. 요약 하자면, ExCYT 교류 cytometry 데이터 FCS 파일의 형태로 이해 하는 그들의 데이터에 최신 알고리즘 접근을 사용 하 여 전산 교육에 어떤 개인을 허용 하는 포괄적인 분석 파이프라인을 제공 합니다.

서문

임상의 학자 및 과학자를 빠르게 식별 하 여 phenotypically 만드는 큰 해상도의 새로운 수준의 생물학 및 임상적으로 흥미로운 샘플을 특성화 cytometry 대량 cytometry의 출현에 있는 발전 수 있다 정보 풍부한^1,2,3높은 차원 데이터 세트. 이 방법은 생성에 실패할 수 있습니다 동안 수동 게이팅 등 교류 cytometry 데이터를 분석 하기 위한 기존의 방법 실험 몇 마커 고 그 마커는 시각적으로 뚜렷한 인구에 대 한 더 간단한, 더 높은 차원의 데이터 세트 또는 스펙트럼에 얼룩 마커를 분석할 때 재현할 결과. 예를 들어, 다 기관 연구에서 어디 세포내 얼룩 (ICS) 분석 실험 되 고 수행한 좋은 inter-laboratory 정밀, 분석에 불구 하 고 항 원 특정 T 세포 응답, 특히 quantitating의 재현성을 평가 하기 위해 게이팅, 다양성⁴의 중요 한 소스를 소개 했다. 또한, 수동으로 매우 주관적 되 고 게다가 관심사의 인구 게이팅의 과정이 매우 시간이 소모 하 고 노동 집약입니다. 그러나, 강력한, 효율적이 고 시기 적절 한 방식으로 높은 차원 데이터 세트를 분석의 문제는 한 연구 과학에 새로운 하지. 유전자 표현 연구는 종종 수동 형태의 분석 어디 단순히 가능한 것 (종종 순서 유전자의 수백) 매우 높은 차원 데이터 세트를 생성 합니다. 이러한 데이터 세트의 분석, 대처 하기 위해 구문 분석 유전자 표현 데이터⁵bioinformatic 도구 개발에 많은 작업이 되었습니다. 이러한 알고리즘 접근가지고 그냥 최근 채택 cytometry 데이터의 분석에서 매개 변수 수가 증가 하 고 이러한 높은 차원 데이터 세트^6,7의 분석에 유용한 것으로 입증 되었습니다.

생성 및 다양 한 알고리즘 및 과학자 들이 높은 차원 bioinformatic 접근 그들의 교류 cytometry 데이터에 적용할 수 있도록 하는 소프트웨어 패키지의 응용 프로그램에도 불구 하 고 이러한 분석 기법 아직도 크게 사용 되지 않는 남아 있습니다. Cytometry 데이터⁸이러한 접근법의 광범위 한 채용 제한 된 요인의 다양 한 있을 수 있습니다, 우리가 용의자에 주요 방해 과학자 들에 의해 이러한 방법의 사용, 전산 지식의 부족 이다. 사실, 이러한 소프트웨어 패키지 (즉, flowCore, flowMeans, 및 OpenCyto)의 많은 여전히 실질적인 프로그래밍 지식이 필요로 하는 연구 등 언어 프로그래밍 구현에 기록 됩니다. FlowJo 소프트웨어 패키지는 PC 운영 체제와의 호환성 뿐만 아니라 사용 및 ' 플러그 앤 플레이 ' 자연의 단순 과학자 중 호의 발견 했다. 과학자 생소 한 프로그래밍을 허용 하 고 가치 있는 분석 기술의 다양 한 제공, 우리는 ExCYT, 최신 기술의 많은 당기는 p C/맥에 쉽게 설치 될 수 있는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 개발 클러스터링 알고리즘 heatmaps 및 소설 높은 차원 흐름/상자 음모와 직관적인 시각화, 다양 한 문학, 이들의 출력을 탐험 소설 기능에 클러스터링 방법에 대 한 차원 감소에 포함 하 여.

