Pulsatil luteinizan hormon salgısı değerlendirilmesi için kuyruk ucu kan örnekleme farelerde sık

Özet

Burada kontrolsüz farelerde sık örnek koleksiyon için bir kuyruk ucu kan örnekleme iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem, pulsatil luteinizan hormon salgısı değerlendirilmesi desenleri yararlıdır ve dolaşımdaki diğer faktörleri analiz için adapte.

Özet

Birçok endokrin sistemlerinde, dolaşımdaki faktörler veya hormonlar sürekli serbest bırakılmaz, ancak yanıt releasing faktör olarak ayrık bir darbe olarak salgılanan. Tek-noktaya örnekleme önlemler tamamen pulsatil hormonlarının normal fizyolojik koşullar altında veya bozukluk koşulları sırasında salgı desen biyolojik önemini anlamak yetersizdir. Luteinizan hormon (LH) anterior hipofiz gonadotrope hücreleri tarafından sentezlenen ve sık sık kan örnekleri topluluğu için nabız değerlendirme gerektiren pulsatil desen salgılanan. İçin bir teknik gelişme sık düşük hacimli örnek koleksiyon, başlangıçta Steyn ve meslektaşları tarafından açıklanan ve bu kadar yüksek-duyarlı LH tahlil gelişimi nedeniyle son zamanlarda, farelerde mümkün olmamıştır. ¹ burada tarif biz sık periferik kan örnek koleksiyonundan pulsatil LH salgılanmasını algılamaya yeterli işleme iklimlendirme ile fareler için bir iletişim kuralı. Geçerli protokol LH sağlam ve sürekli darbeleri değerlendirilmesi üzerinde birden fazla saat izin veren bir genişletilmiş iklimlendirme dönemi ayrıntıları. Bu iletişim kuralı, kuyruk ucu kırpılır ve kan el bir pipet kullanarak kuyruk toplanır. Gonadectomized farelerde pulsatil LH değerlendirmesi için seri örneklerdir önemlisi, her 5-6 min 90-180 dakika süreyle toplanan kan toplanması ve LH sağlam darbeleri ölçülmesi yeterli işleme verilen uyanık, özgürce davranmaya farelerde başarılı İklimlendirme ve çevre stresler en aza indirmek için çaba. Yeterli iklimlendirme kan toplama önce 4-5 hafta içinde elde edilebilir. Bu iletişim kuralı tam kan örnekleri pulsatil LH salgılanmasını desenleri değerlendirmesi Mouse, nöroendokrin araştırma için güçlü bir hayvan modeli birden çok saat üzerinde toplama sağlamak için metodoloji gelişmeler vurgulamaktadır.

Giriş

Erbezi işlevi memelilerde gonadotropin salgısını, luteinizan hormon (LH) ve folikül uyarıcı hormon, hipofiz bezi üzerine bağlıdır. Gonadotropins yanıt-e doğru hipotalamik gonadotropin - releasing hormon (GnRH) salgılanmasını pulsatil veya akım desende salgılanan. Sentez ve LH ve FSH salgılanmasını molekülleri hipotalamik GnRH, gonad steroid hormonlar ve aktivin-inhibin-follistatin sisteminin yanı sıra çok sayıda dahil olmak üzere çeşitli endokrin, parakrin ve otokrin eylem ile düzenlenmektedir stres ve enerji dengesi dahil olmak üzere fizyolojik koşullar. ²

LH pulsatil desen kan yaklaşık üstel eleme tarafından takip periferik kana LH oldukça ani bir deşarj doğar. Önemli her LH deşarj frekans ve genlik LH yanıtının Özellikler desen, ikisi de, kısmen, GnRH. son sürüme hipofiz hipotalamik portal kan ölçümü için toplama zorluk tarafından dikte pulsatil GnRH, örnekleme ve LH ölçümü bir proxy olarak hipofiz gonad hipotalamik eksen GnRH düzenlenmesi için kullanılır. Bu nedenle, önemli bilgileri tek bir örnek belirlenemiyor LH bakliyat genliği ve sıklığı kodlanmış olduğunu.

