Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Özet

İşte, bir yakınlık ligasyonu tahlil (PLA) ile yüksek hassasiyet MST1/MST2 heterodimerization sabit hücrelerdeki görselleştirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Özet

Düzenlenmiş protein-protein etkileşimleri çok sayıda sinyal olayı için temel bir ilke vardır ve bu tür olayların tespiti böyle yolları nasıl düzenlendiğini ve şekilleriyle anlamada önemli bir unsurdur. Protein-protein etkileşimleri hücrelerde algılamak için pek çok yöntem vardır, ancak nispeten az endojen proteinler arasındaki etkileşimler algılamak için kullanılabilir. Böyle bir yöntem, yakınlık ligasyonu tahlil (PLA), kullanımı tavsiye bir çok avantajı vardır. Protein-protein etkileşimi analiz ortak diğer yöntemlerine göre PLA nispeten yüksek duyarlılık ve özgüllük vardır, çok az hücre düzenleme ile burada açıklanan protokol yapılabilir, sadece iki hedef özgü gerektirir antikorlar farklı türlerden elde edilen (e.g., fare ve tavşan) ve bir özel reaktif: bir dizi belirli kovalent bağlı oligonucleotides olan ikincil antikorlar, birbirine yakın getirdiğimde, oluşturmak bir situ PCR veya çalışırken daire amplifikasyon amplifiable platformu. Bu sunum, biz MST1 ve MST2 yakınlık sabit hücrelerdeki değişiklikler görselleştirmek için PLA tekniği uygulamak gösterilmiştir. Bu el yazması açıklanan tekniği, özellikle hücre çalışmaları sinyal analizi için geçerlidir.

Giriş

MST1/Hippo sinyal kesintileri gelişimsel bozuklukları ve karsinojenezis¹bağlı olmuştur. Memelilerde, MST1 ve MST2 kinaz etkinleştirin (fazdan) MOB1 ve LATS1/2, ikincisi olan daha sonra phosphorylates ve transkripsiyon ortak harekete geçirmek Evet ilişkili protein (YAP)²inaktive. Etkin (unphosphorylated) haliyle YAP oncogenic etkinlik, hücre proliferasyonu genlerin transkripsiyon artırılması vardır; Bunun tersi olarak, YAP Hippo yolu tarafından inaktive, hücre çoğalması bastırılır ve Apoptozis³terfi. Dokularda, esas olarak active homodimers, MST1 ve MST2 var ama oncogenic uyaranlara MST1/MST2 heterodimers düzeyleri artırabilir ve böyle heterodimers etkin olmayan⁴vardır. Ancak, MST1/MST2 heterodimerization nasıl düzenlenir kötü anlaşılır kalır. Homo - hem heterodimers aracılı ile C-terminal dolandı-coil MST1 bölgelerinde ve SARAH etki alanları⁵olarak bilinen MST2 arasındaki etkileşimler vardır. Bir in situ kullanarak PLA Bu makalede, biz insan Schwann hücreleri (HSC) ve insan embriyonik böbrek hücrelerinde (HEK-293) MST1/MST2 heterodimers varlığını göstermek gösterdi. Tespit ve transgene ifade ihtiyacı veya epitope Etiketler kullanımı sayısal endojen protein-protein etkileşimleri algılanmasını sağlar çünkü PLA diğer protein/protein etkileşim algılama yöntemleri üzerinde bir avantaj vardır ⁶.

Sinyal iletim yollarının büyük ölçüde bileşen proteinler koşullu Derneği tarafından kontrol edilir. Örneğin, çoğu reseptör Tirozin kinaz uyarılması kendi homo veya heteroseksüel dimerization ve ek hücre içi sinyal proteinleri, kendilerini izleyen ilişkilendirmesiyle formu daha fazla kompleksleri yol açar. Proteinler daha az 30-40 nm parçalara olması koşuluyla PLA yöntemin amacı hücrelerdeki proteinler arasında yakınlık görselleştirmek etmektir. Protein yakınlık genellikle ilk hücre içinde farklı tür kaldırdı uygun birincil antikorlar ile kuluçka tarafından tespit (Örn., tavşan ve fare) karşı etkileşen her protein, sonra species-specific ikincil antikorlar, ekleme önceden birleştiğinde kısa DNA sondalar. DNA probları yakın iseniz, belirli bir bağlantı DNA oligonükleotid aynı anda hem in situ PCR veya daire mekanizması haddeleme tarafından amplifikasyon için bir platform oluşturan Bu sondalar bağlayabilirsiniz. Floresan Etiketler amplifikasyon tepki eklendi görselleştirme kolayca sayılabilir ve hücre^7,8, belirli bölgelere lokalize floresan noktalar olarak görünür etkileşen proteinlerin izin ^{9 , 10}.