ExCYT는 MATLAB에 내장 된 그래픽 사용자 인터페이스 및 따라서 수 있습니다 수 실행 MATLAB에서 직접 또는 설치 관리자는 어떤 PC/맥에 소프트웨어를 설치 하는 데 사용할 수 있는 제공 소프트웨어는 https://github.com/sidhomj/ExCYT에 있다. 데이터를 가져올, 사전 처리, t SNE 차원 감소, 클러스터 데이터 정렬을 수행할 및 클러스터 사용자 기본 설정, 및 heatmaps 및 소설을 통해 관심의 클러스터에 대 한 정보를 표시에 따라 필터링 하는 방법에 대 한 자세한 프로토콜 소개 높은 차원 흐름/상자 구획 (그림 1). T-SNE 플롯에 축 임의 및 임의 단위 이며 항상 사용자의 편의상 그림에 표시 된 같은 인터페이스. "T SNE Heatmaps"에 데이터 포인트의 색 노란색 표시 된 마커의 신호에 따라 파란색에서입니다. 클러스터링 솔루션에서 데이터 요소의 색상 기반으로 임의의 클러스터 번호 합니다. 워크플로의 모든 부분 GUI (그림 2 단일 패널에서 수행할 수 있습니다 & 표 1). 마지막으로, 우리는 이전 게시 된 데이터도 비슷한 방법으로 분석, 문학에서 신장 세포 암의 면역 풍경을 탐험에 ExCYT의 사용을 시연할 예정 이다. 우리 아래 프로토콜 함께이 원고에 그림을 만드는 데 사용 되는 샘플 데이터 집합은 계정 등록 시 https://premium.cytobank.org/cytobank/projects/875에서 찾을 수 있습니다.

프로토콜

1. 수집 및 Cytometry 데이터 준비

1. 삽입할 모든 단일 얼룩 폴더에 자신과 레이블 채널 이름 (fluorophore, 아니라 표식)에 의해.

2. 데이터 수입 및 사전 처리

1. 를 일시 중지 하거나이 분석 파이프라인에 걸쳐 저장 하려면 단추 사용 하 여 작업 공간 저장 프로그램의 왼쪽 아래에 작업 영역으로 저장 하는 '. 매트 ' 나중 부하 작업 영역 단추를 통해 로드할 수 있는 파일. 한 번에 프로그램의 하나 이상의 인스턴스를 실행 하지 마십시오. 따라서, 새 작업 영역을 로드할 때 확인을 실행 하는 ExCYT의 다른 인스턴스가 있는지 확인 합니다.
2. 분석 파이프라인을 시작 하려면 먼저 cytometry (Flow Cytometry 또는 질량 Cytometry-CYTOF), 이벤트 (이 예제에서는 2000)에 대 한 파일에서 샘플의 파일 선택 매개 변수 선택 번호의 유형을 선택 합니다. 일단 데이터는 성공적으로 가져온 대화 상자 데이터가 성공적으로 수입 되었음을 사용자에 게 알리는 팝업 됩니다.
3. 배 그 웰 & 아담스⁹일 옵션 자동 보정 단계를 수행 하 자동 보정 단추를 누릅니다. 단일 얼룩을 포함 하는 디렉터리를 선택 합니다. 사용자 인터페이스 대화 내에서 흠 없는 샘플을 선택 합니다.
   1. 이벤트 보상 매트릭스 계산를 선택 하는 데 사용 됩니다이 디렉터리에 샘플에 앞 으로/측면-분산형 게이트를 놓습니다. 이 목적을 위해 흠 없는 샘플을 사용 하는 것이 좋습니다. 이 시점에서, 알고리즘 임계값을 설정 일관 된 보상 행렬을 계산 하는 단일 얼룩의 각 긍정적인 이벤트를 정의 하는 흠 없는 샘플의 99^번째 백분위 수에서 구현 되었습니다. 이 완료 되 면 대화 상자는 보상 수행 되었습니다 사용자 알릴 것 이다.
4. 다음, 문 인구 를 누르고 대회 흐름에서 cytometry 분석은 관심의 세포의 인구를 선택. 인구의 셀을 선택 하면 이벤트 다운스트림 분석 (이 10000 이벤트)의 비율의 번호를 입력 합니다.
5. 다음 사전 처리 상자의 맨 오른쪽에 있는 목록 상자에서 분석에 사용할 번호 채널을 선택 (를 사용 하 여 예제에 표시 된 특정 채널).

3. t-SNE 분석

1. 시작 시작 프로그램을가지고 t-SNE 버튼을 누르면 창 t SNE 버튼 아래에 시각화를 위한 감소 차원 데이터 세트를 계산 하. T-SNE의 이미지를 저장 하려면 TSNE 이미지 저장을 누릅니다. 8 시스템에서 CPU @ 3.4 g h z 각 및 8 GM RAM이이 단계 10, 000 건의 50000 이벤트, 10 분 및 100000 이벤트에 대 일 분 약 2 분 정도 소요 됩니다.
2. ' T-SNE heatmap 만들려고 '에서 보듯이 여러 CYTOF 간행물^10,11, 선택 마커 관련 t-SNE 팝업 메뉴에서 옵션 (예제와 같이 특정 마커 CD64 또는 CD3 사용). 그림 그림 생성 저장할 수 있는 t SNE 플롯의 heatmap 표현을 보여주는 팝업 됩니다.
3. 게이트 t-SNE 버튼을 사용 하 여 추가 다운스트림 분석에 대 한 사용자 t SNE 플롯에 대 한 관심의 영역을 선택 합니다.