Pulsatil LH salgılanmasını Analizi tarihsel olarak büyük kan hacmi ve sık sık kan örnek koleksiyon için tolerans nedeniyle büyük memeliler (insan, primatlar ve koyun) için sınırlı olmuştur. Kemirgenler, sık sık kan örnekleme fare sınırlıydı ve atriyal kateter kalıcı yolu ile elde. ^{3 , 4} nispeten düşük maliyet ve genetik kullanılabilirliği (Örneğin cre-lox, CRISPR) ve karmaşık sinir devresi (Örneğin optogenetics, chemogenetics) manipülasyon yapmak fareler bir çekici model organizma; Ancak, sık sık kan örnekleri kazanma ve LH konsantrasyonu daha sonraki analiz kadar son zamanlarda, zor olduğu kanıtlandı. Bu anıtsal görev Steyn ve iş arkadaşları tarafından öncülük. ¹ beri o zaman, birkaç labs sık kan örnekleme ve pulsatil LH salgılanmasını deneysel paradigmalar çeşitli değerlendirmek için Ultra-duyarlı LH deneyleri kullanmaya başladı. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} bu fareler birden fazla kan örnekleri toplama pratik bir yöntem takip için en az 40 yıl¹⁰ yol boyunca yapılan birden fazla iyileştirmeler ile sürdürülen olmuştur belirtilmelidir. ^{11 , 12}

Değerlendirmesi LH darbe desenleri (yani frekans ve genlik), bazal gonadotropin salgısını genetik olarak uysal bu hayvan modelinde izlenmesinde önemli bir arıtma gösterir. Geleneksel olarak, LH konsantrasyonu farelerde tek kan örneği belirlenmiştir. LH konsantrasyonu doğal olarak her darbe sırasında dalgalanıyor çünkü tek nokta örneklerinin bir zayıflık bir son derece değişken veri kümesidir. İzole ölçümleri doğal olarak kritik bilgi LH darbe salgı desenleri tarafından aktarılmaktadır özledim başka bir zayıflıktır. Böylece, özgürce davranmaya içinde sık sık kan örnekleri toplamak için bir yöntemi (dışında nazik işleme sırasında örnekleme) sınırsız fareler gelişmiş bilgi sağlamak ve pulsatil hormon düzenleme araştıran birçok laboratuvarlar için yararlı.

Burada, biz sık topluluğu için bir iletişim kuralı tanımlamak (her 6 dk) kan örnekleri uyanık, yasayı, fareler. Önemlisi, biz bir işleme dahil hangi öncesi ve sonrası değerlendirme akut bir meydan okuma için bir süre kararlı, tam kan örneklerinde pulsatil LH salgılanmasını sağlam ve sürekli tespiti üzerine toplanan için izin veren iklimlendirme Protokolü psiko-sosyal stres immobilizasyon ve kısıtlama yanıt gibi. Etkili bir tahlil LH konsantrasyonu tam kan örneklerinden için daha önce açıklanan; ¹ bu protokolü LH nabız ölçümü için kan örnekleri toplamak için bir yöntemi üzerinde duruldu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Burada açıklanan yöntemi ulusal kurumları sağlık hayvan bakım ve kullanım yönergeleri ile anlaşma ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi San Diego Kaliforniya Üniversitesi tarafından yetkili olmamıştır.

1. İklimlendirme işleme için

1. İşlemi ele
   1. Yer fare Biyogüvenlik kabini kafesleri. Birinci fare kafesi ve Biyogüvenlik kabini içinde (Örneğin bir temiz kafes kapak) uygun bir yüzey üzerinde yer kaldırın.
   2. Yavaşça çalışma yüzeyinin üzerinde fareyi bir elin başparmak ve işaret parmağı ile kuyruk tabanı tutarak dizginlemek. O zaman, diğer elin başparmak ve işaret parmağı ile kuyruk ucuna tabanından kuyruk ventral yüzeyinde sıkıca inme. Bu 6 kez okşayarak tekrar (yani 1 set) ve fare için onun kafes.
   3. 6 dk bekleyin ve 1.1.2 arasındaki adımları yineleyin.
      Not: böylece her fare işleme her gün yapılan toplam 24 kuyruk vuruşları alacaksınız toplam olarak, adım 1.1.2 4 kez (yani 4 Set 6 vuruş), fare yinelenir.
2. Günlük kullanım sıklığı
   1. Beşten önce planlanan kan toplama günü iki hafta kadar fareler adım 1.1, beş gün haftada (fareler Cumartesi veya Pazar iklimlendirme son iki hafta kadar işlenmez) açıklandığı gibi işlemek.
   2. Deneysel tedavi örnekleme süresi boyunca herhangi bir ek işleme (Örneğin scruffing veya mayi enjeksiyon) eklerseniz, fareler için bu işleme etkinliği her işleme oturumu sırasında parkenizin.
      Not: enjeksiyon yordamlarına iklimlendirme için sahte enjeksiyon gerçekleştirmek için körelmenin bir iğne kullanın.
   3. Planlanan kan toplama gün önce iki hafta boyunca, haftada yedi gün 1. 1 ', açıklandığı gibi fareler başa.
   4. En az iki hafta önce planlanan kan toplama günü fare örnekleme sırasında fareler kesintileri en aza indirmek için çiftler halinde ev.