Protokol

1. hazırlanması çözümleri

1. Sabitleştirici çözüm hazırlamak: %4 paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS. 10 mL için 2.5 mL % 16 almak PFA ve 7,5 mL 1 x PBS ekleyin.
   Tehlikeler: İngiltere'de yılın düşük dozlarda kanserojen. Duman ve Ciltle temas tehlikeli. -20 ° C'de mağaza
2. Permeabilization çözüm hazırlamak: %0,1 1 x PBS Triton X-100. 100 mL için çözeltisi, Triton X-100 100 µL 100 mL 1 x PBS ekleyin. (RT) Oda sıcaklığında saklayın.
3. Yıkama arabellek hazırlayın: 1 x TBST. 1 L için 10 x TBS 100 mL, dH₂O 890 mL ve 10 mL Tween 20 (% 10) alın.
4. Engelleme çözüm paketi tarafından sağlanan gibi hazırlayın. Alternatif olarak, % 2 BSA içeren 1 x PBS çözüm kullanın.
5. Antikor seyreltici kit tarafından sağlanan gibi hazırlayın. Alternatif olarak, % 1 BSA içeren 1 x PBS çözüm kullanın.

2. kaplama hücre

Not: Bu çalışmada, kullandığımız ölümsüzleştirdi insan Schwann hücreleri (iHSC) ve insan embriyonik böbrek 293 hücreleri (HEK 293); Ancak, bu yöntem yapışık hücreleri birçok türü için kullanılabilir.

1. Kültür HEK 293 yılında % 10 ile desteklenmiş DMEM FBS, %0.2 glikoz, 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penisilin G ve 100 µg/mL streptomisin doku kültürü tedavi plakaları 37 ° c % 5 CO₂. İHSC kalem/Strep ve 2 µM forskolin FBS/DMEM takıma % 10 sürdürmek. Rutin test hücreleri Mikoplazma için. Hiçbir hücre satır kimlik doğrulaması gerçekleştirildi.
2. 16-iyi odası slayt 10 µg/mL doğal fare laminin veya % 0,01 poli-L-lizin çözüm 50 µL ile ceket ve % 5 CO₂37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. %0,04 tripsin-EDTA kullanarak hücreleri bölün.
3. Plaka iHSC ve HEK-293 yılında 100 µL % 80 izdiham (15.000-25.000 hücreler/de), orta.
4. Kuluçkaya hücreler için 12-24 saat içinde oksijen, 37 ° C'de % 5 CO₂ kuluçka makinesi.

3. fiksasyon ve Permeabilization

1. Orta kuyulardan kaldırmak ve 1 x PBS 100 µL ile yıkayın. Örnek çıkarma riskini en aza indirmek için micropipette ile Aspire edin.
2. Hücreleri 4 PFA ücret iyi ve ajitasyon olmadan, RT, 10 min için kuluçkaya % 50 µL ekleyerek düzeltmek. Hücreleri dekolmanı duyarlıdır, yani doğrudan hücreleri üzerine çözümleri pipetting önlemek.
3. % 0.05 hücrelerle yıkama 5 min için üç kez TBST. Örnek çıkarma riskini en aza indirmek için micropipette ile Aspire edin.
4. Ajitasyon, RT. olmadan 10 dk permeabilization çözüm (% 0,1 Triton x-100 1 x PBS içinde) hücrelerle tedavi
5. TBST hücrelerle ajitasyon ile her 5 min için üç kez yıkayın.

4. engelleme

1. TBST (micropipette) ile çok nazikçe kapalı dokunun. Hücreleri bağlı kalır eğer görmek için mikroskop slayt görselleştirin.
2. Bir damla (50-60 µL) 1 x engelleme çözüm her örnek için ekleyin.
3. 37 ° c nem odası (su ile boş ipucu kutusunu) ön ısı ve bu slaytları 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya

5. birincil antikorlar

1. Birincil antikor (1: 100) antikor Dilüent seyreltik ( Tablo malzemelerigörmek). İyi başına 40 µL antikor çözüm hazırlamak.
2. Engelleme çözüm sıvı kapalı dokunarak slaytlardan kaldırmak. Hücreleri kuru izin vermez.
3. Girdap ve her şey için antikor çözümleri 40 µL ekleyin.
4. Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 1 h kuluçkaya.

6. yakınlık ligasyonu tahlil probları

Not: PLA probları bir Seti'nin parçası olarak sağlanmıştır (bkz. Tablo malzeme). Seçtiğiniz probları bir birincil antikorlar faiz proteinlerin algılamak için kullanılan türler üzerinde bağlıdır.

1. İki PLA problar (Anti-fare eksi ve anti-tavşan artı) seyreltik 1: 5'te antikor seyreltici. Her örnek için 40 µL PLA inceleyebilirsek hazırlayın. Karışım RT., 20 dk için kuluçkaya
2. Slaytları birincil antikor çözümden kapatmak dokunun. 5 min her arabellek yıkama ile iki kez slaytlarını RT. yıkama
3. Yavaşça slaytlardan yıkama tamponunun dokunun ve seyreltici PLA sonda çözüm wells (40 µL/de) ekleyin.
4. Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 1 h için slaytları kuluçkaya

7. tüp ligasyonu

Not: in situ algılama reaktifler kırmızı, ligaz ve ligasyonu çözüm bir Seti'nin parçası olarak sağlanmıştır (bkz. Tablo malzeme).

