Обнаружение Heterodimerization изоформ белка, используя Assay в Situ близости лигирование

Резюме

Здесь мы покажем, как использовать Assay лигирование близости (НОАК) для визуализации MST1/MST2 heterodimerization в фиксированных ячейках с высокой чувствительностью.

Аннотация

Регулируемые белок белковых взаимодействий являются руководящим принципом для многих событий, сигнализации, и обнаружение таких событий является важным элементом в понимании того, как организованы такие пути и как они функционируют. Есть много методов для обнаружения белок белковых взаимодействий в клетках, но относительно немногие может использоваться для определения взаимодействия между эндогенного белков. Один из таких методов, близость лигирование пробирного (НОАК), имеет несколько преимуществ рекомендовать ее использование. По сравнению с другими общие методы анализа взаимодействия протеин протеина, PLA имеет относительно высокую чувствительность и специфичность, могут выполняться с минимальными клеток манипуляции и в протоколе, описанные здесь, требует только два целевых антитела, полученных от разных видов (например., от мыши и кролика) и одно специализированное реагента: набор вторичных антител, которые являются ковалентно связан с конкретным олигонуклеотиды, когда принес в непосредственной близости друг от друга, создать Мы платформа в situ ПЦР или подвижного круга амплификации. В этой презентации мы покажем как применять технику НОАК визуализировать изменения в MST1 и MST2 близости в стационарных клетках. Метод, описанный в этой рукописи особенно применима для анализа клеток сигнализации исследования.

Введение

Нарушение MST1/Бегемот сигнализации были связаны с отклонениями и канцерогенеза¹. В млекопитающих, активировать киназы MST1 и MST2 (фосфорилировать) MOB1 и LATS1/2, последний из которых затем фосфорилирует и инактивирует транскрипционный анализ совместного активатор да связанные белком (YAP)². В его активную форму (unphosphorylated) Яп имеет онкогенных активность, повышение транскрипцию генов распространения клеток; и наоборот когда YAP инактивированная Бегемот дорожка, пролиферацию клеток подавляется и апоптоз передовой³. В тканях существуют главным образом в качестве активного homodimers, MST1 и MST2 но онкогенных раздражителей может увеличить уровни гетеродимерами MST1/MST2, и такие гетеродимерами являются неактивными⁴. Однако как регулируется MST1/MST2 heterodimerization по-прежнему осознаются. Гомо - и гетеродимерами, опосредованное через взаимодействия между регионами биспиральных C-терминала MST1 и MST2, известная как Сара домены⁵. Использование в situ PLA продемонстрировал в этой статье, мы покажем присутствие гетеродимерами MST1/MST2 в клетках человека Шванновские клетки (HSC) и человеческих эмбриональных почек (ГЭС-293). PLA имеет преимущество перед другими методами обнаружения взаимодействия протеин/потому что она позволяет обнаруживать эндогенного белок белковых взаимодействий, которые могут быть определены и количественно без необходимости трансген выражения или использование epitope тегов ⁶.

Сигнальных путей значительной степени контролируется ассоциацией условного компонента белков. К примеру стимуляция большинства рецепторов тирозин киназ приводит к их гомо - и гетеро димеризации и последующего объединения с дополнительной внутриклеточных сигнальных белков, которые сами формы дальнейшего комплексов. PLA метод предназначен для визуализации близости между белков в клетках, условии, что белки не менее 30-40 Нм друг от друга. Близость белка обычно определяется первой инкубации клеток с соответствующей первичной антител, поднятые в различных видов (например., кролик и мышь) против каждый протеин, затем добавляя вегетационных вторичные антитела, предварительно спаренных к краткости ДНК зонды. Если ДНК-зонды находятся в непосредственной близости, конкретных ссылок ДНК олигонуклеотида одновременно можно связать оба эти зонды, формирование платформы для усиления в situ ПЦР или подвижного круга механизм. Флуоресцентный теги, добавленные к реакции амплификации позволяют визуализация взаимодействия белков, которые появляются как люминесцентные точки, которые могут быть легко количественно и локализованы в отдельных регионах в ячейке^7,,^{8, 9 , 10}.