2. kan toplama boru hazırlanması

1. Vericiyi LH tahlil arabellekte bir cam şişe hazırlayın: %0,2 sığır serum albümin ve % 0.05 Ara-20 PBS [0.2 g KCl, 8 g NaCl, 1.44 g Na₂HPO₄ (susuz), 0,24 g KH₂PO₄, 1 L, pH 7.4, filtre ve basınçlı kap Ultrasaf Su] , mağaza 4 ° C'de ¹
   Not: hazırlanacak NEMS LH tahlil arabellek hacmi tabanlı örnekleri ve (2.2 & tartışma) aşağıda belirtildiği şekilde örnek başına birim sayısı hesaplanabilir
2. Kan toplama tüpler (0,6 mL microcentrifuge tüpler) hazırlayın. Etiket tüpleri ve aliquot tahlil arabellek (57 µL tampon tüp; başına dikkat edin, bu birimin toplanan kan kan hacmi veya istenen arabelleğine kan oranı bağlı olarak farklı olabilir). Tüpler örnekleme öncesinde gün hazır olun, 4 ° C'de depolayın

3. kan toplama

1. Kan toplama malzemeleri hazırlanması.
   1. Biyogüvenlik kabini kullanıma hazırlamak ve başlık veya bir sepeti aşağıdaki belgeleri düzenlemek: 10 µL (3 µL veya istenen kan toplama hacmi ayarlı), pipet ipuçları pipet, atık kutusu için kullanılan pipet ipuçları, Zamanlayıcı, çıktının hayvan sayıları ve örnek numaraları () ile örnekleme veya hayvan sorunları ile ilgili notlar için) kova kan toplama tüpler, makas ve küçük gazlı bez (2 "x 2") ile buz.
      Çünkü fareler rahatsız bir sesli alarm yok Not: "say" işlev laboratuvar zamanlayıcıyla yararlıdır
   2. Örnekleme sırasında doğru fare hızlı kimlik ile yardımcı olmak için her fare işaretçisini (temel) kuyruğunu işaretlemek için kalıcı bir kalem kullanın.
2. Kuyruk ve öncesi kan toplama hazırlanması kırpma.
   1. 45 dk kan toplama başlamadan önce ilk fare kendi kafesinden çıkarmak ve yüzeyinde (temiz kafes kapak iyi çalışıyor) bir uygun Biyogüvenlik içinde kabine yerleştirin.
   2. 1-2 mm aseptik hazırlık takip fare kuyruk ucu kaldırmak için keskin, steril makas kullanın (yani alkol ve betadin ile fırçalayın).
      Not: Bu uyanık hayvanlarda nazik kısıtlama veya isoflurane anestezi altında yapılabilir.  Ayrıca, analjezi yerel IACUC tavsiyesi takip sağlanabilir.
   3. Dikkatle fare kuyruğu yukarıda açıklandığı gibi inme (1.1.2; 1-2 vuruş genellikle yeterlidir) damlacık kan formları kuyruk ucuna kadar.
   4. Bir pipet temiz bir ucu ile kuyruk uç--dan 3 µL kan toplamak ve kan pipet ucuyla atmak için kullanın.
   5. Fareyi onun kafes için göndermeden önce kan akışını durdurdu emin olun. Gerekirse, steril gazlı bezle hafif basınç uygulayın.
   6. 3.2.1 - 3.2.5 tüm fareler için yineleyin. Sonraki kan örnekleri fare kuyruk kuyruk ucu kan formları bir damlacık kadar sıkıca okşayarak tarafından toplanabilir.
      Not: Eğer kan damlacık sonra sert vuruş oluşturmak değil, kuyruk salin batırılmış bir gazlı bez pad ile sildi. Pıhtı forma daha büyük olasılıkla daha az sıklıkla örnekleme sırasında (yani > 15 dk aralıklarla). Pıhtı damar temizlenir sonra örnekleme devam edebilirsiniz.
   7. Bu ön kan toplama hazırlık döneminde her 6 dakikada yaklaşık 45 dakika için yukarıda açıklandığı gibi her fare üzerinden 3 µL kan toplamaya devam. Kan ve Pipet Ucu atın.
3. Kan örnekleme
   1. Yukarıda açıklandığı gibi kuyruk ucu 3 µL kan toplamak. Tüm 3 µL örnek pipet ucu (olmadan kabarcıklar veya yatak kirlenme) içine alınır emin olmak için dikkatli. Etiketli bir tüp tahlil arabellekte içine kan örneği çıkarma. INVERSION tarafından mix ve buz için tüp dönmek.
   2. Fareyi onun kafes için göndermeden önce kan akışını durdurdu emin olun. Gerekirse, steril gazlı bezle hafif basınç uygulayın.
   3. 3.3.1 - 3.3.2 için her fare, her 6 dk önceden belirlenmiş örnekleme süresi için yineleyin. Her hayvan için sıkıntı (örneğin kısmen kapalı göz kapakları, kambur konum [başka bir tedavi tarafından neden olduğu değil] veya işleme yanıt eksikliği) belirtileri izlemek ve örnekleme, sonlandırmak.
      Not: Davranış sıkıntı veya örnekleme sona ermesi gerektiren başka komplikasyonlara yol son derece seyrek bizim laboratuvar olarak ortaya çıkar.
   4. Hayvan are değil euthanized kan örnekleme takip, kuyruk ucundan kan akımı tamamen durdurdu emin. Her hayvanın kafes (veya değişiklik kafesleri) içinden dökülmüş kan silin ve hayvan kafesleri konut raf dönün.