4. 클러스터 분석

1. 클러스터링 분석을 시작 하려면 (이 예에서는 우리 대화에 5의 거리 계수와 DBSCAN listbox의 오른쪽에 있는 상자)에서 클러스터링 메서드 목록 상자에서 옵션을 선택 합니다. 클러스터 버튼을 누릅니다.
2. 다음 옵션 중 하나를 사용 하 여 자동화 된 클러스터링 알고리즘 ' 자동화 된 클러스터링 매개 변수 ' 패널에서 발견.
   1. (T-SNE)에 하드 KMEANS: 알고리즘¹²제공 되는 클러스터 수를 k-평균 감소 2 차원 t SNE 데이터 클러스터링을 적용 하며.
   2. (HD 데이터)에 하드 KMEANS: k-평균 t SNE 알고리즘에 주어진 원래 높은 차원 데이터 클러스터링을 적용. 다시 한번, 클러스터 수 알고리즘을 제공 해야 합니다.
   3. DBSCAN: 응용 프로그램의 밀도 기반 공간 클러스터링 감소 2 차원 t SNE 데이터를 클러스터의 일반적인 크기를 결정 하는 차원 비 거리 요소를 필요로 하는 잡음¹³ 라는 클러스터링, 클러스터링 메서드를 적용 합니다 클러스터입니다. 그것은 감소 된 t-SNE 표현에는 클러스터 비 구상 클러스터 수 이러한 유형의 클러스터링 알고리즘은 클러스터 t SNE 감소에 적합 합니다. 또한, 사실은 그것은 2 차원 데이터에서 작동, 그건 빠른 클러스터링 알고리즘 중 하나.
   4. 계층적 클러스터링: 기존 계층적 클러스터링 메서드 전체 유클리드 거리 행렬은 거리 요소는 클러스터의 크기를 설정 하는 알고리즘을 제공 하기 전에 모든 이벤트 사이 계산 하는 높은 차원 데이터에 적용 됩니다.
   5. 네트워크 그래프- 기반:^11,14를 검색 하는 사용자가 드문 모집단 때 흐름 cytometry 데이터 분석에 가장 최근에 도입 되어 클러스터링 방법 적용. 이 메서드는 첫 번째 데이터에서 모든 이벤트 사이 연결을 결정 하는 그래프를 만드는 방법에 의존 합니다. 이 단계 k-가장 가까운 이웃 수 그래프를 만들려면 초기 매개 변수를 제공 구성 되어 있습니다. 이 매개 변수는 일반적으로 클러스터의 크기를 제어합니다. 이 시점에서, 또 다른 대화 상자는 그래프에 적용 되는 클러스터링 알고리즘 5 중 하나를 사용 하는 사용자 팝업. 그래프, 댄 메서드와는 스펙트럼 클러스터링 알고리즘^{14,15,16,,1718}의 모듈화를 극대화 하기 위해 3 옵션 포함 됩니다. 하나 일반적으로 빠른 클러스터링 솔루션을 원하는 경우에 스펙트럼 클러스터링 또는 빠른 욕심 모듈화 극대화 하는 것이 좋습니다. 댄 메서드 함께 모듈화 극대화 방법을 최적의 클러스터 수를 결정, 스펙트럼 클러스터링 합니다 프로그램에 주어진 수를 클러스터 수를.
   6. 자체 지도 구성: 고 차원 데이터를 클러스터링 하는 인공 신경 네트워크를 사용 합니다.
   7. GMM-기대 극대화: 기대 극대화 (EM) 기법을 사용 하 여 높은 차원 데이터를 클러스터링 하는 가우스 혼합 모델을 만들기. ¹⁹ 클러스터링 방법의이 종류는 또한 클러스터의 수를 입력 하는 사용자를 필요 합니다.
   8. GMM 위한 변 분 베이지안 추론: 가우스 혼합 모델 만들지만 그들와 달리 그것은 자동으로 확인할 수 혼합물 구성 요소 공화국²⁰ 수 프로그램 주어질 클러스터의 수를 필요로 합니까 (보다 큰에 클러스터 수가 예상), 알고리즘 자체에 최적의 수를 결정 합니다.
3. T SNE 음모의 특정 영역 연구, 사용자 정의 클러스터 집합을 그리는 수동으로 클러스터 선택 단추를 누릅니다. 메모의 클러스터 구성원 (즉, 각 이벤트 1 클러스터에만 속할 수 있습니다)를 공유할 수 없습니다.