протокол

1. Подготовка решений

1. Подготовить фиксирующие решение: параформальдегида 4% (PFA) в однократном ПБС. По 10 мл, принимать 2,5 мл 16% PFA и добавить 7,5 мл ПБС.
   Опасности: PFA канцерогенных при низких дозах. Опасных дымов и контакт с кожей. Хранить при температуре от-20 ° C.
2. Приготовляют раствор permeabilization: 0.1% тритон X-100 в однократном ПБС. 100 мл раствора добавьте 100 мкл Тритон X-100 100 мл ПБС. Хранить при комнатной температуре (RT).
3. Подготовить мыть буфер: 1 x TBST. На 1 Л принимать 100 мл 10 x TBS, 890 dH₂O до 10 мл 20 анимации (10%).
4. Подготовьте блокирования решения как поставляется комплект. Альтернативно используйте 1 x PBS раствор, содержащий 2% BSA.
5. Подготовка разбавителя антитела, как поставляется комплект. Альтернативно используйте 1 x PBS раствора, содержащего 1% BSA.

2. покрытие клеток

Примечание: В этом исследовании мы использовали увековечен Шванновские клетки человека (iHSC) и клеток человеческого эмбриона почек 293 (ГЭС 293); Однако этот метод может использоваться для многих типов адэрентных клеток.

1. Культура 293 ГЭС в DMEM дополнена 10% FBS, 0,2% глюкозы, 2 мм L-глютамином, 100 ед/мл пенициллин G и 100 мкг/мл стрептомицина на культуре ткани лечение пластины при 37 ° C в 5% CO₂. Сохранить iHSC в 10%, которые FBS/DMEM с пером/воспаление и 2 мкм Форсколин. Обычно тест клетки для микоплазмы. Была выполнена без аутентификации линии клеток.
2. Слой слайд 16-ну камеры с 50 мкл раствора 10 мкг/мл природные мышь Ламинин или 0,01% поли L-лизин и Инкубируйте 30 минут при 37 ° C в 5% CO₂. Разбиение ячеек с помощью 0,04% трипсина ЭДТА.
3. Плита iHSC и ГЭС-293 в 100 мкл среды на 80% слияния (15000-25000 клеток/хорошо).
4. Инкубировать клетки для 12-24 часа при 37 ° C в увлажненные, 5% CO₂ инкубатора.

3. Фиксация и Permeabilization

1. Удалите носитель из скважин и мыть с 100 мкл ПБС. Аспирационная с микропипеткой свести к минимуму риск удаления образца.
2. Исправьте клетки, добавляя 50 мкл 4% ПФА за хорошо и проинкубируйте втечение 10 мин на RT, без агитации. Клетки чувствительны к отряда, поэтому избегайте закупорить решения непосредственно на клетки.
3. Вымыть клетки с 0,05% TBST три раза за 5 мин. Аспирационная с микропипеткой свести к минимуму риск удаления образца.
4. Лечить клетки с permeabilization раствором (0,1% тритон x-100 в ПБС) для 10 мин без агитации на RT.
5. Вымойте клетки с TBST три раза за 5 мин с перемешиванием.

4. Блокировка

1. Кран TBST (очень осторожно с микропипеткой). Визуализируйте слайд в Микроскоп, чтобы увидеть, если клетки остаются присоединенными.
2. Добавьте по одной капле (50-60 мкл) 1 x блокирование решение для каждого образца.
3. Предварительно нагрейте влажность палата (пустой кончик коробка с водой) при 37 ° C и инкубировать слайды в нем за 1 ч при 37 ° C.

5. первичные антитела

1. Разбавить первичного антитела (1: 100) в антитела разбавителя (см. Таблицу материалы). Подготовьте раствор 40 мкл антител в колодец.
2. Удалите блокирующий решение из слайдов, нажав жидкости. Не позволяют клеткам для просушки.
3. Вортекс и 40 мкл антител решений для каждой скважины.
4. Инкубируйте 1 час при 37 ° C в предварительно разогретой влажность камере.

6. близость лигирование Assay зонды

Примечание: PLA зонды предоставляются как часть комплекта (см. Таблицу материалы). Выбор датчиков будет зависеть от вида первичных антител, используется для определения белков интерес.