4. örnek işleme ve analiz

1. -20 ° C'de kan örnekleri analiz kadar saklayın.
   Not: Tam kan örneklerinde tahlil arabellekte seyreltilmiş LH denetlesinler; hiçbir ayrım sera veya plazma depolama veya analiz önce gereklidir.
2. Tahlil kan örnekleri vericiyi ELISA tarafından daha önce¹ ve rapor değerleri ng/ml tam kan tahlil arabellekte örnek hacminin seyreltme için düzeltme aşağıdaki açıklanan.
3. LH bakliyat veri kümesi tanımlayın. Hesaplamak ve kötü darbe genlik ve darbe frekansını (arası nabız aralığı) gerektiği veya veri kümesi için karşılaştırın.
   Not: Yayımlanmış ölçüt^13,14 ve programları, LH darbeleri tespit için^15,16 bulunmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Temsilcisi LH darbe 4 fareler desenlerini Şekil 1 ' de (veri Yang vd., 2017 yeniden basıldı) gösterilir. LH bir akut psiko-sosyal stres sınama yanıt belirlemek için sık sık kan örneklerinde ölçüldü. Yetişkin kadın C57/Bl6 fareler Ovariektomili ve bu iletişim kuralı için sık sık kan toplama içinde ayrıntılı olarak ele alınır. Kan örnekleri ilk 90 dk LH pulsatil salgı bir ön arıtma temel kurmak için tüm hayvanlar için ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada tarif biz pulsatil LH salgılanmasını farelerde değerlendirilmesi için tam kan kuyruk ucu örnekleri sık sık kan toplanması için bir iletişim kuralı. Bu iletişim kuralı örnekleri akut değişiklikler psikososyal stres maruz takip pulsatil LH salgılanmasını algılanması için toplama sağlar ve LH darbeleri altında diğer akut veya kronik manipülasyonlar değerlendirilmesi için uygundur.

Yükleme-boşaltma kritik bileşenidir LH bakliyat güvenilir ve sağlam profille...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosaftey cabinet	Lab Products Inc	L/F-B
Bovine serum albumin	Sigma	A5403
Tween-20	Sigma	P2287
KCl	Sigma	P9333
NaCl	Sigma	S7653
Na2HPO4 (anhydrous)	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P5655
Ultrapure water	Millipore		Purified and filtered water
Broome Rodent Restraint Device	Harvard Apparatus	52-0460	Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.
DynPeak	n/a	n/a	http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001