5. 클러스터 여과

1. 클러스터의 집합 중 하나를 수동으로 식별 또는 위에서 설명한 자동 방법 중 하나를 통해 통해 다음과 같이 필터링 수 있습니다.
   1. 마커는 실험에서 측정에 의해 ( 클러스터 필터 패널)에서 클러스터를 정렬 하려면 정렬 팝업 메뉴에서 옵션을 선택 합니다. 순서 오름차순 또는 내림차순으로 여부를 설정 하려면 정렬 팝업 메뉴의 오른쪽에 오름차순/내림차순 버튼을 누릅니다. 이 '클러스터 (여과)' 목록 상자에서 클러스터의 목록을 업데이트 하 고 해당 표시의 평균 클러스터 표현의 내림차순 순서 그들. '클러스터 (여과)' 목록 상자에 표시 하는 백분율 인구가이 클러스터를 나타내는 비율을 나타냅니다.
   2. 특정 채널을 통해 특정된 클러스터에 대 한 최소 임계값 값을 설정 하려면 임계값 팝업 메뉴에서 옵션을 선택 (이 예에서는 우리 마커 CD65 및 0.75에서 임계값 설정). 그래프 아래의 숫자 상자에 값을 입력 하거나 슬라이드 막대를 사용 하 여 임계값을 설정 합니다. 임계값을 설정 임계값의 방향을 지정 하는 임계값 위에 추가 또는 임계값 아래 추가 누릅니다. 이 임계값을 설정 어디 마커, 임계값 값 및 방향 표시 됩니다 사용자가 알고 있는 임계값 현재 적용 되 고 그래서 ' 클러스터 필터 ' 패널 옆 임계값 상자에 나열 됩니다. 마지막으로, t-SNE 줄거리 여과의 요구 사항을 충족 하지 않는 클러스터 밖으로 흐리게 하 여 업데이 트 됩니다 그리고 '클러스터 (여과)' 목록 상자 여과 요구 사항을 충족 하는 클러스터를 표시 하려면 업데이트 됩니다.
   3. 클러스터의 주파수에 대 한 최소 임계값을 설정 하려면 입력 숫자 마감 클러스터 주파수 임계값 (%) (이 예제에서는 사용 하 여 1%)에서 클러스터 필터 패널에서 상자.

6. 클러스터 분석 및 시각화

1. 추가 분석 및 시각화에 대 한 클러스터를 선택 하려면 클러스터 (여과) 목록 상자에서 클러스터를 선택 하 고 클러스터 분석 listbox 이동 선택 à 단추를 누릅니다.
2. Heatmaps 클러스터를 만들려면 클러스터 분석 listbox의 클러스터를 선택 하 고 클러스터 HeatMap 단추를 누릅니다. 이 버튼을 누르면 그림 포함 하는 클러스터 및 매개 변수 축에 dendrograms 함께 열 지도 팝업 됩니다. 세로 축에서 dendrogram는 그 가로에 dendrogram 동안 밀접 하 게 관련 된 클러스터 그룹 축 마커 공동 연결을 그룹화 합니다. Heatmap 저장을 눌러 파일 | 설정 내보내기 | 수출.
3. ' 높은 차원 상자 그림 ' 또는 ' 높은 차원 흐름 플롯 '을 만들려면 클러스터 분석 listbox의 클러스터를 선택 하 고 높은 차원 상자 그림 단추 또는 높은 차원 흐름 플롯 버튼을 누릅니다. 이 플롯 시각의 분포를 평가 하기 위해 사용할 수 있는 모든 차원에 걸쳐 다양 한 클러스터의 채널을 주어진.
4. 전통적인 2D 흐름 플롯에 클러스터를 표시 하려면 변환 (선형, log10, arcsinh)을 선택 하 고 기존의 흐름 플롯 패널 및 보도 채널 기존의 흐름 플롯.

결과

우리 Chevrier 외. '는 면역 아틀라스의 명확한 세포 신장 암 ' 그룹 73에서 종양 샘플에 광범위 한 면역 패널 CyTOF 분석을 실시 라는 의해 큐레이터 데이터 세트를 분석 하는 ExCYT의 유용성을 테스트 하려면 환자¹¹. 두 개의 별도 패널, 골수성과 림프 패널 phenotypically 종양 microenvironment 특성을 사용 했다. 우리의 연구의 목적은 그들의 t-SNE의 결과 정리 및 ...

토론

여기에 우리가 ExCYT, 새로운 그래픽 사용자 인터페이스를 간소화 높은 차원 cytometry 데이터의 분석을 MATLAB 기반의 알고리즘을 실행 높은 차원 데이터에 최신을 구현 프로그래밍 백그라운드 없이 개인 수 있도록 제시 분석 알고리즘입니다. 광범위 한 과학 사회에이 소프트웨어의 가용성 과학자는 간단 하 고 직관적인 워크플로에 그들의 흐름 cytometry 데이터를 탐색할 수 있습니다. 통해 t SNE 차원 감?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Desktop	SuperMicro	Custom Build	Computer used to run analysis
MATLAB	Mathworks	N/A	Software used to develop ExCYT