1. Разбавить двух зондов PLA (анти мыши минус и плюс анти кролик) 1:5 в антитела разбавителя. Для каждого образца Подготовьте 40 мкл PLA зонда. Инкубировать смесь для 20 мин на RT.
2. Кран основное антитело решение от слайды. Вымойте слайды дважды за 5 мин с мыть буфера на RT.
3. Аккуратно коснитесь мыть буфера от слайды и разбавителя PLA зонд решение добавить скважин (40 мкл/хорошо).
4. Инкубируйте слайды в камере подогретую влажность за 1 ч при 37 ° C.

7. Перевязка

Примечание: на месте обнаружения реагентов красный, лигаза и перевязка решения предоставляются как часть комплекта (см. Таблицу материалы).

1. Использование на месте обнаружения реагентов красный.
2. Непосредственно перед употреблением, вихрь и разбавленных необходимых объемов 5 x лигирование фондовой 1:5 в высокой чистоты воды.
   Примечание: Не хранить разбавленные реагентов.
3. Кран НОАК зонд решение от слайды. Вымойте слайды в 1 x стирки буфер дважды за 5 мин на RT.
4. Непосредственно перед добавлением к образцам вихрь и добавьте лигаза лигирование решение в 1:40 разрежения и вихрь снова.
5. Кран мытья буфер из слайдов и добавить лигирование/лигаза решение для каждой скважины (40 мкл/хорошо).
6. Инкубируйте слайды в предварительно нагретой влажность камеру для 30 минут при 37 ° C.

8. усиление

Примечание: Усиление Фонда предоставляется как часть комплекта (см. Таблицу материалы). Реагенты являются светочувствительный; Таким образом, Избегайте разоблачения слайды к свету.

1. Вортекс и разбавить необходимых объемов 5 x фондовой усиления 1:5 в высокой чистоты воды и перемешать.
2. Кран лигирование/лигаза решение от слайды. Вымойте слайды в 1 x стирки буфер дважды для 2 мин на RT.
3. Вортекс и добавьте полимеразы амплификации решение на 1:80 разрежения и вихрь снова.
4. Кран мытья буфер из слайдов и добавить усилители/полимеразы решение для каждой скважины (40 мкл/хорошо). Инкубируйте слайды в предварительно нагретой влажность камеру для 100 мин при 37 ° C.

9. Подготовка изображений

Примечание: Это легкие чувствительных реагентов. Держите слайды, защищенном от света.

1. Кран усилители-полимеразы решение от слайды и мыть дважды в течение 10 минут каждый в 1 x мыть буфера на RT.
2. Камеры и силикона вокруг лунки полностью удалите из слайда. Соскрести оставшиеся биты силикона с бритвой. Нарисовать сетку на слайде, отделяя каждый хорошо.
3. ~ 40 мкл монтажа среды с DAPI. Будьте осторожны избежать захвата воздушных пузырей под крышку выскальзования. Края крышки выскальзования могут быть герметизированы с ногтей.
4. Подождите по крайней мере 20 минут перед выполнением анализа изображений с помощью конфокального микроскопа.
   Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
5. После съемки, храните слайды при температуре-20 ° C в темноте.

Результаты

Мы использовали НОАК assay для тестирования взаимодействия между MST1 и MST2 ГЭС-293 и iHSC. Клетки были исправлены, permeabilized и витражи с различных антител, следуют в situ амплификации согласно протоколу PLA (рис. 1). Для документирования уровня MST1/MST2 heterodimerization, кле...

Обсуждение

Мы нашли его полезным использовать стекло камеры слайды для этого эксперимента, как это очень удобно для выполнения эксперимент с несколькими линиями клетки (14-16), и нет необходимости изменить образец каждый раз во время анализа в микроскопии. Несколько осложнения могут возникать, напр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamber slides	Thermo Fisher Scientific	178599	16 well, glass slide
PLA probe Anti-Mouse Minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent
PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent
Wash Buffers, Flurescence	Sigma-Aldrich	DUO82049	Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B
Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040
Detection Reagents Red	Sigma-Aldrich	DUO92008	Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody	Cell Signaling	9102s
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)	Cell Signaling	5726s	pERK antibody
MST2 antibody	Cell Signaling	3952s
Krs-2 (RJ-5)	Santa Cruz	sc-100449	MST1 antibody
16% Paraformaldehyde	Electron microscopy sciences	15710	Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution
Triton x100	Fisher BioReagents	BP 151-500	To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution
Confocal microscopy	Leica TCS SP8, 63x		Image analysis with ImageJ software