1. Situ algılama reaktifler kırmızı kullanın.
2. Hemen önce kullanmak, girdap ve 5 x 1:5 içinde yüksek saflıkta su tüp ligasyonu stok gerekli miktarda oranında seyreltin.
   Not: seyreltilmiş reaktifler depolamayın.
3. Slaytları PLA sonda çözümden uzak dokunun. 1 x 5 dk her RT. az için iki kez yıkama arabellek slaytları yıkayın
4. Hemen önce ek örnekleri, girdap ve ligaz ligasyonu 1:40 ekleyin seyreltme ve tekrar girdap.
5. Slaytları yıkama arabelleğinden kapalı dokunun ve her şey (40 µL/de) tüp ligasyonu/ligaz çözüm ekleyin.
6. Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 30 dk için slaytları kuluçkaya

8. güçlendirme

Not: Amplifikasyon hisse senedi bir Seti'nin parçası olarak sağlanmıştır (bkz. Tablo malzeme). Reaktifler ışığa duyarlı vardır; Böylece ışık slaytlara kullanılmasını önlemek.

1. Girdap ve 5 x amplifikasyon hisse senedi 1:5 yüksek saflıkta su gerekli miktarda sulandırmak ve karıştırın.
2. Slaytları ligasyonu/ligaz çözümden uzak dokunun. 1 x 2 dk her RT. az için iki kez yıkama arabellek slaytları yıkayın
3. Girdap ve polimeraz 1:80 seyreltme ve girdap güçlendirme çözüm yeniden ekleyin.
4. Yıkama tampon slaytlardan dokunun ve her şey (40 µL/de) güçlendirme/polimeraz çözüm ekleyin. Önceden ısıtılmış nem odası 37 ° C'de 100 min için slaytları kuluçkaya

9. görüntüleme için hazırlık

Not: Bu ışık duyarlı reaktifler vardır. Işıktan korunan slaytlar tutun.

1. Slaytları amplifikasyon-polimeraz çözümden uzak dokunun ve iki kez 10 dk içinde her 1 x yıkama arabellek RT., yıkama
2. Odalar ve silikon wells etrafında slayttan tamamen kaldırın. Silikon kalan parçaları bir ustura ile kazı. Her ayıran slayt üzerinde bir tablo çizmek de.
3. ~ 40 µL DAPI ile montaj ortamının ekleyin. Kapak notu altında hava kabarcıkları yakalama önlemek dikkatli olun. Kapak notu kenarlarını oje ile kapalı gibi.
4. Confocal bir mikroskop kullanarak görüntü analizi yapmadan önce en az 20 dakika bekleyin.
   Not: Protokol burada duraklatılmış.
5. Görüntüleme sonra karanlıkta slaytlar-20 ° C'de depolayın.

Sonuçlar

PLA tahlil HEK-293 ve iHSC MST1 ve MST2 arasındaki etkileşimi sınamak için kullanılır. Hücreleri sabit, permeabilized ve in situ amplifikasyon PLA Protokolü (Şekil 1) göre ardından çeşitli antikorlar ile lekeli. MST1/MST2 heterodimerization düzeyini belgelemek için hücreleri MST1 ve MST2 antikorlar ile (Şekil 1A, 1 C ve 1 G) lekeli. Pozitif kontrol olarak biz de ERK kullanılır ve hücr...

Tartışmalar

Cam odası slaytlar gibi çok çeşitli (14-16) hücre hatları ile deneme gerçekleştirmek uygundur ve örnek mikroskobu analizi sırasında her zaman değiştirmek için gerek yoktur bu deneme için kullanmak yararlı bulduk. Bir antikor ile çapraz bulaşma riski gibi bazı komplikasyonlar ortaya çıkabilir. Bu nedenle, biz her şey yıkama öneririz deneme artan süre rağmen bir Coplin kavanoz kullanmak yerine tek tek. Buna ek olarak, silikon Ekle kaldırılması hassas bir meseledir ve özen ve sabır ile yapılm...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamber slides	Thermo Fisher Scientific	178599	16 well, glass slide
PLA probe Anti-Mouse Minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent
PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent
Wash Buffers, Flurescence	Sigma-Aldrich	DUO82049	Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B
Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040
Detection Reagents Red	Sigma-Aldrich	DUO92008	Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody	Cell Signaling	9102s
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)	Cell Signaling	5726s	pERK antibody
MST2 antibody	Cell Signaling	3952s
Krs-2 (RJ-5)	Santa Cruz	sc-100449	MST1 antibody
16% Paraformaldehyde	Electron microscopy sciences	15710	Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution
Triton x100	Fisher BioReagents	BP 151-500	To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution
Confocal microscopy	Leica TCS SP8, 63x		Image analysis with ImageJ software